Khảo sát một số tác dụng dược lý của các cao chiết và saponin chiết từ thân rễ cây cát lồi (costus speciosus)

Từ các nghiên cứu trên và nhằm mở rộng nguồn phytoestrogen ở Việt Nam chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát một số tác dụng dược lý của các cao chiết và saponin chiết từ thân r

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HUỲNH NHÃ VÂN

CÁC CAO CHIẾT VÀ SAPONIN CHIẾT TỪ

THÂN RỄ CÂY CÁT LỒI (Costus speciosus)

Chuyên ngành: SHTN (Hướng SLĐV)

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS Nguyễn Thị Thu Hương

Tp HCM, Tháng 9 – 2012

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Thị Thu Hương đã tạo điều kiện

và tận tình hướng dẫn, gợi mở cho em nhiều kiến thức trong suốt thời gian thực hiện

Cảm ơn những người bạn thân thiết đã động viên, giúp đỡ tôi vượt qua khókhăn

Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện, ủng hộ contrên con đường học vấn

Tp HCM, ngày 13 tháng 9 năm 2012

Ký tên

Huỳnh Nhã Vân

Huỳnh Nhã Vân

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ ix

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1 1.1 Giới thiệu về Cát lồi 1

1.1.1 Phân loại – mô tả 1

1.1.2 Phân bố - sinh thái 1

1.1.3 Thành phần hóa học và các hợp chất trong thân rễ Cát lồi 2

1.1.4 Tính vị - công dụng theo y học cổ truyền 3

1.1.5 Tác dụng của Cát lồi trên thực nghiệm 4

1.1.6 Tác dụng kiểu estrogen của Cát lồi 4

1.1.7 Tác dụng giảm đường huyết của Cát lồi 5

1.2 Estrogen 5

1.2.1 Giới thiệu 5

1.2.2 Sự điều hòa hormone thông qua trục H-P-G 6

1.2.2.1 Sự điều hòa hormone trong chu kỳ kinh nguyệt 6

1.2.2.2 Sự điều hòa hormone trong dậy thì 7

1.2.3 Cơ chế hoạt động của estrogen 8

1.2.3.1 Cơ chế hoạt động ở mức độ phân tử 8

1.2.3.2 Các loại thụ thể estrogen 9

1.2.4 Một số tác dụng của estrogen 10

1.2.4.1 Tác dụng của estrogen trên tử cung 10

1.2.4.2 Tác dụng của estrogen trên sự cân bằng glucose 12

1.2.4.3 Tác dụng của estrogen trên các quá trình chuyển hóa khác 12

1.2.4.4 Tác dụng kháng oxy hóa của estrogen 13

1.2.5 Thiếu hụt estrogen trong mãn kinh 13

1.2.5.1 Định nghĩa mãn kinh 13

1.2.5.2 Estrogen – Progesterone ở thời kỳ mãn kinh 14

1.2.5.3 Hậu quả của mãn kinh 15

1.2.5.4 Liệu pháp hormone thay thế 16

1.3 Phytoestrogen 16

1.3.1 Giới thiệu 16

1.3.2 Cơ chế hoạt động của phytoestrogen 17

1.3.3 Một số tác động của phytoestrogen 18

1.3.3.1 Phytoestrogen và ER 18

1.3.3.2 Phytoestrogen và sự sinh tổng hợp steroid 19

1.3.3.3 Phytoestrogen và sự tăng trưởng- tăng sinh tế bào 20

1.3.3.4 Phytoestrogen và đái tháo đường 20

1.3.4 Diosgenin 21

1.3.5 Các phương pháp đánh giá tác dụng estrogen của phytoestrogen 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 Nguyên liệu và phương pháp chiết xuất 24

2.2 Đối tượng nghiên cứu 24

2.3 Thiết bị - hóa chất 25

2.3.1 Thiết bị 25

2.3.2 Hóa chất 25

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1 Thử tinh khiết 26

2.4.1.1 Xác định độ ẩm trong dược liệu 26

2.4.1.2 Xác định độ tro 27

2.4.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 28

2.4.3 Định lượng saponin bằng phương pháp cân 29

2.4.4 Định lượng diosgenin trong dược liệu bằng HPLC-MS 30

2.4.5 Khảo sát độc tính cấp diễn đường uống và liều cho uống 31

2.4.6 Phương pháp gây mô hình giảm năng sinh dục 32

2.4.7 Khảo sát tác dụng kiểu estrogen 32

2.4.7.1 Phương pháp khảo sát chu kỳ động dục đầu tiên ở chuột non 33

2.4.7.2 Phương pháp khảo sát chu kỳ động dục 34

2.4.7.3 Phương pháp khảo sát trọng lượng tử cung (phương pháp Atswood) 35 2.4.7.4 Khảo sát nồng độ 17β-estradiol sử dụng kỹ thuật ELISA cạnh tranh 36 2.4.7.5 Khảo sát thể trọng chuột 38

2.4.8 Khảo sát tác dụng giảm đường huyết 38

2.5 Phân tích thống kê 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 41

3.1 Thử tinh khiết 41

3.1.1 Độ ẩm bột dược liệu và các cao chiết 41

3.1.2 Độ tro của bột dược liệu 41

3.2 Kết quả định tính và định lượng 41

3.2.1 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 41

3.2.2 Định lượng saponin toàn phần bằng phương pháp cân 42

3.2.3 Định lượng diosgenin bằng HPLC-MS 42

3.3 Khảo sát độc tính cấp diễn đường uống và liều cho uống 46

3.4 Tác dụng estrogen của Cát lồi 46

3.4.1 Khảo sát trên giai đoạn động dục dương tính 46

3.4.1.1 Thời gian xuất hiện chu kỳ động dục đầu tiên ở chuột non 46

3.4.1.2 Tỷ lệ động dục dương tính ở nhóm chuột trưởng thành bình thường 47 3.4.1.3 Tỷ lệ động dục dương tính ở nhóm chuột giảm năng sinh dục 49

3.4.2 Khảo sát tác dụng trên trọng lượng tử cung(-buồng trứng) 50

3.4.2.1 Trọng lượng tử cung-buồng trứng ở nhóm chuột non 50

3.4.2.2 Trọng lượng tử cung-buồng trứng ở nhóm chuột trưởng thành bình thường 51

3.4.2.3 Trọng lượng tử cung ở nhóm chuột giảm năng sinh dục 52

3.4.3 Nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương 54

3.4.3.1 Kết quả đường chuẩn 17β-estradiol 54

3.4.3.2 Kết quả nồng độ 17β-estradiol ở nhóm chuột giảm năng sinh dục 54

3.4.4 Khảo sát thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm 56

3.4.4.1 Thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột non 56

3.4.4.2 Thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm ở chuột trưởng thành bình thường 56

3.4.4.3 Thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột giảm năng sinh dục 58

3.4.5 Bàn luận 59

3.5 Tác dụng của Cát lồi trên mô hình giảm năng sinh dục-đường huyết cao 64

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 69

4.1 Kết luận 69

4.1.1 Tác dụng estrogen 69

4.1.2 Tác dụng hạ đường huyết 69

4.2 Đề nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA Analysis of Variance

ArKO Aromatase Knock-out

BMI Body Mass Index

cAMP cyclic Adenosine Monophosphate

DHEA-S Dehydroepiandrosterone - sulfate

E2 17β-estradiol

EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

ER Estrogen Receptor

ERE Estrogen Response Element

ERαKOKO Estrogen Receptor αKO Knock-out

FSH Follicle-Stimulating Hormone

GLUT2 Glucose Transporter 2

GLUT4 Glucose Transporter 4

GnRH Gonadotropin Releasing Hormone

MAPK Mitogen-activated Protein Kinases

MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú Michigan Center Foundation 7

NR Nuclear Receptor

OECD Organisation for Economic Co-operation and Development

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Nồng độ các loại hormone trong mãn kinh 14

Bảng 2.1: Các dấu hiệu của các giai đoạn khác nhau trong chu kỳ động dục của chuột .33

Bảng 2.2: Thành phần tế bào và tính chất của chất nhờn âm đạo ở các giai đoạn động dục 34

Bảng 2.3: Phân lô chuột trong mô hình giảm năng sinh dục-đường huyết cao 38

Bảng 3.1: Độ ẩm của dược liệu và các cao chiết 41

Bảng 3.2: Độ tro toàn phần và tro không tan trong acid của bột dược liệu 41

Bảng 3.3: Hàm lượng saponin trong bột dược liệu và cao tổng Cát lồi 42

Bảng 3.4: Hàm lượng diosgenin trong các loại cao chiết Cát lồi 45

Bảng 3.5: Thời gian xuất hiện giai đoạn động dục đầu tiên ở chuột non 46

Bảng 3.6: Tỉ lệ % các giai đoạn động dục và tỉ lệ động dục (%P + %E) ở nhóm chuột trưởng thành bình thường từ ngày 1 đến ngày 14 47

Bảng 3.7: Tỷ lệ % động dục dương tính (%P + %E) ở nhóm chuột giảm năng sinh dục từ ngày 7 đến ngày 15 49

Bảng 3.8: Trọng lượng tử cung-buồng trứng (mg%) ở nhóm chuột non 50

Bảng 3.9: Trọng lượng tử cung-buồng trứng (mg%) ở chuột trưởng thành bình thường 52

