2.4.1. Thử tinh khiết
2.4.1.1. Xác định độ ẩm trong dược liệu
Tiến hành: Đĩa sứ đựng mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi ở
1050C. Cân chính xác 2 g bột dược liệu trên đĩa, đem sấy ở tủ sấy ở nhiệt độ 1050C từ 2-3 giờ đến khối lượng không đổi. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm khoảng 15 phút. Cân và ghi kết quả. Tiếp tục sấy và cân lại như trên cho đến khi nào kết quả hai lần cân liên tiếp giống nhau hoặc chênh lệch nhau không quá 5 mg. Thực hiện trên 3 mẫu và lấy giá trị trung bình [4].
Trong đó:
X: tỉ lệ độ ẩm dược liệu (%)
X (a b)
a
100
a: khối lượng bột dược liệu trước lúc sấy (g)
b: khối lượng bột dược liệu sau khi sấy khô đến khối lượng không đổi (g)
2.4.1.2. Xác định độ tro
Tro toàn phần [2]
Tro toàn phần là cắn còn lại khi ta đốt cháy hoàn toàn một dược liệu. Các ion trong tro toàn phần ở dưới dạng carbonat hay oxyd.
Tiến hành: Nung một chén nung bằng sứ cho tới khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén. Cân chính xác khoảng 1 – 3 g dược liệu cho vào chén nung. Trải đều dược liệu ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi dược liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói.
Đặt chén vào lò nung ở 300 – 6000C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dùng cặp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi lại lượng cân. Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa. Lấy chén ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm rồi đem đi cân. Tiếp tục làm như vậy cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp giống nhau hoặc chênh lệch nhau nhiều nhất 0,5 mg.
Tro toàn phần tính trên dược liệu khô kiệt theo công thức:
Trong đó:
A (a b)
c (c h) 100
A%: Tro toàn phần của dược liệu (%) a: Khối lượng chén có tro (g)
b: Khối lượng chén không (g) c: Khối lượng dược liệu dùng (g) h: Độ ẩm của dược liệu (%).
12%.
Đánh giá kết quả: Dược liệu đạt yêu cầu khi độ tro toàn phần không quá
Tro không tan trong HCl [2]
Tro không tan trong HCl là lượng cắn không tan còn lại của tro toàn phần sau khi hòa tan tro toàn phần trong HCl. Dựa vào độ tro không tan trong HCl đánh giá độ lẫn cát, đất của dược liệu.
Tiến hành: Lấy chén nung đã xác định tro toàn phần ở trên, thêm vào chén nung chứa tro toàn phần 2 - 3 ml dung dịch HCl 10%. Đậy nắp chén nung và đun cách thủy trong 10 phút. Pha loãng phần còn lại trong chén nung với 5 ml nước cất nóng. Lọc qua giấy lọc không tro. Dùng nước cất nóng tráng lấy hết tro còn đọng trong chén và trên nắp chén. Tiếp tục dùng nước cất nóng rửa tro và giấy lọc đến khi dịch lọc trung tính.
Cho cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô, đốt, nung, để nguội rồi cân như khi xác định tro toàn phần.
Tro không tan trong HCl trên dược liệu khô kiệt theo công thức:
Trong đó:
A (a b)
c (c h) 100
A: Tro không tan trong HCl (%) a: Khối lượng chén có tro (g) b: Khối lượng chén không (g)
c: Khối lượng mẫu thử dùng (đã trừ độ ẩm) (g) h: Độ ẩm của duợc liệu
Đánh giá kết quả: Dược liệu đạt yêu cầu khi độ tro không tan trong acid không quá 2,4%.
2.4.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Tiến hành định tính saponin và sapogenin (với chuẩn là diosgenin) có trong thân rễ Cát lồi.
Lấy khoảng 50 mg saponin thô cho vào ống nghiệm có nắp vặn. Thêm khoảng 5 ml HCl 10%. Đậy kín ống nghiệm, đun cách thủy 30 phút, 1000C. Sau khi thủy phân xong, lấy ra để nguội, cho vào ống 5 ml CHCl3, lắc kỹ. Dùng pipette Pasteur hút lấy lớp CHCl3 (lớp dưới) thu được sapogenin [4].
