1.3.3.1. Phytoestrogen và ER
Như đã trình bày ở các phần trên, ERα và ERβ đóng vai trò là những nhân tố phiên mã được hoạt hóa bởi ligand, chúng khởi sự phiên mã bằng cách đi vào nhân và gắn với ERE (estrogen response element) trên vùng promoter của các gene mục tiêu. Tác động của ERα và ERβ trên sự phiên mã gene có thể đối lập nhau tùy thuộc vào tình cảnh của tế bào. Người ta cho rằng ERβ có thể tác động lên hoạt động estrogen bằng cách điều biến trực tiếp sự phiên mã gene hoặc điều biến hoạt động của ERα trên những mô mà biểu hiện cả hai loại ER. ERβ có thể đóng vai trò là một tác nhân ức chế hoặc hoạt hóa sự phiên mã tùy theo nồng độ của chất đồng vận, do đó kiểu mẫu biểu hiện gene sẽ khác nhau ở những nồng độ chất đồng vận khác nhau. Sự tương tác giữa hai loại ER và những đồng nhân tố (cofactor) đặc trưng của chúng cung cấp một nền tảng cho hoạt động theo kiểu chọn lọc mô của estrogen.
Rất nhiều phytoestrogen, bao gồm resveratrol, genistein, daidzein và quercetin, đã được chứng tỏ là gắn với cả ERα lẫn ERβ và gây ra sự phiên mã các gene mục tiêu của estrogen theo kiểu tùy thuộc vào liều. Tuy nhiên, phytoestrogen gắn với ER với một ái lực thấp hơn rất nhiều so với estradiol. Ái lực của daidzein
(phytoestrogen từ đậu nành) đối với ERα và ERβ thấp hơn lần lượt là 20.000 và 500 lần so với estradiol.
Không như estradiol gắn với cả ERα và ERβ với ái lực như nhau, nhiều phytoestrogen thể hiện một ái lực cao hơn đối với ERβ. Ngoài ra, phytoestrogen gây ra sự phiên mã các gene mục tiêu của estrogen ở mức độ cao hơn nhiều khi gắn vào ERβ so với khi gắn với ERα. Bằng chứng cho thấy genistein có khuynh hướng gắn ERβ và thể hiện hoạt động gắn DNA và phiên mã mạnh hơn khi gắn với ERβ.
Tuy có ái lực thấp hơn với ER so với estradiol, nhưng một vài phytoestrogen đã được báo cáo là gây ra sự phiên mã gene từ cả ERα và ERβ ở mức độ cao hơn so với estradiol. Nghiên cứu cho thấy hoạt động phiên mã gene từ ERα bởi genistein và quercetin cao hơn lần lượt gấp 1,4 và 1,7 lần so với estradiol và gấp 2,4 và 4,5 lần so với estradiol thông qua ERβ. Thêm vào đó, sự hiện diện của estrogen nội sinh được chứng tỏ là có ảnh hưởng lên tác dụng của phytoestrogen trên sự phiên mã gene. Ví dụ, cả genistein và resveratrol đều hoạt động hỗ trợ với 17β-estradiol để kích hoạt hoạt động phiên mã trên các tế bào ung thư MCF7 (một dòng tế bào ung thư vú) gây bởi ERα và ERβ.
Do phytoestrogen có ái lực khác nhau với ERα và ERβ, tác động cuối cùng khi sử dụng một phytoestrogen nào đó có thể phụ thuộc vào kiểu mẫu biểu hiện của ERα và ERβ khác nhau trên các loại tế bào khác nhau [36].