Bảng 3.10: Trọng lượng tử cung (mg%) ở nhóm chuột giảm năng sinh dục 53

Bảng 3.11: Phần trăm kết hợp (B/B0  100) tính được từ các nồng độ chuẩn 54

Bảng 3.12: Nồng độ 17β-estradiol (E2) huyết tương ở nhóm chuột giảm năng sinh dục 55

Bảng 3.13: Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột non 56

Bảng 3.14: Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở chuột trưởng thành bình thường 57 Bảng 3.15: Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột giảm năng sinh dục 58 Bảng 3.16: Đường huyết trước và sau thử nghiệm ở các lô chứng 65

Bảng 3.17: Đường huyết trước và sau thử nghiệm ở các lô GNSD-tiêm STZ 65

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Costus speciosus Koenig Smith 1

Hình 1.2: Con đường sinh tổng hợp các steroid 6

Hình 1.3: Sự điều hòa hormone thông qua trục H-P-G 7

Hình 1.4: Cơ chế hoạt động ở mức độ phân tử của estrogen 9

Hình 1.5: Hình ảnh mô học tử cung chuột mang thai 4,5 ngày 11

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của 17β-estradiol, cholesterol, diosgenin và dioscin 21

Hình 2.1: Sơ đồ chiết saponin toàn phần 30

Hình 2.2: Vị trí cắt tử cung để khảo sát trọng lượng (ở chuột giảm năng sinh dục) 36 Hình 3.1: Kết quả sắc ký định tính saponin và sapogenin trong Cát lồi 42

Hình 3.2: Sắc ký đồ chuẩn diosgenin 43

Hình 3.3: Sắc ký đồ cao tổng Cát lồi 44

Hình 3.4: Sắc ký đồ saponin Cát lồi 45

Hình 3.5: Ảnh chụp hiển vi dịch nhờn âm đạo ở các giai đoạn động dục 48

Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn 17β-estradiol 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Estrogen đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như pháttriển, sinh sản và chuyển hóa Estrogen có một phạm vi tác động rộng trên tim mạch,

hệ cơ-xương, miễn dịch và hệ thống thần kinh trung ương Thiếu hụt estrogen

ở cả phụ nữ hậu mãn kinh hay những phụ nữ cắt tử cung cũng như buồng trứng đềumang lại nhiều hậu quả khó khắc phục Thời kỳ đầu mãn kinh gây ra triệu chứng bốchỏa làm giảm chất lượng sống của người phụ nữ Hơn nữa, phụ nữ hậu mãn kinh cònđối diện với nhiều nguy cơ bao gồm rối loạn chuyển hóa, xơ vữa động mạch, loãngxương, mất trí nhớ ngắn hạn…

Sự can thiệp bằng thuốc, chủ yếu là liệu pháp hormone thay thế - HRT, là một

sự lựa chọn ở những phụ nữ mãn kinh vào những năm thập niên 80 Nhưng sau khinhững phát hiện từ nghiên cứu của WHI (Women’s Health Initiative Study,

2002) về nguy cơ từ HRT được công bố, việc sử dụng HRT ở Mỹ đã giảm đáng kể

Đa số phụ nữ sau đó đã chuyển sang sử dụng những liệu pháp khác trong đó gồmliệu pháp phytoestrogen-estrogen từ thực vật [13]

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu chứng tỏ rằng thiếu estrogen còn liên quan đếnhội chứng chuyển hóa (metabolic syndrome), được mô tả là béo phì vùng bụng,kháng isulin và rối loạn lipid, từ đó có nguy cơ dẫn đến các bệnh lý tim mạch và đáitháo đường [16] Ở những phụ nữ hậu mãn kinh mắc bệnh đái tháo đường type 2,liệu pháp thay thế estrogen cũng như phytoestrogen được sử dụng như một liệu pháp

hỗ trợ Nhiều bằng chứng cho thấy các phytoestrogen có thể đóng vai trò có íchtrong béo phì và đái tháo đường Một vài nghiên cứu gợi ý rằng phytoestrogen, cóthể do có cấu trúc tương tự estradiol, có tác động giúp cân bằng glucose, cải thiện sựtiết insulin và sự chuyển hóa lipid [12]

Cát lồi tên khoa học là Costus speciosus Koenig Smith, còn gọi là mía dò, là

loài thảo dược được sử dụng nhiều trong y học và thú y Nghiên cứu của Singh S và

cs (1972) cho thấy saponin từ thân rễ Cát lồi có tác dụng giống estrogen, làm tăngtrọng lượng tử cung và thay đổi sự tăng sinh trong tử cung ở liều 700 mg/kg

Cát lồi còn là nguồn diosgenin quan trọng Diosgenin là một sapogenin steroid cócấu trúc tương tự như estradiol và được xem như một phytoestrogen Tewari P.V và

cs (1973) báo cáo rằng hoạt động estrogen của 1600 μg diosgenin phân tách từ Cátg diosgenin phân tách từ Cátlồi gần như tương đương với lượng 150 μg diosgenin phân tách từ Cátg neoclinestrol [49] Ngoài ra, Cát lồi cònthể hiện tác dụng giảm đường huyết tốt trên mô hình đái tháo đường thực nghiệm[22], [23], [24], [38]

Từ các nghiên cứu trên và nhằm mở rộng nguồn phytoestrogen ở Việt Nam

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát một số tác dụng dược lý của các

cao chiết và saponin chiết từ thân rễ cây Cát lồi (Costus speciosus)” với các nội

dung sau:

- Khảo sát tác dụng estrogen của cao tổng Cát lồi và saponin toàn phần từ Cátlồi trên cơ địa chuột nhắt trắng non, chuột trưởng thành bình thường và chuột

bị gây giảm năng sinh dục qua các chỉ tiêu:

 Sự xuất hiện giai đoạn động dục dương tính (estrus phase)

 Sự thay đổi trọng lượng tử cung(-buồng trứng)

 Sự thay đổi hàm lượng 17β-estradiol trong huyết tương

 Sự thay đổi thể trọng

- Khảo sát tác dụng hạ đường huyết của cao tổng Cát lồi và saponin toàn phần

từ Cát lồi trên mô hình giảm năng sinh dục đi kèm với gây tăng đường huyếtbằng streptozotocin

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về Cát lồi

1.1.1 Phân loại – mô tả

Cát lồi có tên khoa học là Costus speciosus Koenig Smith, còn gọi là mía dò,

đọt đắng, đọt hoàng, tậu chó (Lạng Sơn), sẹ vòng, cây chót, nó ưởng Thuộc ngànhNgọc Lan (Mangoliophyta), lớp Hành (Liliopsida), bộ Gừng (Zingiberales), họ Mía

dò (Costaceae) [6]

Hình 1.1: Costus speciosus Koenig Smith

(Nguồn ảnh: (A) http://www.lrc-hueuni.edu.vn (B) http://en.wikipedia.org)Cát lồi là cây thân thảo mọng nước sống lâu năm, cao khoảng 1-2 mét, mọcthẳng đứng từ thân rễ to nằm ngang, phần non thân rễ có vảy bao bọc, vảy có lôngngắn Thân cây xốp, ít phân nhánh Lá to dài mọc so le, có bẹ Hoa trắng mọc thànhcụm ở ngọn cây, có lá bắc màu đỏ Quả nang chứa nhiều hạt đen

1.1.2 Phân bố - sinh thái

Chi Costus L có khoảng 175 loài trên thế giới, phân bố ở vùng nhiệt đới và

cận nhiệt đới Ở Việt Nam có 2 loài và 1 thứ

Cát lồi phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á, bao gồm Ấn Độ, Xrilanca, TháiLan, Malaysia, Lào, Campuchia, Việt Nam, các tỉnh Nam Trung Quốc và đảo Hải

Nam Ở Việt Nam, Cát lồi phân bố rộng ở các tỉnh thuộc vùng núi, trung du và cả đồng bằng.

Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc thành khóm lớn trênđất ẩm, xen với các cây cỏ khác ở ven rừng, ven bờ sông suối, bờ nương rẫy Ở vùngđồng bằng ít gặp hơn, trong các bụi quanh làng hay vườn nhà bỏ hoang Các tỉnh cónhiều Cát lồi là: Hòa Bình, Sơn La, Lai Châu, Cao bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên,Tuyên Quang, Tiền Giang, Long An, Đồng Tháp Ở miền Nam, cây mọc trên các bờkênh rạch Độ cao phân bố của cây rất rộng, từ vài chục mét đến gần

Cát lồi có khả năng tái sinh vô tính khỏe Các đoạn thân khi sinh cũng nhưcác đoạn thân rễ đều có thể tạo thành cây mới

Nguồn trữ lượng Cát lồi ở Việt Nam rất dồi dào, ước tính đến hàng ngàn tấn[6]

1.1.3 Thành phần hóa học và các hợp chất trong thân rễ Cát lồi

Thân rễ Cát lồi tươi chứa 77-87% nước, khi khô là 5,5% nước, 0,75% chất tantrong ether, 6,75% chất albuminoid, 66,65% carbohydrate, 10,65% xơ, và

9,70% tro [6]

Thành phần chính chiết xuất được từ Cát lồi là diosgenin Pandey V.B vàDasgupta (1970) đã chiết từ rễ khô Cát lồi được 2,12% diosgenin tinh khiết,tigogenin và một số saponin khác Lượng diosgenin tối đa tách được từ thân cây là0,65%, từ lá 0,37% và từ hoa 1,21% [49]

Thân rễ Cát lồi còn chứa các thành phần gồm: β-sitosterol (mộtphytoestrogen), prosapogenin A và B của dioscin, dioscin, gracillin, sitosterol,

protodioscin, methyl protodioscin, 31-norcycloartanone, cyloartanol, cycloartenol,cycloalaudenol, tetradecyl 13-methylpentadecanoate, tetra 11-methyltriadecanoate,4-oxotriaconsanoic acid, 14-oxoheptacosanoic acid, 15-oxooctacosnoic acid,methylprotogracillin, protogracillin và một số hợp chất khác [49].