Mẫu: (1) cao tổng Cát lồi, (2) saponin toàn phần từ Cát lồi, (3) sapogenin (saponin thủy phân) từ Cát lồi và (4) chuẩn diosgenin.
Hòa các mẫu với methanol và tiến hành chạy sắc ký với hệ dung môi khai triển là toluen: ethyl acetate: acid formic (12:6:1) [51]. Phát hiện vết chất khi soi dưới tia tử ngoại λ=365nm, λ=254nm. Hiện màu vết chất bằng thuốc thử H2SO4 10% / cồn, phun, sấy 5 phút ở 1050C.
2.4.3. Định lượng saponin bằng phương pháp cân
Định lượng saponin thô trong dược liệu bằng phương pháp cân Namba [40] (Hình 2.1): cân chính xác m (g) dược liệu, chiết bằng cồn 70% bằng phương phấp ngấm kiệt cho đến kiệt saponin. Dịch chiết được cô giảm áp tới cắn. Hòa lượng nước gấp 10 lần. Dịch nước được lắc với diethyl ether cho đến khi nhạt màu hoặc không màu. Lớp nước được lắc với n-butanol bão hoà nước đến kiệt saponin (kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi: CHCl3:MeOH:H2O - lớp dưới). Rửa nước cất lớp n-butanol (khoảng 3 lần). Cô giảm áp dịch n-butanol tới cắn, làm khô trong tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi, thu được saponin toàn phần. Sau đó tiến hành cân và tính hàm lượng saponin trong dược liệu.
Định lượng saponin trong cao tổng Cát lồi: cân m1 (g) cao tổng (chiết bằng cồn 96%, 45% và nước cất) và hòa với lượng nước cất gấp 10 lần. Sau đó tiến hành tương tự như trên, tính hàm lượng saponin trong cao tổng.
Hàm lượng saponin thô được tính bằng công thức:
Trong đó:
X % a
d (d A)
Y % a d
Y%: khối lượng saponin toàn phần tính theo dược liệu hoặc cao sử dụng A: độ ẩm dược liệu hoặc cao tổng
a: khối lượng saponin toàn phần
d: khối lượng dược liệu (m) hoặc cao tổng (m1) ban đầu
Hình 2.1: Sơ đồ chiết saponin toàn phần
2.4.4. Định lượng diosgenin trong dược liệu bằng HPLC-MS
Hai loại cao chiết (cao tổng và saponin toàn phần) được gởi phân tích sắc ký lỏng ghép nối khối phổ – HPLC-MS tại Phòng Thí nghiệm Phân tích trung tâm (PTN PTTT) - trường Đại học Khoa học tự nhiên.
Tóm tắt quy trình định lượng diosgenin (dựa vào quy trình riêng của PTN PTTT)
Cân m (g) cao chiết, hòa tan cao chiết bằng hỗn hợp MeOH-H2O. Sau đó thêm acid HCl (1:3) vào và thủy phân bằng cách đun cách thủy trong 30 phút. Sau khi thủy phân, chiết tiếp bằng chloroform và cô quay.
Sau khi cô quay thu được cao chiết, tiến hành phân tích HPLC-MS với hệ thống máy HPLC (High performance liquid chromatography) là Agilent 1200 và MS (Mass spectrometry) là micrOTOF-Q (Bruker). Điều kiện chạy máy: pha động MeOH : H2O (95:5) chứa 0,1% acid formic, cột C18 với tốc độ dòng 0,5 ml/phút.
