3.4.3.1. Kết quả đường chuẩn 17β-estradiol
Bảng 3.11: Phần trăm kết hợp (B/B0 100) tính được từ các nồng độ chuẩn Nồng độ (pg/mL) % kết hợp
0 100.00
37 64.50
60 50.64
118 27.37
Đồ thị đường chuẩn 17beta-estradiol
120 100 80 y = 98.369e-0.0109x R2 = 0.9991 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Nồng độ (pg/mL)
Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn 17β-estradiol
3.4.3.2. Kết quả nồng độ 17β-estradiol ở nhóm chuột giảm năng sinh dục
Bảng 3.12 cho thấy chuột sau khi gây mô hình giảm năng sinh dục 30 ngày (15 ngày nghỉ ngơi và 15 ngày thử nghiệm) có nồng độ 17β-estradiol huyết tương giảm đáng kể (P<0,001) so với chuột trưởng thành bình thường.
Ở các lô được điều trị (nhóm đối chiếu và nhóm thử nghiệm), nồng độ 17β- estradiol có biểu hiện tăng so với lô chứng. Các lô Progynova® liều 0,1 và 0,5 mg/kg đều có nồng độ 17β-estradiol tăng đạt ý nghĩa thống kê (P<0,001) so với lô chứng. Genistein 25 mg/kg trong 6 ngày đều có tác dụng làm tăng nồng độ 17β-
% k ế
estradiol tuy chưa đạt ý nghĩa thống kê. Các lô uống diosgenin 100 và 200 mg/kg cũng biểu hiện tăng 17β-estradiol mặc dù chỉ có lô diosgenin 200 mg/kg là đạt ý nghĩa thống kê (P<0,05).
Bảng 3.12: Nồng độ 17β-estradiol (E2) huyết tương ở nhóm chuột giảm năng sinh dục Nhóm Lô (mg/kg)Liều Thời gian khảo sát (ngày) N Nồng độ E2 (pg/mL) Chuột bình thường Chứng Nước cất - 15 32 19,297 ± 0,952 Chuột giảm năng sinh dục Chứng Nước cất - 15 10 11,906 ± 1,046 # Cát lồi Cao tổng 740 15 10 16,577 ± 1,939 * Saponin 100 15 10 22,044 ± 2,628 * 200 15 9 16,225 ± 1,323 * Đối chiếu Progynova 0,1 15 7 40,564 ± 3,464 * 0,5 15 8 89,469 ± 11,35 * Genistein 25 6 6 22,22 ± 6,895 Diosgenin 100 15 8 13,837 ± 1,264 200 15 10 15,255 ± 1,093 *
#: P<0,001 so với lô chứng bình thường *: P<0,05 so với lô chứng nước cất
Các liều cao chiết có tác dụng estrogen điển hình trên chuột giảm năng sinh dục trong kết quả ở phần 3.4.1 và 3.4.2 được chọn để khảo sát ảnh hưởng trên nồng độ 17β-estradiol huyết tương. Bảng 3.12 cho thấy nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương của các lô chuột uống saponin hay cao tổng Cát lồi đều tăng đạt ý nghĩa thống kê so với chứng. Trong đó, tác dụng phục hồi của saponin liều 100 mg/kg trên sự suy giảm nồng độ 17β-estradiol ở chuột giảm năng sinh dục tương đương với genistein liều 25 mg/kg. Tác dụng của saponin liều 200 mg/kg và cao tổng liều
3.4.4. Khảo sát thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm
3.4.4.1. Thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột non
Ở chuột non, lô chứng nước cất, lô chứng olive và các lô đối chiếu uống Progynova® 0,1 và 0,5 mg/kg đều có thể trọng tăng đáng kể (P<0,001) sau 15 ngày thử nghiệm (Bảng 3.13). Sự tăng thể trọng ở các lô thử nghiệm uống cao tổng Cát lồi liều 740 và 1480 chậm hơn và không đạt ý nghĩa thống kê. Lô uống saponin liều 100 mg/kg cũng không có sự tăng trọng đáng kể, trong khi ở lô 200 mg/kg, thể trọng sau thử nghiệm tăng (P<0,001) so với trước thử nghiệm.