Thân rễ cho ra dầu chứa pinocarveol (59,9%), cadinene (22,6%), cineol

(10,7%), p-methoxybenzophenone (3,3%) và cavacrol (1,3%) [49]

Phân tích GC-MS chiết xuất từ thân rễ Cát lồi của Lijuan và cs (2011) cho ra

6 hợp chất chính gồm diosgenin (56,31%), 9,19-cycloergost-24(28)-en-3-ol (28%),9,12,15-octadecatrien-1-ol (5,91%), hexadecanoic acid (4,28%), 9,12-octadecadienoic acid và β-sitosterol (3,87%); 14 hợp chất vết gồm chủ yếu là tinhdầu (0,02-3%) và 8 hợp chất chưa biết khác [35]

Phạm Kim Mãn và cs (Viện Dược liệu, 1985) nghiên cứu về thành phầnsaponin steroid trong Cát lồi (Mía dò) chứng minh saponin steroid lên men trongmôi trường nước sẽ biến thành dạng spirostan (vòng F đóng) Khi thủy phân dạngspirostan sẽ nâng cao hiệu suất diosgenin lên nhiều lần [6]

1.1.4 Tính vị - công dụng theo y học cổ truyền

Cát lồi có vị chua, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêuthủng, chống viêm Loài cây này còn sở hữu nhiều hoạt tính khác như: chất làm se,kích dục, thuốc xổ, tẩy giun sán, chất tẩy, giảm sốt và long đờm Cả thân, lá và thân

rễ Cát lồi đều được dùng chữa bệnh Thân rễ Cát lồi biểu hiện tính trợ tim, lợi mật,lợi tiểu và làm dịu thần kinh trung ương

Ở Ấn Độ, Cát lồi được dùng từ xưa trong hệ thống y học Ayurveda Theo đó,thân rễ Cát lồi dùng để trị sốt, phát ban, hen suyễn, viêm cuống phổi, có tác dụng xổ,lọc máu, kích thích, bổ, trừ giun, trị rắn cắn Ở Trung Quốc, Cát lồi dùng chữa viêmthận, phù, xơ gan, bí tiểu, nổi mề đay Ở Indonesia, dùng chữa các bệnh về mắt ỞMalaysia, Cát lồi dùng trị ho, làm hạ sốt

Ở Việt Nam, Cát lồi dùng để chống viêm, chữa các bệnh như sốt, đái buốt,đái vàng, thấp khớp, đau lưng, đau dây thần kinh Búp và cành non còn tươi nướng,

giã, vắt lấy nước chữa viêm tai, đau mắt, làm mát gan, giảm đau nhức Thân Cát lồi sắc uống dùng để trị sốt và bệnh lỵ [6].

1.1.5 Tác dụng của Cát lồi trên thực nghiệm

Thân rễ Cát lồi là một nguồn diosgenin quan trọng và được sử dụng nhiềutrong y học và thú y Các alkaloid từ Cát lồi đã được chứng tỏ là có tác dụng chống

cholinesterase cả in vitro lẫn in vivo (Battacharya và cs 1972) [49] Các nghiên cứu

cho thấy Cát lồi có tác dụng kháng ung thư (Baskar và cs., 2012) [10], kháng oxyhóa (Daisy và cs., 2010; Islam và cs., 2010; Nehetea và cs., 2010), bảo vệ gan(Verma và Khosa, 2009), kháng vi sinh vật và nấm (Singh và cs., 1992; Bandara,1998; Malabadi, 2005; Mohamad và cs., 2011), kháng viêm và hạ sốt (Binny và cs.,2010; Rayan và cs., 2011), ngừa thai (Tewari và cs., 1973), và tác dụng giúp thíchứng (Verma và Khosa, 2009) [49]

Hơn nữa, Cát lồi còn có tác dụng kiểu estrogen và thể hiện khả năng giảmđường huyết tốt

1.1.6 Tác dụng kiểu estrogen của Cát lồi

Singh và cs (1972) cho thấy saponin từ Cát lồi (liều 0.7 g/kg trong 10 ngày)

có hoạt động theo kiểu estrogen trên chuột cống trắng giảm năng sinh dục, làm tăngđáng kể trọng lượng tử cung và nồng độ glycogen tử cung và thay đổi sự tăng sinhtrong tử cung Ngoài ra, cao chiết liều này không ảnh hưởng đến sự sinh sản ở chuộtbình thường [49]

Tewari và cs (1973) báo cáo rằng hoạt động estrogen của 1600 μg diosgenin phân tách từ Cátg diosgenin(I) phân tách từ Cát lồi gần như tương đương với lượng 150 μg diosgenin phân tách từ Cátg neoclinestrol [49]

Tác giả Lijuan và cs (2011) tiến hành nghiên cứu tác động của cao cồn chiết

từ thân rễ Cát lồi và diosgenin trên sự co tử cung ở chuột cống trắng Kết quả: Chiếtxuất thân rễ Cát lồi có khả năng làm tăng sự co tử cung bằng cách đi vào kênhCalcium type I và phóng thích calci từ lưới cơ tương, từ đó có tiềm năng ứng dụngtrong những ca sinh khó do sự co dạ tiến triển chậm Tuy nhiên dữ liệu cho thấy tácđộng lên sự co tử cung không do tác động kiểu estrogen và không do tác động củadiosgenin mà chủ yếu do tác dụng của β-sitosterol có trong Cát lồi [35]

1.1.7 Tác dụng giảm đường huyết của Cát lồi

Chiết xuất nước từ thân rễ Cát lồi thể hiện tác dụng giảm đường huyết đáng

kể khi cho uống đồng thời với gây quá tải glucose [38] Eremanthin, mộtsesquiterpene lactone, chiết xuất từ thân rễ Cát lồi có hoạt tính giảm đường huyết vàgiảm rối loạn lipid Chiết xuất hexan (250 mg/kg), ethyl acetate (400 mg/kg) vàmethanol (400 mg/kg) từ thân rễ Cát lồi có tác dụng giảm đường huyết đáng kể,trong đó chiết xuất hexan có tác dụng bình thường hóa các chỉ số sinh hóa ở chuộtđái tháo đường gây bởi streptozotocin (60 mg/kg, i.p.) [22], [23], [24]

Chiết xuất từ rễ Cát lồi ngoài tác động kháng tăng đường huyết còn giúp giảm

mỡ máu và kháng oxy hóa, từ đó đóng vai trò trong việc hỗ trợ điều trị bệnh lý đáitháo đường và những biến chứng của nó [11]

1.2 Estrogen

1.2.1 Giới thiệu

Estrogen (hay oestrogen) là nhóm hormone sinh dục đóng vai trò chủ yếutrong chu kỳ động dục ở động vật hữu nhũ hay chu kỳ rụng trứng ở người, giúp duytrì chức năng sinh sản ở động vật cái Ở cả nam lẫn nữ, estrogen có một phạm vi tácđộng rộng trên tim mạch, hệ cơ-xương, miễn dịch và hệ thống thần kinh trung ương.Estrogen nội sinh gồm 3 loại chủ yếu: estrone (E1), estradiol (E2 hay 17β-estradiol)

và estriol (E3) Trong đó estradiol có hiệu lực mạnh nhất

Ở nữ, estrogen được sản xuất chủ yếu bởi buồng trứng trong độ tuổi sinh sản

và bởi nhau thai ở thời kỳ mang thai Ngoài ra, nó còn được sản xuất bởi tuyếnthượng thận và với số lượng ít hơn ở các mô khác như mô mỡ, xương, não, và vú[41] Estrogen được tổng hợp từ tiền chất ban đầu là cholesterol (Hình 1.2).Testosterone thông qua enzyme aromatase được chuyển hóa thành estradiol.Androstenedione cũng được chuyển hóa thành estrone nhờ aromatase

Hình 1.2: Con đường sinh tổng hợp các steroid [25]

1.2.2 Sự điều hòa hormone thông qua trục H-P-G

1.2.2.1 Sự điều hòa hormone trong chu kỳ kinh nguyệt

Các hormone sinh dục được điều hòa thông qua hệ thống trục vùng dưới tuyến yên-tuyến sinh dục (trục H-P-G – Hypothalamic-Pituitary-Gonadal axis).Vùng dưới đồi (Hypothalamus) tiết ra GnRH (Gonadotropin releasing hormone) theoxung dạng nhịp để kích thích thùy trước tuyến yên tiết ra LH (Luteinnizinghormone) và FSH (Follicular stimulating hormone) Trong 14 ngày đầu của chu kỳ(pha nang trứng), lượng FSH và LH tăng chậm và kích thích sự phát triển của nangtrứng và kích thích tế bào vỏ và hạt của nang trứng sản xuất ra estradiol và estriol.Estrogen đi vào dòng tuần hoàn và ban đầu ức chế sự tiết FSH bằng một feedback

đồi-âm lên tuyến yên (sự tiết LH ít bị ảnh hưởng hơn) và vùng dưới đồi (Hình 1.3),nhưng ở một nồng độ ngưỡng giới hạn trên nào đó, feedback âm của estrogenchuyển thành feedback dương, và bây giờ estrogen lại kích thích sự tăng LH (kéo dàikhoảng 24 – 48 giờ), dẫn đến sự rụng trứng, hình thành thể vàng và sự tiết

progesterone Progesterone cũng tạo một feedback âm lên sự tiết gonadotropin trong suốt pha thể vàng.

