Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định 5 hydroxymethylfurfural trong thuốc, nước ngọt bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TÀO THỊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 5-HYDROXYMETHYLFURFURAL TRONG THUỐC, NƯỚC NGỌT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ - KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TÀO THỊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 5-HYDROXYMETHYLFURFURAL TRONG THUỐC, NƯỚC NGỌT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ - KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ : 60720410 Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Công Sáu PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà HÀ NỘI 2016 LỜI CÁM ƠN Hoàn thành luận văn nhận giúp đỡ, hỗ trợ nhiệt tình có hiệu nhiều cá nhân tập thể, thầy cô giáo, bạn đồng nghiệp xa gần Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà - Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội TS Vũ Công Sáu - Viện Khoa học hình - Bộ Công an người thầy hướng dẫn, tận tình bảo suốt trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, thầy giáo, cô giáo Bộ môn Hóa phân tích độc chất môn khác trường Đại học Dược Hà Nội tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian học tập Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo cán Phòng Hóa lý, cán Trung tâm Giám Định Ma Túy - Viện Khoa học hình - Bộ Công an giúp đỡ trình thực nghiệm Nhân dịp này, xin gửi lời cám ơn tới TS Nguyễn Xuân Trường - Giám đốc Trung tâm Giám Định Ma Túy, Thầy tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Tôi ghi nhớ đến giúp đỡ, chia sẻ vật chất tinh thần thành viên gia đình, bạn bè tôi, nguồn động lực mạnh mẽ, niềm khích lệ to lớn giúp yên tâm học tập, nghiên cứu Trân trọng cảm ơn! DS Tào Thị Phương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan 5-HMF 1.1.1 Cấu trúc công thức cấu tạo 1.1.2 Tính chất vật lý 1.1.3 Tính chất hoá học 1.1.4 Điều chế 1.1.5 Quá trình chuyển hoá độc tính 5-HMF 1.1.6 Một số phương pháp định lượng 5-HMF 1.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ 13 1.2.1 Đại cương sắc ký khí 13 1.2.2 Detector khối phổ 15 1.2.3 Một số thông số đặc trưng 17 1.2.4 Ứng dụng sắc ký khí khối phổ 18 2.4.1 Phân tích định tính 18 1.2.4.2 Phân tích định lượng 18 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Hoá chất thiết bị 19 2.2.1 Hoá chất, dung môi 19 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Lấy mẫu xử lý mẫu 20 2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích 20 2.3.3 Thẩm định phương pháp định lượng 5-HMF thuốc, nước GC-MS 21 2.3.4 Bước đầu áp dụng phương pháp khảo sát số mẫu thực tế 23 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 24 Chương KẾT QUẢ 25 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 25 3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 25 3.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký khí khối phổ 25 3.2 Thẩm định phương pháp định lượng 5-HMF thuốc, nước GC-MS 34 3.2.1 Tính phù hợp hệ thống 34 3.2.2 Khảo sát tính chọn lọc, đặc hiệu 34 3.2.