2.4.5. Khảo sát độc tính cấp diễn đường uống và liều cho uống
Nghiên cứu độc tính cấp của mẫu thử trên động vật thí nghiệm, chủ yếu là xác định liều chết trung bình nếu có (liều làm chết 50% số con vật thí nghiệm = LD50 lethal dose 50%) trong những điều kiện nhất định. Biết LD50 mới xác định được chỉ số điều trị TI là một thông số rất quan trọng để quyết định liều điều trị, thường là khoảng 1/10 LD50 hoặc nhỏ hơn. Chỉ số điều trị TI (therapeutic index) là
tỉ số giữa liều chết trung bình LD50 và liều hữu hiệu trung bình ED50: TI =
LD50
ED50
Điều kiện: TI ≥ 10 [3]
Cho chuột uống các loại cao ở liều tối đa mà thuốc có thể bơm qua kim (với thể tích 0,2 ml/10 g thể trọng) [1]. Cao thuốc được đưa vào dạ dày chuột bằng một kim cong đầu tù qua đường miệng. Theo dõi và ghi nhận tình trạng chuột và số chuột chết trong vòng 72 giờ. Có 3 trường hợp xảy ra [3], [7]:
Trường hợp 1: nếu cho chuột uống cao thuốc mà không có con nào chết thì ta
tìm được liều cao nhất bơm qua kim mà không làm chết chuột, được ký hiệu là Dmax và liều tương đối an toàn Ds dùng cho thực nghiệm dược lý là 1/5 Dmax hoặc lớn hơn.
Trường hợp 2: nếu cho chuột uống mà tỉ lệ chết là 100% thì đây là liều chết
tuyệt đối (LD100). Ta tiếp tục tìm liều tối đa mà không có con vật nào chết, gọi là liều dưới liều chết (infralethal dose) và được ký hiệu là LD0. Sau đó suy ra liều LD50. LD50 được tính theo phương pháp Karber-Behrens.
Trường hợp 3: nếu đã thử đến liều có động vật thí nghiệm chết, nhưng không
có liều nào đạt mức độ chết 100%. Khi đó tuy không xác định được LD50, nhưng vẫn xác định được liều LD0. Liều tương đối an toàn Ds dùng cho thực nghiệm dược lý được lấy giá trị bằng 1/5 - 1/10 LD0.
Sau khi tìm được các liều thử nghiệm, tiến hành khảo sát 2 tác dụng: (1) tác dụng kiểu estrogen trên các đối tượng: chuột cái non, chuột cái bình thường trưởng thành và chuột giảm năng sinh dục; (2) tác dụng giảm đường huyết trên chuột giảm năng sinh dục-tiêm streptozotocin.
2.4.6. Phương pháp gây mô hình giảm năng sinh dục
Dụng cụ giải phẫu được sát trùng bằng cồn 70%. Chuột nhắt cái được gây mê bằng ether, cắt hai đường dài khoảng 0,3-0,5 cm ngang lưng chuột ở hai bên trái và phải tính từ đốt sống thứ tư và kéo hai buồng trứng ra ngoài. Dùng chỉ cột phần ống dẫn trứng lại sau đó cắt bỏ hai buồng trứng. Khâu vết mổ bằng chỉ vô trùng và sát trùng vết mổ bằng dịch cồn iod (Povidine). Chuột sau khi đã cắt hai buồng trứng được chăm sóc cẩn thận trong hai tuần trước khi tiến hành các thử nghiệm.
Chuột sau khi được nghỉ ngơi, chăm sóc 2 tuần sau phẫu thuật, tiến hành kiểm tra estrogen nội sinh đã được loại bỏ hết hay không và khả năng phục hồi của chuột (bằng phương pháp Allen-Doisy được trình bày ở phần sau). Sau đó dùng những con chuột được chọn để tiến hành thử nghiệm chính thức.
Cách kiểm tra như sau: Lấy vết phết âm đạo 5 ngày liên tiếp, loại bỏ những con có dấu hiệu động dục dương tính trong 3 ngày cuối. Mỗi con được cho uống 1 liều estrogen mồi (Propynova® 0,5 mg/kg pha trong dầu olive), lấy vết phết âm đạo trong vòng 3 ngày liên tiếp, loại bỏ những con không có dấu hiệu động dục (không có đáp ứng).
