Mỗi ngày cho chuột dùng thuốc, liên tiếp 15 ngày, 24 giờ sau lần dùng thuốc cuối cùng, cân trọng lượng chuột sau thử nghiệm (B2), giết chuột và mổ lấy tử cung- (buồng trứng), đem cân lấy trọng lượng tươi.
Mở thành bụng ở vị trí trên lỗ sinh dục. Kéo tử cung-(buồng trứng) ra, loại bỏ bàng quang và niệu đạo. Loại bỏ mô liên kết giữa trực tràng và âm đạo cho đến khi thấy được mối nối giữa lỗ âm đạo và da bụng. Cắt ở vị trí trên mối nối để lấy cả phần tử cung và âm đạo ra khỏi ổ bụng. Cắt bỏ phần âm đạo ngay dưới cổ tử cung, loại bỏ mô mỡ và mô liên kết bám xung quanh [42]. Cho tử cung(-buồng trứng) vào đĩa petri có lót giấy tẩm dung dịch NaCl 0,9%, sau đó cân lấy trọng lượng tươi (A).
Phần tử cung khảo sát trọng lượng
Vị trí cắt ra khỏi cơ thể chuột
Hình 2.2: Vị trí cắt tử cung để khảo sát trọng lượng (ở chuột giảm năng sinh dục) Tính kết quả khảo sát trọng lượng tử cung-buồng trứng tính bằng mg% [5]
Trong đó:
X = A
B2 100%
B2: Thể trọng sau 14 ngày uống thuốc thử nghiệm (g) A: Trọng lượng tử cung (mg)
2.4.7.4. Khảo sát nồng độ 17β-estradiol sử dụng kỹ thuật ELISA cạnh tranh
Mỗi ngày cho chuột dùng thuốc, liên tiếp 15 ngày, 24 giờ sau lần dùng thuốc cuối cùng, tiến hành lấy máu đuôi chuột cho vào ống EDTA, ly tâm ở 3000 rpm trong 10 phút, lấy huyết tương và thực hiện các bước hướng dẫn của bộ kit 17β- estradiol (GenWay Biotech Inc.).
Chuẩn bị hóa chất
Calibrator, chứng và anti-estradiol: Pha calibrator, chứng và anti-estradiol đã được đông khô với nước cất (4 ml cho calibrator 0 (0 pg/mL), 6 ml cho anti- estradiol và 0,5 ml cho chứng và các calibrator khác). Bảo quản dung dịch đã hoàn nguyên ở 2 – 80C trong tối đa 1 tuần. Nếu cần bảo quản lâu hơn nên cho vào tủ đông và chỉ được rã đông tối đa 3 lần.
Liên hợp HRP (horseradish peroxidase)-estradiol: Hút 0,1 ml dung dịch HRP-estradiol đậm đặc cho vào một chai chứa 6 ml dung dịch đệm conjugate. Dung
dịch bền tối đa 4 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc 24 giờ ở 2 – 80C trong điều kiện tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời.
Dung dịch đệm rửa: Pha loãng 2 ml dung dịch đệm rửa với 400 ml nước cất hoặc cả chai 10 ml vào 2000 ml nước cất. Dung dịch rửa đã pha chỉ sử dụng trong ngày.
Dung dịch cơ chất (Substrate solution): Hút 0,2 ml chromogen (TMB- tetramethylbenzidine) cho vào một chai chứa 21 ml dung dịch đệm cơ chất (H2O2 - dung dịch đệm acetate/citrate). Dung dịch sau khi pha bền tối đa 15 phút ở nhiệt độ phòng, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời.
Quy trình thực hiện
1) Lấy lượng giếng đủ cho số lượng chuẩn calibrator, chứng và mẫu huyết tương. Đặt giếng vào giá đỡ.
2) Hút 50 μl chuẩn calibrator, chứng hoặc mẫu huyết tương cho vào giếng. 3) Cho 50 μl liên hợp 17β-estradiol-HRP vào mỗi giếng.
4) Cho tiếp 50 μl anti-17β-estradiol vào mỗi giếng.
5) Ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc ngang ở 700 ± 100 rpm. 6) Rửa giếng bằng máy rửa tự động (Biotek) 5 lần với 400 μl dung dịch đệm
rửa/lần.
7) Cho 200 μl dung dịch cơ chất (TMB pha trong dung dịch đệm cơ chất). 8) Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc ngang ở 700 ± 100 rpm. 9) Cho 50 μl dung dịch dừng phản ứng (H2SO4 1,8 N) vào mỗi giếng.
10) Đọc độ hấp thu ở bước sóng 450 nm (bước sóng tham khảo là 650 nm) trong vòng 1 giờ sau khi cho dung dịch dừng phản ứng.
Tính toán và tham chiếu kết quả
Tính độ hấp thu trung bình của hai lần xác định, loại bỏ những giá trị không rõ ràng.
Tính toán phần trăm kết hợp của mỗi calibrator và mẫu:
B 100 ODa 100
Với ODa: mật độ quang của calibrator hoặc mẫu OD0: mật độ quang của 0 calibrator
Sử dụng chương trình Excel vẽ đồ thị từ những giá trị phần trăm kết hợp (B/B0 100) của các mẫu calibrator (với phần trăm kết hợp của 0 calibrator là 100%) để thiết lập hàm số nồng độ của estradiol. Bằng cách nội suy giá trị (B/B0 100) của mẫu dựa trên đường chuẩn để suy ra nồng độ của estradiol có trong mẫu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.7.5. Khảo sát thể trọng chuột
Cân trọng lượng chuột trước (B1) và sau khi thử nghiệm (B2) để khảo sát sự thay đổi thể trọng các lô chuột.