Hình 1.3: Sự điều hòa hormone thông qua trục H-P-G [18]

Khi lượng LH giảm, thể vàng thoái hóa và feedback âm của estrogen lại tiếptục hoạt động, và kinh nguyệt xuất hiện sau đó khi mà không còn đủ estrogen vàprogesterone từ thể vàng để duy trì nội mạc tử cung nữa; chu kỳ mới bắt đầu

Ngoài ra, tế bào hạt còn sản xuất ra peptide inhibin (khi được kích thích bởiFSH) Inhibin tạo ra một feedback âm lên sự tiết FSH trong suốt pha nang trứng.Inhibin còn được sản xuất bởi thể vàng trong pha thể vàng [18]

1.2.2.2 Sự điều hòa hormone trong dậy thì

Trục H-P-G trải qua giai đoạn hoạt động trong sự phát triển bào thai và sơsinh và sau đó đi vào giai đoạn nghỉ ngơi trong quá trình phát triển của trẻ cho đếnkhi dậy thì Sự dậy thì bắt đầu với sự kích hoạt hệ thống H-P-G Tác động qua lạicủa hormone từ vùng dưới đồi – GnRH, các gonadotropin LH và FSH, và các steroidsinh dục estradiol hoặc testosterone dẫn đến sự dậy thì cả về bên ngoài (sự phát triểncủa vú và cơ quan sinh dục) lẫn bên trong (tử cung, buồng trứng, tinh hoàn) [14]

Các neuron của vùng dưới đồi sản xuất GnRH, hormone này đi vào thùytrước tuyến yên gây ra sự phóng thích theo dạng xung (đặc biệt vào buổi tối) của haigonadotropin LH và FSH Sau khi được vận chuyển đến cơ quan sinh dục, cácgonadotropin gắn vào các thụ thể màng liên kết với phức hợp protein G bên trong tếbào mục tiêu Ở nữ, LH làm tăng cường sự sản xuất androgen của tế bào vỏ vàprogesterone của tế bào hạt FSH kích thích sự sản xuất estrogen của tế bào hạt [39].

1.2.3 Cơ chế hoạt động của estrogen

1.2.3.1 Cơ chế hoạt động ở mức độ phân tử

Cũng như các hormone khác, estrogen tác động lên tế bào đích thông qua thụthể estrogen (ER) Đa số các ER trong bào tương đều ở trạng thái bất hoạt trongphức hợp với các HSP (heat shock protein) Khi estrogen gắn vào, ER sẽ đượcphóng thích khỏi phức hợp và di chuyển vào bên trong nhân Có 4 cơ chế tác độngcủa ER (Hình 1.4): (A) cơ chế hoạt động kinh điển trên gene, (B) cơ chế hoạt độngkhông kinh điển trên gene, (C) cơ chế không trên bộ gene và (D) cơ chế hoạt độngtrên bộ gene ty thể

Trong cơ chế hoạt động kinh điển trên gene, dimer được tạo thành từ hai ER

đã gắn ligand (17β-estradiol) sẽ gắn với ERE (estrogen response element) hiện diệntrên promoter của các gene mục tiêu và điều hòa sự phiên mã của chúng Trong cơchế hoạt động không kinh điển trên gene, ER thay đổi sự phiên mã bằng cách gắnvới các nhân tố phiên mã khác và biến đổi hoạt động của chúng Cơ chế hoạt độngkhông trên bộ gene của estrogen có thể được khởi sự ngay trên màng tế bào thôngqua các ER trên màng hoặc bởi một kiểu thụ thể estrogen khác – GPR30 (G- protein-coupled receptor 30) Sự hoạt hóa các protein G và nhiều con đường tín hiệu khácnhau dẫn đến sự phosphoryl hóa và hoạt hóa các protein trong bào tương và khởi sựđáp ứng của tế bào Hơn nữa, sự phosphoryl hóa của các nhân tố phiên mã khácnhau, bao gồm các ER, còn dẫn đến sự thay đổi biểu hiện của nhiều gene Sự hoạthóa các con đường truyền tín hiệu có thể cũng được khởi sự bởi một phần nhỏ

các ER trong bào tương Các ER cũng hiện diện trong ty thể, nơi mà chúng điều hòabiểu hiện của các gene trong ty thể [43].

E2: 17β-estradiol, HSP: heat shock protein, ERE: estrogen response element, CoA: coactivators, RNA Pol II: RNA polymerase II, AP-1: activator protein-1 binding sequence, JUN: JUN protein, TF: transcription factor, P: phosphorylation, GPR30: orphan G-protein-coupled receptor 30, GP: G protein, c-SRC: SRC tyrosine kinase, PI3K: phosphatidylinositol-3 kinase, p85αKO and p110: PI3K subunits, EGFR: epidermal growth factor receptor, IGF-1R: insulin-like growth factor receptor, HER2: human epidermal growth factor receptor 2, và mtDNA: mitochondrial DNA.

Hình 1.4: Cơ chế hoạt động ở mức độ phân tử của estrogen [43]

hoàn và tuyến tiền liệt [19] Ở promoter của một số gene, đặc biệt là những gene liênquan đến sự tăng sinh, ERαKO và ERβ có thể có hoạt động đối lập nhau, gợi ý rằng đápứng tăng sinh của 17β-estradiol là kết quả của sự cân bằng giữa tín hiệu của ERαKO vàERβ [28].

1.2.4 Một số tác dụng của estrogen

1.2.4.1 Tác dụng của estrogen trên tử cung

Estrogen có tác động đáng kể đối với sự phù tử cung bao gồm sự giữ nước vàtăng cường hấp thụ các đại phân tử, theo sau đó là giai đoạn tăng trưởng và tăng sinh

tế bào [45]

Tử cung, mô đích chủ yếu của các hormone từ buồng trứng, được cấu thànhbởi nhiều loại tế bào khác nhau bao gồm chất nền, biểu mô mặt trong tử cung(luminal epithelium), biểu mô tuyến (glandular epithelium) và tế bào cơ trơn (Hình1.5) Các loại tế bào này trải qua những biến đổi tăng sinh và biệt hóa một cách đồng

bộ khi đáp ứng với các nồng độ estrogen và progesterone tuần hoàn Estrogen cónhiều tác động khác nhau trên các loại tế bào khác nhau ở tử cung Ở tử cung chuộtchưa trưởng thành (21 ngày tuổi), tốc độ tăng sinh tế bào rất thấp Sự tăng sinh đượckhởi sự khi đáp ứng với estrogen tuần hoàn lúc dậy thì Estrogen gây ra sự tăng sinhđối với cả tế bào biểu mô và chất nền

ERαKO là loại ER chiếm ưu thế trên tử cung trưởng thành Mặc dù ERαKO đượcbiểu hiện nhiều trên tế bào biểu mô, sự tăng sinh của các tế bào này khi đáp ứng vớiestradiol được cho là gián tiếp thông qua nhân tố tăng trưởng (growth factor), mộtmitogen đối với biểu mô, tiết ra bởi chất nền khi đáp ứng với estrogen Các nghiên

cứu in vitro cho thấy rằng, tùy theo bản chất của ligand và nhân tố đáp ứng trên

DNA mà nó gắn vào, ERαKO và ERβ có thể có những tác động trái ngược nhau trên sựphiên mã gene ERβ có thể tác động như một tác nhân ức chế trên hoạt động phiên

mã của ERαKO ở nồng độ gần bão hòa của estradiol Một cách giải thích cho tác dụng

ức chế này đó là ERβ có thể tạo dị dimer với ERαKO, từ đó điều hòa chức năng của ER

A: Lát cắt ngang tử cung ở vùng có phôi (IM) với phôi (em) bên trong lòng tử cung B:Lát cắt dọc tử cung ở vùng không có phôi (INTER) C và D: Tử cung được tiêm thuốcnhuộm Chicago blue C: Tử cung ngày 4,5 của thai kỳ D: Tử cung ngày 5,5 của thai kỳ.Le=luminal epithelium S=stroma Ge=glandular epithelium Myo=myometrium.

