Sau khi đã tìm được liều có tác dụng, tiến hành thử nghiệm các liều này trên mô hình chuột giảm năng sinh dục-tiêm streptozotocin (ký hiệu: STZ) nhằm khảo sát tác dụng giảm đường huyết.
Chuột được chia thành các nhóm và lô như bảng 2.3.
Bảng 2.3: Phân lô chuột trong mô hình giảm năng sinh dục-đường huyết cao
Nhóm Lô
Chứng bình thường Bình thường-Nước cất
Chứng bệnh lý
Bình thường-tiêm STZ-Nước cất Giảm năng sinh dục (GNSD)-Nước cất GNSD-tiêm STZ-Nước cất
GNSD-tiêm STZ-Dầu olive
Thử nghiệm GNSD-tiêm STZ-Cao tổng Cát lồi GNSD-tiêm STZ-Saponin Cát lồi
Đối chiếu
GNSD-tiêm STZ-Progynova® GNSD-tiêm STZ-Diosgenin GNSD-tiêm STZ-Gliclazide
Chuột giảm năng sinh dục được cho nghỉ 2 tuần sau phẫu thuật và được kiểm tra đường huyết trước khi thử nghiệm. Tiến hành gây mô hình đái tháo đường thực nghiệm bằng STZ (liều 50 mg/kg hòa tan trong đệm citrate, i.p.) và cho uống thuốc
mỗi ngày từ ngày 0 đến ngày 14. Các lô chứng được tiêm dung dịch đệm citrate thay cho STZ. Tiến hành lấy máu và định lượng đường huyết chuột ở trạng thái đói (fasting glucose) trong 16 giờ. So sánh đường huyết của các lô thử nghiệm với các lô chứng và đối chiếu.
Phương pháp đo đường huyết (GOD-PAP)
Đường huyết được đo bằng phương pháp của Teuscher A. và cs. (1971) và được cải thiện bởi Barham D. Và Trinder P. (1972), gọi là phương pháp GOD-PAP (glucose oxidase – phenol 4-aminophenazone peroxidase).
Mẫu máu thu được đem ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu huyết tương. Mẫu huyết tương sau đó được đo nồng độ đường huyết bằng bộ kit glucose liquicolor (Human).
Glucose được xác định sau sự oxi hóa theo cơ chế enzym với sự hiện diện của glucose oxidase (ký hiệu GOD). H2O2 được tạo thành, dưới sự xúc tác của peroxidase sẽ phản ứng với phenol và 4-aminophenazone cho ra sản phẩm quinoneimine có màu tím đỏ.
Glucose + O2 + H2O GOD Acid gluconic + H2O2
2H2O2 + 4-aminophenazon + phenol Peroxidase Quinoneimine + 4 H2O
Chuẩn bị thuốc thử
Thuốc thử RGT và chuẩn STD sẵn sàng để sử dụng. Thuốc thử ổn định cho đến hết hạn sử dụng ghi trên chai khi được bảo quản ở 2 – 80C, ổn định trong 2 tuần khi được bảo quản ở 15 – 250C. Tránh sự nhiễm khi mở chai.
Quy trình phân tích
Ống mẫu Ống chuẩn
Mẫu thử (µl) 10 -
Chất chuẩn STD (µl) - 10
Thuốc thử RGT (µl) 1000 1000
Trộn đều, ủ 10 phút ở 20-250C hoặc 5 phút ở 370C. Đo mật độ quang ( A) ở bước sóng 500 nm trong vòng 60 phút với máy xét nghiệm các chỉ số sinh hóa Screen Master 3000 (Arezzo, Italy).
Nồng độ đường huyết được tính theo công thức:
C (mg/dl) = 100 x ( A mẫu / A chuẩn) hay C (mmol/l) = 5.55 x ( A mẫu / A chuẩn)