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 36 3.2.4 Khoảng nồng độ tuyến tính 36 3.2.3 Độ độ xác 38 3.3 Bước đầu ứng dụng phương pháp khảo sát số mẫu 40 Chương BÀN LUẬN 44 4.1 Về phương pháp GC-MS 44 4.2 Về quy trình phân tích 45 4.3 Về thẩm định phương pháp 45 4.4 Ứng dụng phương pháp phân tích 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 5-HMF ACN AOAC AF C CAFAM CI CTNĐ Dd EI FA FDCA GC HMFA HMFG HPLC IS LC LD50 LOD LOQ MeOH MS NN RSD S SD SK SMF SULT1A1 TCVN TLTK TPCN TR : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 5-Hydroxymethylfurfural Giá trị trung bình Acetonitril Hiệp hội nhà Hóa phân tích Hệ số bất đối Nồng độ (5-Carboxylic acid-2-furoyl) amino methan Ion hóa hóa học Chương trình nhiệt độ Dung dịch Ion hóa sở va đập điện tử Acid furoic Acid 2,5- furandicarboxylic Sắc ký khí Acid 5-hydroxymethyl-2-furanoic N-(5-hydroxymethyl-2-furoyl)glycine Sắc ký lỏng hiệu cao Chất chuẩn nội Sắc ký lỏng Nồng độ ức chế 50% Giới hạn phát Giới hạn định lượng Methanol Khối phổ Nước Độ lệch chuẩn tương đối Diện tích pic Độ lệch chuẩn Sắc ký 5-Sulfoxymethylfurfural Sulfotransferase Tiêu chuẩn Việt Nam Tài liệu tham khảo Thực phẩm chức Thời gian lưu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số nghiên cứu phương pháp đo quang Bảng 1.2: Một số nghiên cứu phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Bảng 1.3: Một số nghiên cứu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Bảng 1.4: Một số nghiên cứu phương pháp sắc ký khí khối phổ 11 Bảng 3.1: Kết khảo sát mức lượng va chạm 26 Bảng 3.2: Sắc ký đồ theo chương trình nhiệt độ 28 Bảng 3.3: Kết khảo sát theo chương trình nhiệt độ 29 Bảng 3.4: Sắc ký đồ chương trình có nhiệt độ ban đầu khác 30 Bảng 3.5: Kết khảo sát nhiệt độ ban đầu 31 Bảng 3.6: Sắc ký đồ với tốc độ khí khác 32 Bảng 3.7: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống 34 Bảng 3.8: Kết S/N mẫu trắng thêm chuẩn 36 Bảng 3.9: Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 37 Bảng 3.10: Kết khảo sát độ đúng, độ xác 38 Bảng 3.11: Kết khảo sát số mẫu thực tế 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo 5-HMF …………………………………………… Hình 1.2: Phản ứng tổng hợp 5-HMF từ đường …………………………………… Hình 1.3: Quá trình chuyển hoá 5-HMF ……………………………………… Hình 1.4: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí …………………………………………………… 14 Hình 1.5: Detector khối phổ …………………………………………………………… 15 Hình 3.1: Hình ảnh phổ khối 5-HMF …………………………………………… 25 Hình 3.2: Cường độ tín hiệu ion 97, 126 với lượng va chạm - 4V 27 Hình 3.3: Phổ khối với lượng va chạm V ……………… .…… 27 Hình 3.4: Kết khảo sát tốc độ khí mang ……………………………………… 33 Hình 3.5: Sắc ký đồ mẫu thử với tốc độ khí 1,0 ml/phút ………………… 33 Hình 3.6: Kết khảo sát tính chọn lọc, đặc hiệu ……………………………… 35 Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn nồng độ µg/ml …………… 36 Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ diện tích pic ……… 37 Hình 3.9: Kết phân tích 5-HMF mẫu thực tế ………………………… 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong tiêu chuẩn chất lượng thuốc, tiêu chí tạp chất liên quan biểu tính an toàn thuốc vấn đề khó, đòi hỏi đầu tư nghiên cứu ngành kiểm nghiệm Bên cạnh đó, thực phẩm, vấn đề an toàn vệ sinh vấn nạn đòi hỏi ngành kiểm nghiệm tìm phương pháp kiểm tra Trong năm gần đây, nghiên cứu 5-HMF ngày thu hút quan tâm ý nhiều nhà khoa học Đây sản phẩm chuyển hóa đường, có mặt nhiều loại sản phẩm Các nghiên cứu cho thấy 5-HMF có khả gây kích thích đường hô hấp, da niêm mạc [9], có khả thúc đẩy khả hình thành phát triển khối u [7] Hơn