Bảng 3.13: Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột non
Nhóm Lô (mg/kg)Liều Thời gian khảo sát (ngày) N Thể trọng trước thử nghiệm (g) Thể trọng sau thử nghiệm (g) Chứng Nước cất − 15 17 20,82 ± 0,58 26,82 ± 0,43 * Dầu olive − 15 12 18,17 ± 0,44 25,50 ± 0,65 * Cát lồi Cao tổng 740 15 10 19,70 ± 0,63 21,90 ± 1,26 a 1480 15 10 19,80 ± 0,47 20,10 ± 0,57 a Saponin 50 15 8 21,00 ± 0,63 22,88 ± 1,13 a 100 15 8 22,13 ± 0,58 23,75 ± 0,77 a 200 15 9 15,00 ± 0,96 20,56 ± 1,00 *a Đối chiếu ® Progynova 0,1 7 16 17,88 ± 0,46 23,63 ± 0,72 * 0,5 7 10 19,10 ± 0,59 22,40 ± 0,78 *
*: P<0,001 so với trước thử nghiệm a: P<0,05 so với lô chứng nước cất
Thể trọng của các lô uống Cát lồi đều giảm đáng kể so với lô chứng (P<0,05), mặc dù thể trọng ở lô saponin 200 mg/kg thấp hơn so với lô chứng là do thể trọng chuột ban đầu thấp hơn.
3.4.4.2. Thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm ở chuột trưởng thành bìnhthường thường
Bảng 3.14 cho thấy ở chuột trưởng thành bình thường, thể trọng chuột sau 15 ngày ở các lô chứng hầu như không tăng so với trước thử nghiệm. Trong khi đó các
lô đối chiếu đều có thể trọng tăng sau 15 ngày thử nghiệm, với sự tăng ở các lô Progynova® 0,1 và 0,5 mg/kg trong 15 ngày, lô tiêm genistein 25 mg/kg (s.c.) trong 6 ngày và lô uống diosgenin 100 mg/kg đều đạt ý nghĩa thống kê (P<0,05), trong đó đáng chú ý là lô genistein, thể trọng tăng 5,83 g chỉ trong 6 ngày thử nghiệm.
Bảng 3.14: Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở chuột trưởng thành bình thường
Nhóm Lô Liều (mg/kg) Thời gian khảo sát (ngày) N Thể trọng trước thử nghiệm (g) Thể trọng sau thử nghiệm (g) Chứng Nước cất − 15 22 29,45 ± 1,02 29,23 ± 0,97 Dầu olive − 15 18 31,28 ± 0,88 31,94 ± 1,46 Cát lồi Cao tổng 740 15 19 28,16 ± 1,26 27,37 ± 1,13 1480 15 14 30,21 ± 1,31 28,64 ± 1,15 Saponin 50 15 9 27,25 ± 0,84 27,13 ± 1,22 100 15 9 26,56 ± 0,94 24,89 ± 0,68 a 200 15 8 23,75 ± 1,44 23,88 ± 1,09 a Đối chiếu Progynova® 0,1 15 17 28,53 ±1,24 31,24 ± 0,98 * 0,5 15 15 30,07 ± 1,66 33,80 ± 2,02 * Genistein (s.c.) 25 6 6 31,67 ± 1,38 37,50 ± 1,52 *b Diosgenin 100 15 13 33,08 ± 1,12 34,54 ± 1,20 * 200 15 11 27,73 ± 0,43 28,09 ± 0,65
*: P<0,05 so với trước thử nghiệm a: P<0,05 so với lô chứng nước cất b: P<0,05 so với lô chứng olive
Ngược lại, thể trọng ở các lô thử nghiệm uống Cát lồi lại giảm nhẹ so với trước thử nghiệm, trong đó lô saponin 200 mg/kg có thể trọng trước và sau thử nghiệm tương đương nhau. Thể trọng sau thử nghiệm ở các lô uống saponin đều thấp hơn đáng kể so với lô chứng nước cất (P<0,05), điều này có thể cũng do thể trọng chọn ban đầu thấp hơn.