2.4.7. Khảo sát tác dụng kiểu estrogen
Tác dụng kiểu estrogen được xác định trên 3 chỉ tiêu ở 3 đối tượng chuột: (1) sự xuất hiện giai đoạn động dục đầu tiên (ở chuột non) hoặc tỉ lệ động dục dương tính (ở chuột trưởng thành bình thường và chuột giảm năng sinh dục), (2) trọng lượng tử cung-buồng trứng (ở chuột non, trưởng thành bình thường) hoặc tử cung (ở chuột giảm năng sinh dục) và (3) nồng độ estradiol trong huyết tương (ở chuột giảm năng sinh dục).
Mỗi đối tượng chuột được chia thành các nhóm: nhóm chứng (lô uống nước cất và lô uống olive), nhóm đối chiếu (các lô uống Progynova®, diosgenin và lô tiêm dưới da genistein) và nhóm thử nghiệm (uống các cao thử nghiệm).
Chuột non: chuột được cho uống các liều thử nghiệm trong 15 ngày. Khảo sát sự mở âm đạo ở chuột mỗi ngày từ ngày 1 cho đến khi âm đạo mở (chu kỳ động dục đầu tiên), ghi nhận ngày quan sát được. So sánh thời gian trung bình xuất hiện
sự mở âm đạo giữa các lô thử nghiệm. 24 giờ sau lần cho uống cuối cùng, tiến hành giết chuột, mổ lấy tử cung-buồng trứng và cân lấy trọng lượng tươi (wet weight) tính bằng mg% theo phương pháp của Astwood. So sánh trọng lượng tử cung-buồng trứng giữa các lô thử nghiệm.
Chuột trưởng thành bình thường: chuột cũng được cho uống trong 15 ngày. Tiến hành lấy phết âm đạo mỗi ngày từ ngày 1 đến ngày 14 để khảo sát chu kỳ động dục theo phương pháp Allen-Doisy (1923). Từ đó tính tỉ lệ % động dục và so sánh tỉ lệ giữa các lô với nhau. 24 giờ sau lần cho uống cuối cùng tiến hành mổ chuột lấy tử cung-buồng trứng và đem cân tương tự như ở chuột non.
Chuột giảm năng sinh dục: chuột được cho uống trong 15 ngày. Từ ngày 7 đến ngày 14 tiến hành lấy phết âm đạo để khảo sát chu kỳ động dục. 24 giờ sau lần cho uống cuối cùng, tiến hành lấy máu định lượng 17β-estradiol bằng phương pháp ELISA cạnh tranh. Sau đó tiến hành mổ chuột và cân trọng lượng tử cung.
2.4.7.1. Phương pháp khảo sát chu kỳ động dục đầu tiên ở chuột non
Cho chuột uống trong vòng 15 ngày, quan sát trạng thái và độ mở của âm đạo để đánh giá các dấu hiệu động dục.
Bảng 2.1: Các dấu hiệu của các giai đoạn khác nhau trong chu kỳ động dục của chuột [17].
Giai đoạn trong
chu kỳ động dục Dấu hiệu của âm đạo
Diestrus Độ mở âm đạo nhỏ, các mô có màu tím xanh và ẩm ướt.
Proestrus
Âm đạo mở, các mô có màu hồng đỏ, ẩm ướt.
Có nhiều nếp gấp chạy dọc theo chiều dọc của 2 môi âm vật (the dorsal and ventral lips).
Estrus Các dấu hiệu tương tự như proestrus, nhưng các mô có màu hồng sáng hơn và ít ẩm ướt, các nếp gấp cũng rõ ràng hơn.
Metestrus
Các mô âm đạo nhạt màu và khô, môi lớn (dorsal lip) không phù như estrus, có các mảnh vỡ màu trắng chạy dọc hay bên trong âm đạo.
Đánh giá kết quả: dựa vào các dấu hiệu của giai đoạn Proestrus và Estrus để ghi nhận ngày đầu tiên của chu kỳ động dục tính từ lúc cho chuột uống liều đầu
tiên. Ghi nhận các chuột trong lô thử nghiệm, sau đó tính kết quả (số ngày xuất hiện dấu hiệu động dục tính từ ngày đầu tiên cho uống) trung bình trong mỗi lô.