Hình 1.5: Hình ảnh mô học tử cung chuột mang thai 4,5 ngày [54]

Nồng độ ERβ trong tử cung thay đổi trong suốt chu kỳ kinh nguyệt với nồng

độ cao nhất trong quá trình tăng sinh khi lượng estrogen và ERαKO cũng đạt tới đỉnh.Ngoài ra, trên tử cung còn non, ERαKO và ERβ được biểu hiện với lượng như nhautrong biểu mô và chất nền (stroma), và estradiol được chứng minh là làm giảm sựbiểu hiện ERβ trong chất nền [52]

Hơn nữa, estrogen còn có vai trò kích thích sự giữ nước ở nội mạc tử cung(bao gồm chất nền, biểu mô mặt trong tử cung và biểu mô tuyến) thông qua conđường vận chuyển nước bởi các kênh điều hòa tính thấm nước aquaporin (AQP).Dịch nước này sau đó sẽ đi vào lòng tử cung dẫn đến giảm độ nhớt dịch tử cung[29], [45]

1.2.4.2 Tác dụng của estrogen trên sự cân bằng glucose

Các ER là những phân tử quan trọng cho sự cân bằng glucose trong cơ thể.Nghiên cứu đã chứng minh chuột ERαKOKO (ERαKO knock-out) bị béo phì và khánginsulin ERαKO có liên quan đến sự sống sót của tế bào β – tế bào của tiểu đảoLangerhans ở tuyến tụy có nhiệm vụ tiết insulin quan trọng cho sự cân bằng glucose.Người ta công bố rằng sự thiếu tác dụng của estrogen ở nam, do thiếu ERαKO hoặcaromatase, dẫn đến rối loạn chuyển hóa glucose đến một mức độ mà có thể tiến triểnthành đái tháo đường type 2 Sự bất thường này cũng được phát hiện ở chuột thiếuaromatase (ArKO) [8]

Gần đây, người ta cho rằng cả ERαKO và ERβ cùng điều hòa kênh vận chuyểnglucose GLUT4 ở cơ xương và tính nhạy insulin ở gan ERαKO và ERβ và ER gắn vớiprotein G hiện diện trên tế bào β có tác dụng tăng cường khả năng sống sót của tếbào này [21]

Ngoài ra, estradiol ở nồng độ sinh lý có tác động bảo vệ tế bào β khỏi độc tố

từ lipid, stress oxy hóa và apoptosis Ở những mô ngoại vi nhạy với insulin, estradiolcòn được biết là điều biến tính nhạy insulin và, do đó điều biến sự cân bằng glucose.Những phát hiện mới trên những gene được điều hòa bởi ERαKO và ERβ ở những mônhạy với insulin cho thấy estradiol tham gia vào sự cân bằng glucose bằng cách điềuhòa sự biểu hiện các gene liên quan đến tính nhạy insulin và sự hấp thụ glucose Dovậy, những loại thuốc mà có thể điều biến một cách chọn lọc hoạt động của ERαKOhoặc ERβ trong mối liên hệ của chúng với các gene mục tiêu sẽ có tiềm năng trởthành liệu pháp hỗ trợ chữa trị bệnh đái tháo đường type 2 [21]

1.2.4.3 Tác dụng của estrogen trên các quá trình chuyển hóa khác

Estrogen còn được phát hiện là có khả năng chuyển sự chuyển hóalipoprotein theo hướng HDL (high density lipoprotein) cao và LDL (low densitylipoprotein) thấp Cơ chế của tác dụng này là thông qua khả năng kích hoạt biểu hiệngene thụ thể LDL và tăng số lượng thụ thể này, từ đó làm giảm nồng độ LDL trongmáu Một cơ chế khác của tác dụng này là thông qua tác dụng làm giảm hoạt độngcủa enzyme lipase trong gan của estradiol, do đó làm giảm sự dị hóa HDL

Nghiên cứu chứng minh rằng việc điều trị với estrogen có liên quan đến sựtăng leptin, một hormone protein điều khiển sự thèm ăn và chuyển hóa Điều nàyđược ủng hộ bởi khảo sát chứng tỏ rằng bổ sung estradiol giúp đảo ngược tác dụng

ức chế của sự cắt hai buồng trứng lên gene ob (obese gene – gene mã hóa leptin ở

mô mỡ) và nồng độ leptin tuần hoàn Hơn nữa, nồng độ leptin trong máu ở phụ nữtiền mãn kinh cao hơn so với nam và phụ nữ hậu mãn kinh Tuy nhiên, các nghiêncứu đánh giá tác dụng của liệu pháp thay thế estrogen trên nồng độ leptin vẫn cònmâu thuẫn

Estradiol còn liên quan đến hormone ghrelin, hormone peptide điều khiểncảm giác đói Nghiên cứu cho thấy estradiol làm giảm tác dụng gây thèm ăn củaghrelin và sự giảm lượng estrogen sau khi cắt buồng trứng liên quan đến sự tăngnồng độ ghrelin trong huyết tương, làm tăng lượng thức ăn ăn vào và từ đó làm tăngthể trọng Từ các nghiên cứu trên cho thấy estradiol cung cấp một vai trò bảo vệ đốivới sự tăng cân [21]

1.2.4.4 Tác dụng kháng oxy hóa của estrogen

Các nghiên cứu gần đây cho thấy estradiol có hoạt tính kháng oxy hóa Sựperoxide hóa lipid thường được gây ra bởi các gốc oxy tự do, ·O2- và H2O2, và sự tổnthương từ các gốc tự do này được ngăn chặn bởi superoxide dismutase và catalase.Một nghiên cứu ghi nhận rằng estradiol một mình có thể ngăn chặn 70% những tổnthương từ sự peroxide hóa lipid này Estradiol ngăn chặn sự gãy mạch DNA theokiểu tương tự như các yếu tố bắt gốc tự do; catalase và superoxide dismutase Hơnnữa, estrogen còn ức chế sự hình thành của các gốc superoxide [21]

1.2.5 Thiếu hụt estrogen trong mãn kinh

1.2.5.1 Định nghĩa mãn kinh

Mãn kinh, đặc biệt là hậu mãn kinh, được xác định khi một phụ nữ khôngthấy kinh nguyệt trong 12 tháng liên tiếp Tiền mãn kinh được mô tả là khoảng thờigian trước mãn kinh khi mà chu kỳ kinh nguyệt bắt đầu thay đổi cho đến chu kỳ kinhnguyệt cuối cùng Phụ nữ được xác định là hậu mãn kinh khi họ không thấy

kinh nguyệt do một vài lý do (Bảng 1.1) Thuật ngữ “mãn kinh tự nhiên” được dùng

để chỉ sự ngừng kinh nguyệt trong 1 năm nếu người phụ nữ vẫn còn tử cung và ítnhất một phần buồng trứng của họ Thuật ngữ “mãn kinh phẫu thuật” được dùng đểchỉ những phụ nữ không thấy kinh do phẫu thuật cắt tử cung hay buồng trứng hoặc

cả hai [32]

Bảng 1.1: Nồng độ các loại hormone trong mãn kinh [32]

Thuật ngữ E2 (pg/mL)Nồng độ Nồng độ T (ng/dL)

Nồng độDHEA-S (ng/mL)

Nồng độSHBG(nmol/L)

Khoảng 90% phụ nữ trải nghiệm mãn kinh ở độ tuổi trung bình là 51,2

(46-55 tuổi) Số còn lại trải nghiệm mãn kinh trước tuổi 46 (mãn kinh sớm), với 1% phụ

nữ mãn kinh trước độ tuổi 40 [25]

1.2.5.2 Estrogen – Progesterone ở thời kỳ mãn kinh

Loại estrogen tuần hoàn chủ yếu ở những phụ nữ tiền mãn kinh là estradiol Nồng độ của hormone này được điều khiển bởi các nang trứng đang pháttriển và thể vàng Ở phụ nữ tiền mãn kinh, sự sản xuất estradiol biến thiên với lượngFSH và có thể đạt nồng độ cao hơn ở những phụ nữ trẻ dưới 35 tuổi Lượng estradiolthông thường không giảm đáng kể cho đến giai đoạn muộn của sự chuyển tiếp mãnkinh Lượng estradiol có thể khá biến thiên, thỉnh thoảng rất cao hoặc rất thấp Tínhbiến thiên này có thể dẫn đến sự tăng triệu chứng trong suốt những năm tiền mãnkinh Trong khi gonadotropin tăng, sự biến thiên LH trở nên bất thường Có sự tăngtrong tần số dao động với sự giảm ức chế GnRH bởi các phân tử tín hiệu thần kinh(opioid) Mặc dù chu kỳ kinh nguyệt vẫn tiếp tục bình thường, lượng

17β-progesterone trong giai đoạn sớm của sự chuyển tiếp mãn kinh lại thấp hơn ở phụ nữ

ở giữa giai đoạn sinh sản và biến thiên nghịch lại với BMI (body mass index) Phụ

nữ ở giai đoạn muộn của quá trình chuyển tiếp mãn kinh thể hiện sự tạo trứng suykém và sự tăng tỉ lệ chu kỳ không rụng trứng so với phụ nữ trong độ tuổi sinh sản

Về cơ bản, tất cả estradiol ở phụ nữ sau mãn kinh là từ sự chuyển hóa ngoại vi từestrone (E1)

Estradiol ở phụ nữ thời kỳ hậu mãn kinh giảm đến 90% do sự thoái hóa củacác nang trứng Trong thời kỳ này, estradiol được sản xuất ở tuyến thượng thận, mô

mỡ, não, cơ, gan và một lượng nhỏ ở buồng trứng Loại estrogen chiếm ưu thế ở phụ

nữ hậu mãn kinh là estrone, với hiệu lực sinh học chỉ khoảng 1/3 so với estradiol.Lượng estrone tuần hoàn (và estrone sulfate) ở phụ nữ lớn tuổi chỉ khoảng