3.4.4.3. Thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột giảm năng sinhdục dục
Các lô chứng (uống nước cất và uống olive) ở chuột giảm năng sinh dục đều thể hiện sự tăng trọng đáng kể sau 15 ngày (P<0,001). Các lô đối chiếu đều thể hiện sự tăng trọng đáng kể (P<0,05) chỉ trừ lô diosgenin liều 200 mg/kg là sự tăng trọng không đạt ý nghĩa thống kê.
Bảng 3.15: Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột giảm năng sinh dục
Nhóm Lô (mg/kg)Liều Thời gian khảo sát (ngày) N Thể trọng trước thử nghiệm (g) Thể trọng sau thử nghiệm (g) Chứng Nước cất - 15 16 28,94 ± 0,65 32,06 ± 0,96 * Dầu olive - 15 15 30,47 ± 0,94 34,27 ± 1,01 * Cát lồi Cao tổng 740 15 15 31,73 ± 1,49 29,47 ± 1,13 * 1480 15 14 27,93 ± 0,92 27,36 ± 1,15 a Saponin 50 15 10 27,50 ± 1,28 29,60 ± 0,85 100 15 11 30,64 ± 0,61 30,27 ± 0,60 200 15 12 33,75 ± 0,78 30,25 ± 0,54 * Đối chiếu Progynova® 0,1 15 15 31,27 ± 1,11 34,87 ± 1,20 * 0,5 15 15 29,80 ± 0,84 34,33 ± 1,61 * Genistein 25 6 6 36,33 ± 1,69 39,83 ± 2,18 *b Diosgenin 100 15 14 31,50 ± 0,69 33,93 ± 0,84 * 200 15 16 33,94 ± 1,44 35,88 ± 1,35
*: P<0,05 so với trước thử nghiệm a: P<0,05 so với lô chứng nước cất b: P<0,05 so với lô chứng olive tương ứng
Các lô uống Cát lồi ở đây cũng không thể hiện sự tăng thể trọng. Lô uống cao tổng liều 740 mg/kg và lô uống saponin liều 200 mg/kg có thể trọng giảm đáng kể (P<0,05). Thể trọng sau 6 ngày thử nghiệm ở lô genistein 25 mg/kg tăng đáng kể (P<0,05) so với lô chứng olive. Ngoài ra, thể trọng sau 15 ngày thử nghiệm ở lô cao tổng liều 1480 mg/kg thấp hơn đạt ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với lô chứng nước cất.
3.4.5. Bàn luận
Hiện nay, các phương pháp in vivo được những nghiên cứu về tác dụng estrogen sử dụng bao gồm phương pháp chuột trưởng thành giảm năng sinh dục và chuột chưa trưởng thành (chuột non). Thông qua những cuộc kiểm nghiệm đánh giá của OECD, cả hai phương pháp đều mang tính nhạy và tái sản xuất (reproducibility) có thể so sánh được [42].
Chuột non có hệ thống trục H-P-G nguyên vẹn nên bao hàm một phạm vi nghiên cứu rộng hơn so với chuột giảm năng sinh dục bởi vì nó có thể đáp ứng với những hợp chất có tương tác với trục H-P-G hơn là chỉ tương tác với thụ thể estrogen. Trục H-P-G ở chuột cống đạt được chức năng vào khoảng 15 ngày tuổi. Khi con cái bắt đầu dậy thì, trước khi xuất hiện sự mở âm đạo nó đã có một vài chu kỳ im lặng mà không gây ra sự mở âm đạo hay rụng trứng, nhưng nó vẫn có một số dao động về hormone. Nếu một hợp chất kích thích trục H-P-G một cách trực tiếp hay gián tiếp, chuột sẽ có biểu hiện dậy thì, rụng trứng và mở âm đạo sớm. Tuy nhiên, không chỉ những hóa chất tác động lên trục H-P-G mới có tác dụng, một số khẩu phần ăn giàu năng lượng cũng sẽ gây ra sự tăng trưởng và kích thích sự mở âm đạo mà không liên quan đến hoạt động estrogen. Những hợp chất này sẽ không có đáp ứng kích thích tử cung trên chuột giảm năng sinh dục do trục H-P-G ở những con này đã không còn hoạt động [42]. Do vậy, cần thiết phải khảo sát tác dụng kiểu estrogen của một hợp chất trên cả hai đối tượng này. Ngoài ra, đối tượng chuột trưởng thành bình thường được sử dụng để khảo sát tác dụng không mong muốn trên cơ địa bình thường của các hợp chất thử nghiệm.