2.4.7.2. Phương pháp khảo sát chu kỳ động dục
Tiến hành làm tiêu bản vết phết âm đạo: dùng ống hút bằng cao su mềm chứa sẵn một giọt nước cho vào âm đạo chuột, bơm vào và hút ra nhiều lần, cuối cùng hút lấy chất nhờn và trải lên lame [15]. Để lame khô ở nhiệt độ phòng, cố định tiêu bản bằng methanol trong 5-10 giây. Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Giemsa (1:20 trong dung dịch đệm Giemsa) trong khoảng 30 phút. Rửa tiêu bản qua dòng nước chảy, để khô và quan sát dưới kính hiển vi [5].
Bảng 2.2: Thành phần tế bào và tính chất của chất nhờn âm đạo ở các giai đoạn động dục [5] Thời kỳ Thành phần tế bào Tính chất của chất nhờn âm đạo Bạch cầu (Leucocyte) Tế bào sừng (Cornified cell ) Tế bào bì mô có nhân (Epithelial cell) Proestrus (P) - - ++++ Nhờn, trong Estrus (E) - ++++ - Lỏng, đục Metestrus (M) ++ ++ ++ Nhờn, trong Diestrus (D) ++++ - + Đặc sệt, trong
(-) Không có, (+) lượng tế bào ít, (++) lượng tế bào vừa phải, (++++) lượng tế bào nhiều
Quan sát tiêu bản bằng vật kính x10 và x40 để quan sát các thành phần của tiêu bản. Đánh giá kết quả như sau [15]:
- Giai đoạn tiền động dục (Proestrus): tế bào bì mô có nhân (nucleated epithelial cell) chiếm ưu thế, xuất hiện theo từng cụm hoặc rời rạc. Thỉnh thoảng có một số tế bào sừng (cornified cell) hiện diện trong mẫu.
- Giai đoạn động dục (Estrus): xuất hiện nhiều tế bào sừng hóa theo từng cụm. Tế bào không có nhân, bào tương có hạt và hình dạng tế bào bất thường.
- Giai đoạn gián cách động dục (Metestrus): giai đoạn này hiện diện hỗn hợp các loại tế bào trong đó bạch cầu (leucocyte) chiếm ưu thế, chỉ có một vài tế bào bì mô có nhân và/hoặc tế bào sừng hiện diện.
- Giai đoạn nghỉ ngơi (Diestrus): giai đoạn này gồm chủ yếu là bạch cầu và rải rác các tế bào bì mô.
Tính toán kết quả [5]
Tính tỷ lệ % thú vật trong lô cho phản ứng dương tính theo công thức:
Trong đó:
% Động dục S 100
n m
S: số lần xuất hiện thời kỳ Estrus và Proestrus trong toàn lô n: số súc vật trong lô
m: số lần lấy chất nhờn
2.4.7.3. Phương pháp khảo sát trọng lượng tử cung (phương pháp Atswood)
Mỗi ngày cho chuột dùng thuốc, liên tiếp 15 ngày, 24 giờ sau lần dùng thuốc cuối cùng, cân trọng lượng chuột sau thử nghiệm (B2), giết chuột và mổ lấy tử cung- (buồng trứng), đem cân lấy trọng lượng tươi.
Mở thành bụng ở vị trí trên lỗ sinh dục. Kéo tử cung-(buồng trứng) ra, loại bỏ bàng quang và niệu đạo. Loại bỏ mô liên kết giữa trực tràng và âm đạo cho đến khi thấy được mối nối giữa lỗ âm đạo và da bụng. Cắt ở vị trí trên mối nối để lấy cả phần tử cung và âm đạo ra khỏi ổ bụng. Cắt bỏ phần âm đạo ngay dưới cổ tử cung, loại bỏ mô mỡ và mô liên kết bám xung quanh [42]. Cho tử cung(-buồng trứng) vào đĩa petri có lót giấy tẩm dung dịch NaCl 0,9%, sau đó cân lấy trọng lượng tươi (A).
Phần tử cung khảo sát