nữa, sản phẩm chuyển hoá 5-HMF 5cloromethylfurfural, 5-sulfoxymethylfurfural có khả gây đột biến ung thư (như ung thư đại tràng, ung thư gan, ung thư da) [31] Năm 2012, Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng Việt Nam ban hành tiêu chuẩn TCVN-9042:2012 xác định hàm lượng 5-HMF phương pháp quang phổ có sử dụng thuốc thử p-toluidin [3] Trong chuyên luận glucose dược điển Việt Nam IV [2] đưa phương pháp xác định giới hạn 5-HMF phương pháp đo quang Tuy nhiên, phương pháp lại không đặc hiệu, bị ảnh hưởng chất mẫu, làm ảnh hưởng tới kết phân tích Chính cần phải có phương pháp có độ nhạy tính chọn lọc cao để xác định 5-HMF chế phẩm Trong đó, máy sắc ký khí kết nối detector khối phổ đời làm tăng cao khả phân tích tạp chất Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định 5-hydroxymethylfurfural thuốc, nước phương pháp sắc ký khí - khối phổ” với mục tiêu sau: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hoá phân tích II, NXB Y học, Hà Nội, tr 107166 Dược điển Việt Nam (2009), Dược điển Việt Nam IV TCVN 9041:2012, ISO 7466:1986, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế Phạm Hùng Việt (2005), Sắc ký khí sở lý thuyết khả ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Tiếng Anh Abraham K et al (2011), “Toxicology and risk assessment of 5- Hydroxymethylfurfural in food”, Mol.Nutr.Food Res., 55, pp.667-678 AOAC International (2012), AOAC official methods of analysis, Appendix K: Guidelines for dietary supplements and botanicals, Part I: AOAC Guidelines for single laboratory validation of chemical methods for dietary supplements and botanicals Archer C et al (1992), “Aberrant Crypt Foci and Microadenoma As Markers for Colon Cancer”, Environmental Health Perspectives, 98, pp 195197 Ariffin A.A., Ghazali H.M., Kavousi P (2014), “Validation of a HPLC method for determination of hydroxymethylfurfural in crude palm oil”, Food chemistry, 154, pp 102-107 Capuano E., Fogliano V (2011), “Acrylamide and 5hydroxymethylfurfural (HMF): A review on metabolism, toxicity, occurrence in food and mitigation strategies”, LWT-Food Science and Technology, 44, pp 793-810 10 Faculdade de Farmáasci universidade porto, Furanic compounds in food products: assessment and mitigation strategies, pp 42 11 Fallico B et al (2004), “Effects of conditioning on HMF content in unifloral honeys”, Food Chemistry, 85, pp 305-313 50 12 Gaspar M.S.M Lucena F.F (2009), “Improved HPLC methodology for food control–furfurals and patulin as markers of quality”, Food Chemistry, 114, pp 1576–1582 13 Gaspar M.S.M and Lopes J.F (2009), “Simple chromatographic method for furfural analysis”, 1216, pp.2762-2767 gas 14 Gokmen Vural et al (2006), “Rapid Determination of Hydroxymethylfurfural in Foods Using Liquid Chromatography - Mass Spectrometry”, Food Industry, pp 1-6 15 Haworth W.N and Jones W.G (1944), “The conversion of sucrose into furan compounds Part I: 5-hydroxymethylfurfuraldehyde and some derivatives”, Journal of the Chemical Society, pp 667-670 16 ICH (2005), Validation of analytical procedures: Text and Methodology Q2(R) 17 Kowalski S et al (2013), “Dynamics of 5-Hydroxymethylfurfural Formation in Shortbreads during Thermal Processing”, Czech J Food Sci., 31 (1), pp 33-42 18 Kumar R et al (2015), “Pulsed electric field and combination processing