1/3 đến 1/2 lượng estrone ở phụ nữ độ tuổi sinh sản Điều này là do sự sản xuấtestrone phần lớn từ sự thơm hóa (aromatization) ngoại vi từ androstenedione Hoạtđộng thơm hóa này tăng gấp đôi đến gấp tư cùng với sự lão hóa và càng tăng hơncùng với tình trạng béo phì thường đi kèm với quá trình lão hóa Lượng estrone vàestradiol sản xuất trong suốt những năm sau mãn kinh lần lượt là 40 và 6 μg diosgenin phân tách từ Cátg/ngày

So với 80 đến 500 μg diosgenin phân tách từ Cátg/ngày estradiol trong độ tuổi sinh sản [25]

1.2.5.3 Hậu quả của mãn kinh

Dựa vào những thay đổi về nội tiết liên kết với tuổi tác, có nhiều triệu chứngxảy ra ở phụ nữ lớn tuổi có thể là do sự thiếu hụt estrogen hoặc sự giảm tiếtandrogen hoặc GH Những rối loạn mà chắc chắn do thiếu estrogen bao gồm nhữngtriệu chứng về vận mạch và teo niệu-sinh dục (urogenital atrophy) Loãng xươngcũng được cho là phần lớn do sự thiếu hụt estrogen, và nó có thể trầm trọng hơn do

sự giảm tiết GH Tương tự, sự tăng tỉ lệ mắc phải bệnh xơ vữa động mạch và cáctriệu chứng về tâm lý bao gồm chứng mất ngủ, mệt mỏi, mất trí nhớ ngắn hạn và suynhược cũng được cho là do thiếu estrogen Cả DHEA-S và GH có thể đều tác độngđến những hiện tượng trên Hầu hết những phụ nữ gặp phải các triệu chứng trongquá trình chuyển tiếp mãn kinh đều biểu hiện triệu chứng bốc hỏa và các triệu chứngkhác của sự thiếu estrogen Những triệu chứng thông thường khác của quá

trình chuyển tiếp mãn kinh bao gồm giảm ham muốn tình dục, hay quên, khô âmđạo và són tiểu (urinary incontinence) [25].

Mặt khác, mãn kinh còn dẫn đến nguy cơ mắc các bệnh tim mạch có liênquan đến những thay đổi về biến dưỡng xảy ra ở giai đoạn chuyển tiếp mãn kinh.Phụ nữ hậu mãn kinh có 60% nguy cơ dẫn đến hội chứng biến dưỡng (metabolicsyndrome) Những đặc điểm của hội chứng biến dưỡng như tích tụ mỡ vùng bụng,kháng insulin, cao huyết áp và rối loạn lipid (triglyceride cao, giảm HDL – high-density lipoprotein và LDL cao) ở những phụ nữ mãn kinh được cho là do sự thiếuhụt estrogen [16] Và những người mắc hội chứng biến dưỡng có nguy cơ mắc cácbệnh mãn tính như đái tháo đường type 2 – đái tháo đường hình thành do sự thừadinh dưỡng và kháng insulin

1.2.5.4 Liệu pháp hormone thay thế

Thời kỳ đầu mãn kinh gây ra triệu chứng bốc hỏa làm giảm chất lượng cuộcsống của người phụ nữ Hơn nữa, sự thiếu hụt estrogen ở phụ nữ mãn kinh còn đưađến nguy cơ mắc các bệnh lý như loãng xương, đái tháo đường và các bệnh timmạch Sự can thiệp bằng thuốc, chủ yếu là liệu pháp hormone thay thế - HRT, là một

sự lựa chọn ở những phụ nữ mãn kinh vào những năm thập niên 80, với hơn

87% phụ nữ cho rằng HRT là một liệu pháp hiệu quả trong việc trị chứng bốc hỏa.Nhưng sau khi những phát hiện từ nghiên cứu của WHI (Women’s Health InitiativeStudy, 2002) về nguy cơ từ HRT được công bố, việc sử dụng HRT ở Mỹ đã giảmđáng kể [13] Đa số phụ nữ sau đó đã chuyển sang sử dụng những liệu pháp khác mà

họ cho là an toàn hơn Một trong số liệu pháp đó là phytoestrogen-estrogen từ thựcvật

1.3 Phytoestrogen

1.3.1 Giới thiệu

Phytoestrogen là một nhóm các hợp chất polyphenol có nguồn gốc từ thực vật

có khả năng tương tác với các thụ thể estrogen (ER) hoặc điều biến hoạt động của

estrogen in vivo [46], có cấu trúc hoặc chức năng giống như estrogen nội sinh [56].

Các hợp chất phytoestrogen bao gồm những thành viên thuộc một vài họ như

flavone (kaempferol và quercetin), isoflavone (genistein, daidzein, formononetin vàequol), lignan (enterolactone, enterodiol và nordihydroguaiaretic acid), coumestane(coumestrol), mycotoxin (zearalenol) và stilben (resveratrol) [56].

1.3.2 Cơ chế hoạt động của phytoestrogen

Cơ chế hoạt động sinh học của phytoestrogen có thể là sự gắn với các thụ thểestrogen (ER) bởi vì nó có cấu trúc tương tự như estradiol Ái lực bám vào các ERđược quyết định bởi hệ thống vòng trên một mặt phẳng (planar ring system), hai cấutrúc vòng được phân cách bởi 2 nguyên tử carbon, và cách nhau bởi liên kết kỵ nước

và liên kết hydrogen Mặc dù hầu hết các phytoestrogen đều có ái lực gắn ER yếuhơn so với estrogen nội sinh, chúng đóng những vai trò estrogen hoặc kháng-estrogen khác nhau trên sự điều hòa của các cơ quan sinh sản Phytoestrogen thểhiện ái lực gắn ERαKO thấp gợi ý hoạt tính estrogen yếu (10-2-10-3) so với estradiol,trong khi chúng thể hiện tác dụng kháng-estrogen do khuynh hướng gắn tương đốivới ERβ [56]

Thử nghiệm tái tổ hợp, chủ yếu trên mô hình nấm men và các dòng tế bào ungthư vú, cung cấp bằng chứng cho thấy phytoestrogen không chỉ gắn với các ER màcòn khởi sự sự phiên mã gene Phytoestrogen được phát hiện là kích thích hoặc ứcchế biểu hiện của protein và mRNA ERαKO và/hoặc ERβ trong mô thần kinh và môsinh sản ở động vật gặm nhấm Tác dụng này của từng phytoestrogen khác nhau đềukhác nhau đáng kể và còn phụ thuộc vào loài và mô khảo sát [20]

Ngoài ra, phytoestrogen còn được chứng minh là tạo ra nhiều hoạt động sinhhọc khác nhau mà không thông qua hoạt hóa ER trong nhân Ở các tế bào cơ trơnđộng mạch chủ người, phytoestrogen tỏ ra ức chế trên sự tăng sinh do phân bào, sự

di trú và tổng hợp chất nền ngoại bào thông qua điều hòa giảm (down-regulating)con đường tín hiệu MAPK (mitogen-activated protein kinases) Quercetin, mộtflavone, tạo ra tác động kép trên sự điều hòa hoạt động của các protein kinase trongcác tế bào u cổ trướng Ehrlich thông qua tăng hoạt động của protein kinase phụthuộc cAMP và giảm hoạt động protein kinase không phụ thuộc cAMP

Tác dụng phụ thuộc ER và không phụ thuộc ER của phytoestrogen chỉ ranhững cơ chế phức tạp về hoạt động sinh lý và/hoặc dược lý trên hệ thống sinh sản

và các bệnh liên quan [56]

Cơ chế hoạt động bên trong tế bào của phytoestrogen có thể bao gồm: (1) tácdụng trên bộ gen thông qua ERαKO, ERβ và các thụ thể nhân khác (thụ thểprogesterone, androgen hoặc aryl hydrocarbon); (2) tác dụng trên các enzyme liênquan đến quá trình tạo steroid (3β- và 17β-hydroxysteroid dehydrogenase,aromatase); (3) tác dụng lên globulin gắn hormone sinh dục (SHBG); (4) tác dụngtrên protein tyrosine kinase, quan trọng trong việc truyền tín hiệu; (5) tác dụng lênDNA topoisomerase I và II , quan trọng cho sự sao chép DNA; và (6) hoạt độngkháng oxy hóa [20]

đó kiểu mẫu biểu hiện gene sẽ khác nhau ở những nồng độ chất đồng vận khác nhau

Sự tương tác giữa hai loại ER và những đồng nhân tố (cofactor) đặc trưng của chúngcung cấp một nền tảng cho hoạt động theo kiểu chọn lọc mô của estrogen

Rất nhiều phytoestrogen, bao gồm resveratrol, genistein, daidzein vàquercetin, đã được chứng tỏ là gắn với cả ERαKO lẫn ERβ và gây ra sự phiên mã cácgene mục tiêu của estrogen theo kiểu tùy thuộc vào liều Tuy nhiên, phytoestrogengắn với ER với một ái lực thấp hơn rất nhiều so với estradiol Ái lực của daidzein

(phytoestrogen từ đậu nành) đối với ERαKO và ERβ thấp hơn lần lượt là 20.000 và 500 lần so với estradiol.