Đề tài sử dụng các loại thuốc và hợp chất bao gồm Progynova®, genistein và diosgenin nhằm đối chiếu tác dụng của các cao thử nghiệm với estradiol tổng hợp (estradiol valerate có trong Progynova®), với một phytoestrogen mạnh – genistein và với một phytoestrogen được cho là hoạt chất chính trong Cát lồi – diosgenin.
Ở chuột trưởng thành bình thường và chuột giảm năng sinh dục được điều trị với estrogen tổng hợp Progynova® liều 0,1 và 0,5 mg/kg (p.o.) đều có biểu hiện tăng rõ rệt tỉ lệ động dục dương tính, tăng trọng lượng tử cung(-buồng trứng) và thể
trọng so với các lô chứng và thử nghiệm. Ở chuột non, lô Progynova® liều 0,1 và 0,5 mg/kg có thời gian xuất hiện sự động dục sớm hơn các lô chứng và lô thử nghiệm. Ở chuột giảm năng sinh dục, nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương ở các lô Progynova® tăng rõ rệt so với các lô chứng và lô thử nghiệm.
Viên nén Progynova® (Bayer Co., Germany) chứa estradiol valerate (2 mg/viên) – một ester tổng hợp của estrogen tự nhiên 17β-estradiol – được sử dụng trong liệu pháp hormone thay thế để trị chứng mất kinh sơ cấp và thứ cấp, giảm sản tử cung (uterine hypoplasia), dùng cho những phụ nữ sau khi cắt hoặc xạ trị buồng trứng [57]. Các loại estrogen tổng hợp như vậy có tác dụng mạnh hơn do thời gian bán rã dài hơn. Khi bổ sung vào cơ thể, estrogen tổng hợp sẽ tác động trực tiếp gây tăng trưởng nội mạc tử cung (bao gồm chất nền, biểu mô mặt trong tử cung và biểu mô tuyến) và giữ nước ở nội mạc tử cung thể hiện qua chỉ tiêu trọng lượng tử cung. Kết quả gây tăng thể trọng của Progynova® tương đồng với nghiên cứu của Hartmann (1997) về tác dụng của estradiol valerate trên phụ nữ mãn kinh. Theo đó, 10 trong số 20 phụ nữ tiền và hậu mãn kinh được điều trị estradiol valerate đường uống thể hiện sự tăng thể trọng so với trước khi điều trị [26].
Genistein là một phytoestrogen thuộc nhóm isoflavone (4’,5,7-trihydroxy- isoflavone) hiện diện trong nhiều loại cây khác nhau bao gồm đậu nành. Tác dụng kiểu estrogen của genistein đã được chứng minh rộng rãi. Công bố của Santell R.C. và cs. (1997) cho thấy khẩu phần ăn chứa genistein liều 750 μg/g thức ăn làm tăng trọng lượng tử cung và hạn chế sự teo tuyến vú ở chuột cống Sprague-Dawley giảm năng sinh dục [47]. Nghiên cứu của Jefferson W.N. và cs. (2009) cũng cho thấy genistein (s.c.) ở liều 20 và 25 mg/kg có tác dụng làm tăng trọng lượng tử cung ở chuột non, và chuột trưởng thành cho uống genistin (genistein glucoside) ở các liều 12,5; 25 và 37,5 mg/kg thể hiện giai đoạn estrus kéo dài [31].
Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy có sự tương đồng với các công bố trên. Việc tiêm dưới da genistein (Sigma-Aldrich, USA) 25 mg/kg trên chuột trưởng thành bình thường và chuột giảm năng sinh dục cho kết quả tăng trọng lượng tử cung (-buồng trứng) mặc dù chỉ thể hiện rõ trên đối tượng chuột trưởng thành bình
thường. Sự tăng trọng lượng tử cung quan sát được có thể là do tác dụng của genistein gây tăng trưởng nội mạc tử cung và giữ nước ở nội mạc tử cung. Qua khảo sát nồng độ 17β-estradiol cho thấy 17β-estradiol trong huyết tương ở lô chuột giảm năng sinh dục tiêm genistein không thể hiện sự tăng đạt ý nghĩa thống kê và số liệu khá biến thiên. Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy có sự mâu thuẫn trong tác dụng của genistein trên nồng độ các hormone của buồng trứng. Một số cho thấy genistein kích thích, trong khi một số khác lại chứng tỏ genistein gây ức chế sản sinh 17β- estradiol. Sự đối lập trên có thể do khác nhau về loài khảo sát, tình trạng sinh sản của động vật thí nghiệm, liều và thời gian khảo sát, chuyển hóa phytoestrogen cũng như sinh tổng hợp steroid của mỗi cá thể [20].
Qua kết quả định tính và định lượng cho thấy thân rễ Cát lồi chứa nhiều saponin và chủ yếu là diosgenin, một sapogenin steroid được sử dụng trong công nghiệp tổng hợp các hormone steroid. Diosgenin rất được chú ý nhờ vai trò quan trọng trên sự chuyển hóa cholesterol [37]. Nghiên cứu của Singh S., Sanyal A. K. và cs. (1972) cho thấy diosgenin có tác dụng lên sự sinh tổng hợp estrogen của tuyến thượng thận ở chuột cống giảm năng sinh dục [48]. Tuyến thượng thận chính là nơi sinh tổng hợp các hormone sinh dục từ tiền chất là cholesterol và hoạt động này thể hiện rõ nhất trên cơ địa chuột đã bị cắt bỏ hoàn toàn các cơ quan sinh dục – nơi đảm trách việc sinh tổng hợp các hormone sinh dục. Kết quả khảo sát của đề tài có sự tương đồng với công bố trên, cho thấy diosgenin liều 100, 200 mg/kg có sự tăng nhẹ nồng độ 17β-estradiol mặc dù chưa rõ cơ chế của tác dụng này.
Tuy nhiên, qua các chỉ tiêu tỉ lệ động dục cũng như trọng lượng tử cung, diosgenin (Sigma-Aldrich, USA) có vẻ như không thể hiện tác dụng ở liều 100 mg/kg, thậm chí là có tác dụng đối vận với estrogen ở liều 200 mg/kg. Kết quả này không tương đồng với nghiên cứu của Aradhana, Rao A.R. và cs. (1992) trên chuột bị giảm năng sinh dục cho thấy diosgenin liều 20 và 40 mg/kg thể trọng trong 15 ngày có khả năng giúp tăng trưởng tuyến vú [9]; cũng như không tương đồng với kết quả khảo sát nồng độ 17β-estradiol ở trên. Điều này gợi ý rằng diosgenin ở nồng độ cao (100-200 mg/kg) có thể đã có tác động làm ảnh hưởng đến tác dụng của
estrogen. Như đã trình bày ở phần tổng quan, các phytoestrogen có khả năng gây ảnh hưởng đối với sự biểu hiện của các thụ thể estrogen ERα và ERβ [20]. Ở nồng độ cao, phytoestrogen được biết là gây tăng biểu hiện ERβ [20] – loại thụ thể có tính ức chế đối với hoạt động của ERα – loại thụ thể kích hoạt đáp ứng của tế bào, từ đó làm giảm tác dụng của estrogen hoặc phytoestrogen đối với tế bào.
Saponin toàn phần và cao tổng chiết từ Cát lồi thể hiện tác động estrogen trên chuột non, chuột trưởng thành bình thường và chuột giảm năng sinh dục ở các mức độ khác nhau tùy theo liều. Kết quả thể hiện sự tương đồng với nghiên cứu của Singh S. và cs. (1972) cho thấy saponin từ Cát lồi (liều 0.7 g/kg trong 10 ngày) có hoạt động theo kiểu estrogen trên chuột cống trắng giảm năng sinh dục, làm tăng đáng kể trọng lượng tử cung và nồng độ glycogen tử cung và thay đổi sự tăng sinh