of mango nectar: effect an volatile compounds and HMF formation”, Croat J Food Sci Technol , (2) 19 Kuster F.M and Temmink M.G (1977), “The influence of pH and weak-acid anions on the dehydration of D-fructose”, Carbohydrate Research, 54 (1977), pp 185-191 20 Leblanc B.W et al (2009), “Formation of Hydroxymethylfurfural in Domestic High-fructose Corn Syrup and Its Toxicity to the Honey Bee (Apis mellifera)”, Journal of agricultural and food chemistry, 57, pp 7369-7376 21 Lewkowski J (2001), “Synthesis, chemistry and applications of 5hydroxymethylfurfural and its derivatives”, General Papers ARKIVOC, pp 17-54 22 Locas C P and Yaylayan V A (2008), “Isotope Labeling Studies on the Formation of 5-(Hydroxymethyl)-2-furaldehyde (HMF) from Sucrose 51 by Pyrolysis-GC/MS”, Journal of agricultural and food chemistry, 56, pp 6717-6723 23 Makawi S Z A et al (2009), “Identification and quantification of 5-Hydroxymethyl furfural HMF in some sugar-containing food products by HPLC”, Pakistan Journal of Nutrition, (9), pp 1391-1396 24 Murkovic M and Pichler N (2006), “Analysis of 5hydroxymethylfurfural in coffee, dried fruits and urine”, Mol Nutr Food Res., 50, pp.842-846 25 Nafea A., Moselhy A., Fawzy M (2011), “Does the HMF value affect the Antibacterial activity of the Bee Honey?”, Egypt Acad J biolog Sci., (1),pp 13-19 26 National toxicology program (2010), “Toxicology carcinogenesis Studies of 5-(hydroxymethyl)-2-furfural” and 27 Omari K.W et al (2012), “Hydrolysis of chitosan to yield levulinic acid and 5-hydroxymethylfurfural in water under microwave irradiation”, The Royal Society of Chemistry, pp.1-7 28 Petisca C et al (2014), “Assessment of hydroxymethylfurfural and furfural in commercial bakery products”, Journal of Food Composition and Analysis, 33, pp 20-25 29 Prepared for NCI by Technical Resources International, Inc under Contract No NO1-CP-56019 (12/94), 5-(Hydroxymethyl)-2-furfural, CAS NO 67-47-0 30 Senila L et al (2012), "Development of a GC-MS Method for 5hydroxymethylfurfural Determination in Wood after Steam- explosion Pretreament", REV CHIM , 63 9(6), pp 557-561 31 Svendsen C et al (2009), “5-Hydroxymethylfurfural and 5Sulfooxymethylfurfural Increase Adenoma and Flat ACF Number in the Intestine of Min/+ Mice”, Anticancer research, 29, pp 1921-1926 32 Teixido E et al (2006), "Analysis of 5-hydroxymethylfurfural in foods by gas chromatography - mass spectrometry", Journal of chromatography A, 1135, pp 85-90 52 33 Toker O.S et al (2013), “Optimization of the content of 5hydroxymethylfurfural (HMF) formed in some molasses types: HPLCDAD analysis to determine effect of different storage time and temperature levels”, Industrial Crops and Products, 50, pp 137-144 34 Ulbricht J et al (1984), “A Review of 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) in Parenteral Solutions”, Fundamental and applied toxicology, 4, pp 843-853 35 Vorlova L et al (2006), “Hydroxymethylfurfural contents in foodstuffs determined by HPLC method”, Journal of Food and Nutrition Research, 45 (1), pp 34-36 36 Windsor S., Kavazos K., Brooks P (2013), “The quantitation of hydroxymethylfurfural in Australian Leptospermum honeys”, Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, 5(1), pp 21-25 37 Zhang J., Cao Y., Li H., Ma X (2014), “Kinetic studies