Không như estradiol gắn với cả ERαKO và ERβ với ái lực như nhau, nhiềuphytoestrogen thể hiện một ái lực cao hơn đối với ERβ Ngoài ra, phytoestrogen gây

ra sự phiên mã các gene mục tiêu của estrogen ở mức độ cao hơn nhiều khi gắn vàoERβ so với khi gắn với ERαKO Bằng chứng cho thấy genistein có khuynh hướng gắnERβ và thể hiện hoạt động gắn DNA và phiên mã mạnh hơn khi gắn với ERβ

Tuy có ái lực thấp hơn với ER so với estradiol, nhưng một vài phytoestrogen

đã được báo cáo là gây ra sự phiên mã gene từ cả ERαKO và ERβ ở mức độ cao hơn sovới estradiol Nghiên cứu cho thấy hoạt động phiên mã gene từ ERαKO bởi genistein vàquercetin cao hơn lần lượt gấp 1,4 và 1,7 lần so với estradiol và gấp 2,4 và 4,5 lần sovới estradiol thông qua ERβ Thêm vào đó, sự hiện diện của estrogen nội sinh đượcchứng tỏ là có ảnh hưởng lên tác dụng của phytoestrogen trên sự phiên mã gene Ví

dụ, cả genistein và resveratrol đều hoạt động hỗ trợ với 17β-estradiol để kích hoạthoạt động phiên mã trên các tế bào ung thư MCF7 (một dòng tế bào ung thư vú) gâybởi ERαKO và ERβ

Do phytoestrogen có ái lực khác nhau với ERαKO và ERβ, tác động cuối cùngkhi sử dụng một phytoestrogen nào đó có thể phụ thuộc vào kiểu mẫu biểu hiện củaERαKO và ERβ khác nhau trên các loại tế bào khác nhau [36]

1.3.3.2 Phytoestrogen và sự sinh tổng hợp steroid

Đa số các dữ liệu về phytoestrogen được cung cấp từ các nghiên cứu trênisoflavone từ đậu nành như genistein, daidzein, biochanin A Các nghiên cứu dịch tễ

học trên phụ nữ tiền và hậu mãn kinh và các thử nghiệm in vivo trên động vật cho

thấy nhiều thành phần trong đậu nành có thể điều biến nồng độ của các hormone từbuồng trứng Sự điều biến này có thể là trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua cácgonadotropin Khẩu phần ăn chứa isoflavone được chứng minh là có tác dụng làmgiảm, tăng hoặc không thay đổi nồng độ progesterone (P4) và estradiol (E2) tronghuyết thanh Sự mâu thuẫn này có thể được giải thích bởi sự khác nhau về thời gianthử nghiệm, dạng sản phẩm đậu nành được sử dụng, dạng isoflavone và hàm lượng

của nó trong khẩu phần ăn Hơn nữa, phương hướng và mức độ tác động của

genistein và daidzein in vivo có vẻ phụ thuộc vào loài, trạng thái sinh sản của đối

tượng nghiên cứu và sự chuyển hóa phytoestrogen của mỗi cá thể [20]

1.3.3.3 Phytoestrogen và sự tăng trưởng- tăng sinh tế bào

Hoạt động khác nhau của các ER cũng như ái lực cao đối với ERβ hơn vớiERαKO của phytoestrogen ở nồng độ thấp gợi ý rằng tác dụng cuối cùng củaphytoestrogen trên sự phát triển của tế bào có thể rất khác với tác dụng củaestrogen

Có rất nhiều phytoestrogen có vẻ có một tác động hai chiều trên sự tăng sinh

tế bào: kích thích tăng trưởng ở nồng độ thấp và ức chế tăng trưởng ở nồng độ cao

Ở nồng độ thấp, resveratrol và quercetin kích thích sự tăng trưởng ở các tế bàoMCF7 nhưng lại ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào ở nồng độ cao Tương tự,genistein ở nồng độ thấp làm tăng trưởng tế bào nhạy với estrogen nhưng lại giảmtăng trưởng tế bào, ức chế sinh tổng hợp DNA và gây chết tế bào ở nồng độ cao

Tác dụng trên sự tăng trưởng và tăng sinh tế bào của phytoestrogen có thểđược giải thích bằng khả năng thay đổi biểu hiện một số protein điều khiển chu trình

tế bào, gây hoãn chu trình tế bào (cell cycle arrest) và apoptosis [36]

1.3.3.4 Phytoestrogen và đái tháo đường

Đái tháo đường là một rối loạn về biến dưỡng phức tạp được mô tả bởi sự bấtthường trong việc tiết và hoạt động của insulin, dẫn đến giảm khả năng dung nạpglucose và tăng đường huyết Ở đái tháo đường type 1, sự rối loạn này là do sự pháhủy các tế bào β của tiểu đảo tụy do quá trình tự miễn Trong khi ở đái tháo đườngtype 2 có sự kết hợp giữa sự kháng insulin ngoại vi và sự suy giảm chức năng của tếbào β [55] Và chiến lược đầu tiên trong chữa trị đái tháo đường đó là duy trì đườnghuyết ở mức bình thường bởi đường huyết cao, ngoài những tác hại đã biết, có thểlàm trầm trọng thêm sự kháng insulin cũng như suy giảm chức năng tiết insulin của

tế bào β trong đái tháo đường type 2 [50]

Bên cạnh các loại thuốc điều trị đái tháo đường, nhiều loại thảo dược đã vàđang được sử dụng nhằm hỗ trợ trong việc điều trị Ở những phụ nữ hậu mãn kinh

mắc bệnh đái tháo đường type 2, do có bằng chứng cho thấy estrogen có vai tròtrong điều hòa tính nhạy insulin ở các mô cũng như bảo vệ tế bào β [21], liệu phápthay thế estrogen cũng như phytoestrogen được sử dụng như một liệu pháp hỗ trợ.Nhiều bằng chứng cho thấy các phytoestrogen có thể đóng vai trò có ích trong béophì và đái tháo đường Một vài nghiên cứu gợi ý rằng phytoestrogen, có thể do cócấu trúc tương tự 17β-estradiol, có tác động giúp cân bằng glucose, cải thiện sự tiếtinsulin và sự chuyển hóa lipid thông qua cả cơ chế thụ thể estrogen cũng như cơ chếkhông qua thụ thể [12].

1.3.4 Diosgenin

Diosgenin (25R-spriost-5-en-3β-ol), một sapogenin steroid có cấu trúc tương

tự như cholesterol và estrogen, là sản phẩm thủy phân của dioscin, một saponin cótrong nhiều loại cây (Hình 1.5) Diosgenin được tìm thấy ở một số loài cây bao gồm

Costus speciosus, Smilax menispermoidea, Trigonella sp., Trillium sp và nhiều loài thuộc chi Dioscorea - D.althaeoides, D colletti, D zingiberensis, D villosa [37].

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của 17β-estradiol, cholesterol, diosgenin và dioscinDiosgenin được sử dụng như là nguồn nguyên liệu ban đầu cho công nghiệp tổng hợp một phần các loại thuốc ngừa thai, hormone sinh dục và các steroid khác

Diosgenin nhận được nhiều sự quan tâm bởi nhiều đặc tính dược lý tiềm năng của

nó Một số nghiên cứu cho thấy diosgenin mang lại nhiều lợi ích như ngăn ngừabệnh tim mạch, ung thư, kháng viêm và ngừa thai [37]

Do có cấu trúc tương tự như estrogen, diosgenin được giả thuyết là có tácdụng kiểu estrogen (estrogenic-like effect) [53] Sản phẩm kem hoặc thực phẩm bổ

sung từ củ mài dại Dioscorea villosa (wild yam), chứa diosgenin và một số hợp chất

khác, được quảng cáo như là một sự thay thế cho liệu pháp estrogen dùng để trịnhững rối loạn ở phụ nữ tiền mãn kinh Tuy nhiên vẫn chưa có đủ bằng chứng chứngminh tác dụng estrogen này là của riêng diosgenin Do vậy, việc khảo sát tác dụngestrogen của diosgenin là rất cần thiết

Ngoài ra, diosgenin còn có vai trò có ích trong các loại rối loạn chuyển hóabao gồm cả đái tháo đường Diosgenin có tác dụng giảm đường huyết và kháng oxyhóa tốt [37] cũng như giúp giảm cholesterol, tăng nồng độ HDL trong máu [44]

1.3.5 Các phương pháp đánh giá tác dụng estrogen của phytoestrogen

Do tác dụng kiểu estrogen mang bản chất phức tạp nên đến nay vẫn chưa cómột thử nghiệm đơn lẻ nào có thể bao hàm tất cả phạm vi của nó Thay vào đó,

người ta sử dụng một vài thử nghiệm in vitro và in vivo để đánh giá hoạt tính

estrogen của các hợp chất

Những thử nghiệm gắn ER in vitro cung cấp thông tin về khả năng của các

phytoestrogen trong việc tương tác với các ER, gắn với ERE (estrogen responsiveelement) trên promoter của gene mục tiêu sau khi tạo phức hợp ligand-ER và tươngtác giữa các tác nhân đồng hoạt hóa (co-activator) và các ER theo kiểu phụ thuộcligand Ngoài ra, các thử nghiệm chuyển hoạt hóa (transactivation) trên tế bào giúp

dò tìm sự kích hoạt gene thông qua ER Những phân tích sinh hóa in vitro có thể

được sử dụng để kiểm tra tác động khả dĩ trên hoạt động của protein Thử nghiệm screen dùng để đo lường đáp ứng tăng sinh hoặc kháng tăng sinh trên những tế bàođáp ứng với estrogen

E-Tuy nhiên, để đánh giá hoạt tính estrogen trên mô hoặc cơ quan phải cần đến

phương pháp in vivo Ở động vật cái, thử nghiệm bổ tử cung (uterotrophic assay) có

tính ứng dụng khi cần khảo sát tính đồng vận hay đối vận đối với ERαKO của hợp chấtthử nghiệm trên đối tượng động vật trưởng thành giảm năng sinh dục hoặc động vậtnon Ngoài ra, hoạt tính estrogen trên tuyến vú có thể được khảo sát thông qua sựkéo dài ống tuyến và thay đổi cấu tạo của núm vú ở những động vật non hoặc gầndậy thì Ở con đực, thử nghiệm Hershberger trên chuột cống gần dậy thì-thiến có thểđược sử dụng để kiểm tra đáp ứng (anti)androgen hoặc (anti)estrogen trên nhữngtuyến sinh dục thứ cấp và các mô khác được điều hòa bởi hormone Bên cạnh nhữngthử nghiệm ngắn hạn này, các thử nghiệm độc tính đối với sinh sản (reproductivetoxicity) mạn tính và cận cấp tính cũng như các nghiên cứu hai thế hệ có thể được sửdụng cho phytoestrogen để xác nhận tính an toàn khi sử dụng dài hạn [46].