on chromium-catalyzed conversion of glucose into 5-hydroxymethylfurfural in alkylimidazolium chloride ionic liquid”, Chemical Engineering Journal , 237, pp 55-61 38 Zhang Yu-Yu et al (2012), “Effects of sugars in batter formula and baking conditions on 5-hydroxymethylfurfural and furfural formation in sponge cake models”, Food Research International, 49, pp 439-445 53 DANH MỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Chứng chất phân tích chuẩn Chuẩn 5-(hydroxymethyl)furfural PHỤ LỤC B: Tiêu chí đánh giá Bảng B1: Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) Bảng B2: Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) PHỤ LỤC C: Một số sắc ký đồ mẫu chuẩn Lần Lần Hình C.1: Khảo sát tính phù hợp hệ thống Nồng độ 600 µg/ml Nồng độ 400 µg/ml Hình C.2: Khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ 600 µg/ml 400 µg/ml Nồng độ 350 µg/ml Nồng độ 300 µg/ml Hình C.3: Khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ 350 µg/ml 300 µg/ml Nồng độ 250 µg/ml Nồng độ 200 µg/ml Hình C.4: Khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ 250 µg/ml 200 µg/ml Lần Lần Hình C.5: Khảo sát độ đúng, độ xác nồng độ 360 µg/ml Lần Lần Hình C.6: Khảo sát độ đúng, độ xác nồng độ 450 µg/ml Lần Lần Hình C.7: Khảo sát độ đúng, độ xác nồng độ 540 µg/ml PHỤ LỤC D: Một số sắc ký đồ mẫu thử (a) tháng (b) Sau tháng Hình D.1: Sắc ký đồ mẫu TPCN2 (a) tháng (b) Sau tháng Hình D.2: Sắc ký đồ mẫu TPCN3 (a) tháng (b) Sau tháng Hình D.3: Sắc ký đồ mẫu TPCN4 (a) tháng (b) Sau tháng Hình D.4: Sắc ký đồ mẫu NN1 (a) tháng (b) Sau tháng Hình D.5: Sắc ký đồ mẫu NN3 (a) tháng (b) Sau tháng Hình D.6: Sắc ký đồ mẫu NN4 (b) Sau tháng (a) tháng Hình D.7: Sắc ký đồ mẫu NN5 (a) tháng (b) Sau tháng Hình D.8: Sắc ký đồ mẫu NN6 (a) tháng (b) Sau tháng Hình D.9: Sắc ký đồ mẫu NN7 (a) tháng (b) Sau tháng Hình D.10: Sắc ký đồ mẫu NN8 (a) tháng (b) Sau tháng Hình D.11: Sắc ký đồ mẫu NN9 (a) tháng (b) Sau tháng Hình D.12: Sắc ký đồ mẫu NN10 PHỤ LỤC E: THÔNG TIN CÁC MẪU STT Tên mẫu Dạng Số lô Ngày sản xuất Hạn dùng bào chế T1 154417741 26/10/2015 25/10/2018 Dung dịch T2 15009SN 03/09/2015 03/09/2017 Dung dịch T3 130415 13/04/2015 08/04/2018 Dung dịch T4 030715 09/07/2015 09/07/2018 Dung dịch NN1 0517 15/09/2015 15/09/2016 Dung dịch NN2 0950C2N 02/11/2015 02/11/2016 Dung dịch NN3 12247 09/10/2015 09/10/2016 Dung dịch NN4 A1733A 04/11/2015 04/05/2016 Dung dịch NN5 428NJ5 03/11/2015 03/05/2016 Dung dịch 10 NN6 A21512 25/11/2015 25/05/2016 Dung dịch 11 NN7 12:12 27/08/2015 27/05/2016 Dung dịch 12 NN8 A0035C 29/09/2015 29/03/2016 Dung dịch 13 NN9 A0134C 03/11/2015 08/05/2016 Dung dịch 14 NN10 H3 24/05/2015 24/05/2016 Dung dịch 15 NN11 1B44 11/10/2015 11/10/2016 Dung dịch 16 NN12 C5W03B 21/12/2015 20/06/2016 Dung dịch 17 NN13 02:09 04/08/2015 04/05/2016 Dung dịch 18 NN14 A2151B 25/11/2015 25/05/2016 Dung dịch 19 NN15 A0720A 16/12/2015 16/06/2016 Dung dịch 20 NN16 05W47B 20/10/2015 19/04/2016 Dung dịch 21 NN17 A6:44 14/08/2015 14/05/2016 Dung dịch 22 NN18 A1428F 29/10/2015 29/04/2016 Dung dịch 23 TPCN1 01 25/01/2015 25/01/2017 Dung dịch 24 TPCN2 01 01/06/2015 01/06/2017 Dung dịch 25 TPCN3 0115 05/01/2015 05/01/2018 Dung dịch 26 TPCN4 15299 07/08/2015 06/08/2017 Dung dịch 27 TPCN5 161115 21/11/2015 21/11/2018 Dung dịch 28 TPCN6 017/15 07/07/2015 06/07/2018 Dung dịch