Ngoài ra, một vài nghiên cứu trên phytoestrogen còn sử dụng phương phápkhảo sát chu kỳ động dục cũng như sự mở âm đạo sớm ở chuột non [31]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu và phương pháp chiết xuất

Thân rễ cây Cát lồi (Costus speciosus) thu hái vào tháng 4 ở Vườn Bảo tồn

Dược liệu của Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM được phơi khô và xay thànhbột mịn Nguyên liệu được kiểm định bởi Bộ môn Tài nguyên-Thực vật, Trung tâmSâm và Dược liệu Tp HCM

Các dạng cao chiết và hợp chất chiết xuất từ nguyên liệu để thử nghiệm gồm: Cao chiết tổng Cát lồi (cồn 95%, 45%, nước cất): được chiết bằng phươngpháp ngấm kiệt với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:10 trong 72 h đối với từngdung môi, sau đó cho cô giảm áp và đông khô thu được cao chiết Hiệu suất chiếtcủa cao tổng là 8,81%

Saponin toàn phần: dược liệu được chiết ngấm kiệt bằng cồn 70% (tỉ lệ

1:15) Dịch chiết được cô tới cắn, thêm nước, lắc với diethylether cho đến khi dịchether không màu Loại bỏ dịch ether, tiếp tục lắc dịch nước với n-butanol bão hoànước cho đến khi lớp n-butanol nhạt màu hoặc mất màu Dịch n-butanol được côgiảm áp tới cắn thu được saponin toàn phần Hiệu suất chiết của saponin là 4,66%

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Chuột nhắt trắng cái chủng Swiss albino, non và trưởng thành, được cung cấp

bởi Viện Vắcxin và Sinh phẩm Y tế - TP Nha Trang Chuột được để ổn định 1 tuầntrước khi thử nghiệm Thể tích cho uống hoặc tiêm phúc mô (i.p.) là 10 ml/kg thểtrọng chuột

Chuột non được chọn là chuột 3-4 tuần tuổi, trọng lượng 18 ± 2 g Chuộttrưởng thành được chọn là chuột từ 7-8 tuần tuổi, trọng lượng 28 ± 2 g

Chuột trưởng thành được gây mô hình giảm năng sinh dục bằng phẫu thuậtcắt hai buồng trứng để khảo sát tác dụng estrogen của mẫu thử Chuột được gây môhình giảm năng sinh dục đi kèm với gây tăng đường huyết bằng streptozotocin liều

50 mg/kg i.p vào tuần thứ ba (hai tuần sau khi cắt) để khảo sát tác dụng của mẫu thửtrên rối loạn chuyển hóa gây bởi sự thiếu hụt estrogen

2.3 Thiết bị - hóa chất

2.3.1 Thiết bị

- Bình chiết Soxhlet

- Bồn chiết siêu âm ELMA LC60H (Germany)

- Cân phân tích METTLER TOLEDO AB-204 (Switzerland)

- Tủ sấy SANYO MOV-112 (Japan)

- Đèn soi UV-VIS Desaga Sarstedt Gruppe

- Máy ly tâm lạnh Sartorius (Germany)

- Máy xét nghiệm các chỉ tiêu sinh hóa Screen Master 3000 (Arezzo, Italy)

- Máy đọc ELISA bước sóng 450 và 620 nm hiệu Biotek Elx 808 (USA)

2.3.2 Hóa chất

- Dung môi chiết xuất dược liệu: cồn 96%, 70%, 45%, nước cất

- Hóa chất dùng trong sắc ký lớp mỏng: toluen, ethyl acetate, acid formic, H2SO410%/cồn

- Bản mỏng tráng sẵn silica gel F254, cỡ hạt 0,015-0,04 mm (Merck, Germany)

- Hóa chất trong gây mô hình chuột đường huyết cao: streptozotocin Aldrich, USA), dung dịch đệm Natri citrate

(Sigma Thuốc đối chiếu: Progynova® (17β-estradiol valerate 2 mg, Bayer Co.,Germany), diosgenin và genistein (Sigma-Aldrich, USA), Predian® (viên nén baophim chứa gliclazide 80 mg, Sanofi – Synthelabo, Việt Nam; số lô 1007003, hạndùng 27/07/2013)

- Hóa chất dùng làm tiêu bản Allen-Doisy: methanol, thuốc nhuộm Giemsa, dungdịch đệm huyết học

- Bộ kit ELISA 17β-estradiol (E2-EASIA Kit – GenWay Biotech, Inc.) gồm:

96 giếng được phủ với anti-rabbit IgG 96 giếng

Anti-estradiol; dạng đông khô 1 chai

Calibrator 0 pg/mL; dạng đông khô 1 chai

Calibrator 1-5; dạng đông khô 5 chai

Chứng 1 và 2; dạng đông khô 2 chai

Phức hợp estradiol-HRP đậm đặc 1 chai  0,5 ml

Chromogen (TMB-tetramethylbenzidine) 1 chai  1 ml

Đệm cơ chất (chứa H2O2-đệm acetate/citrate) 3 chai  21 ml

Dung dịch Stop (H2SO4 1,8 N) 1 chai  6 ml

- Bộ kit định lượng glucose (HUMAN, Germany) gồm:

RGT Thuốc thử enzyme chứa:

Đệm phosphate (pH 7,5) 100 mmol/L4-Aminophenazone 0,25 mmol/L

STD Dung dịch glucose chuẩn 100 U/L hay 5,55 mmol/L

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thử tinh khiết

2.4.1.1 Xác định độ ẩm trong dược liệu

Tiến hành: Đĩa sứ đựng mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi ở

1050C Cân chính xác 2 g bột dược liệu trên đĩa, đem sấy ở tủ sấy ở nhiệt độ 1050C

từ 2-3 giờ đến khối lượng không đổi Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm khoảng 15phút Cân và ghi kết quả Tiếp tục sấy và cân lại như trên cho đến khi nào kết quả hailần cân liên tiếp giống nhau hoặc chênh lệch nhau không quá 5 mg Thực hiện trên 3mẫu và lấy giá trị trung bình [4]

Độ ẩm dược liệu được tính theo công thức:

Trong đó:

X: tỉ lệ độ ẩm dược liệu (%)

X (a b)

a 100

a: khối lượng bột dược liệu trước lúc sấy (g)

b: khối lượng bột dược liệu sau khi sấy khô đến khối lượng không đổi (g)

Đặt chén vào lò nung ở 300 – 6000C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (trokhông còn màu đen) Dùng cặp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trongbình hút ẩm Cân và ghi lại lượng cân Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tụcnung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa Lấy chén ra, để nguội khoảng 30 phút trongbình hút ẩm rồi đem đi cân Tiếp tục làm như vậy cho đến khi kết quả 2 lần cân liêntiếp giống nhau hoặc chênh lệch nhau nhiều nhất 0,5 mg

Tro toàn phần tính trên dược liệu khô kiệt theo công thức:

Đánh giá kết quả: Dược liệu đạt yêu cầu khi độ tro toàn phần không quá

 Tro không tan trong HCl [2]

Tro không tan trong HCl là lượng cắn không tan còn lại của tro toàn phần saukhi hòa tan tro toàn phần trong HCl Dựa vào độ tro không tan trong HCl đánh giá

độ lẫn cát, đất của dược liệu

Tiến hành: Lấy chén nung đã xác định tro toàn phần ở trên, thêm vào chénnung chứa tro toàn phần 2 - 3 ml dung dịch HCl 10% Đậy nắp chén nung và đuncách thủy trong 10 phút Pha loãng phần còn lại trong chén nung với 5 ml nước cấtnóng Lọc qua giấy lọc không tro Dùng nước cất nóng tráng lấy hết tro còn đọngtrong chén và trên nắp chén Tiếp tục dùng nước cất nóng rửa tro và giấy lọc đến khidịch lọc trung tính

Cho cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô, đốt, nung, để nguội rồi cânnhư khi xác định tro toàn phần

Tro không tan trong HCl trên dược liệu khô kiệt theo công thức:

Đánh giá kết quả: Dược liệu đạt yêu cầu khi độ tro không tan trong acid không quá 2,4%

2.4.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Tiến hành định tính saponin và sapogenin (với chuẩn là diosgenin) có trong thân rễ Cát lồi