1.3.3.2. Phytoestrogen và sự sinh tổng hợp steroid
Đa số các dữ liệu về phytoestrogen được cung cấp từ các nghiên cứu trên isoflavone từ đậu nành như genistein, daidzein, biochanin A. Các nghiên cứu dịch tễ học trên phụ nữ tiền và hậu mãn kinh và các thử nghiệm in vivo trên động vật cho thấy nhiều thành phần trong đậu nành có thể điều biến nồng độ của các hormone từ buồng trứng. Sự điều biến này có thể là trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua các gonadotropin. Khẩu phần ăn chứa isoflavone được chứng minh là có tác dụng làm giảm, tăng hoặc không thay đổi nồng độ progesterone (P4) và estradiol (E2) trong huyết thanh. Sự mâu thuẫn này có thể được giải thích bởi sự khác nhau về thời gian thử nghiệm, dạng sản phẩm đậu nành được sử dụng, dạng isoflavone và hàm lượng
của nó trong khẩu phần ăn. Hơn nữa, phương hướng và mức độ tác động của genistein và daidzein in vivo có vẻ phụ thuộc vào loài, trạng thái sinh sản của đối tượng nghiên cứu và sự chuyển hóa phytoestrogen của mỗi cá thể [20].
1.3.3.3. Phytoestrogen và sự tăng trưởng- tăng sinh tế bào
Hoạt động khác nhau của các ER cũng như ái lực cao đối với ERβ hơn với ERα của phytoestrogen ở nồng độ thấp gợi ý rằng tác dụng cuối cùng của phytoestrogen trên sự phát triển của tế bào có thể rất khác với tác dụng của estrogen.
Có rất nhiều phytoestrogen có vẻ có một tác động hai chiều trên sự tăng sinh tế bào: kích thích tăng trưởng ở nồng độ thấp và ức chế tăng trưởng ở nồng độ cao. Ở nồng độ thấp, resveratrol và quercetin kích thích sự tăng trưởng ở các tế bào MCF7 nhưng lại ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào ở nồng độ cao. Tương tự, genistein ở nồng độ thấp làm tăng trưởng tế bào nhạy với estrogen nhưng lại giảm tăng trưởng tế bào, ức chế sinh tổng hợp DNA và gây chết tế bào ở nồng độ cao.
Tác dụng trên sự tăng trưởng và tăng sinh tế bào của phytoestrogen có thể được giải thích bằng khả năng thay đổi biểu hiện một số protein điều khiển chu trình tế bào, gây hoãn chu trình tế bào (cell cycle arrest) và apoptosis [36].
1.3.3.4. Phytoestrogen và đái tháo đường
Đái tháo đường là một rối loạn về biến dưỡng phức tạp được mô tả bởi sự bất thường trong việc tiết và hoạt động của insulin, dẫn đến giảm khả năng dung nạp glucose và tăng đường huyết. Ở đái tháo đường type 1, sự rối loạn này là do sự phá hủy các tế bào β của tiểu đảo tụy do quá trình tự miễn. Trong khi ở đái tháo đường type 2 có sự kết hợp giữa sự kháng insulin ngoại vi và sự suy giảm chức năng của tế bào β [55]. Và chiến lược đầu tiên trong chữa trị đái tháo đường đó là duy trì đường huyết ở mức bình thường bởi đường huyết cao, ngoài những tác hại đã biết, có thể làm trầm trọng thêm sự kháng insulin cũng như suy giảm chức năng tiết insulin của tế bào β trong đái tháo đường type 2 [50].
Bên cạnh các loại thuốc điều trị đái tháo đường, nhiều loại thảo dược đã và đang được sử dụng nhằm hỗ trợ trong việc điều trị. Ở những phụ nữ hậu mãn kinh
mắc bệnh đái tháo đường type 2, do có bằng chứng cho thấy estrogen có vai trò trong điều hòa tính nhạy insulin ở các mô cũng như bảo vệ tế bào β [21], liệu pháp thay thế estrogen cũng như phytoestrogen được sử dụng như một liệu pháp hỗ trợ. Nhiều bằng chứng cho thấy các phytoestrogen có thể đóng vai trò có ích trong béo phì và đái tháo đường. Một vài nghiên cứu gợi ý rằng phytoestrogen, có thể do có cấu trúc tương tự 17β-estradiol, có tác động giúp cân bằng glucose, cải thiện sự tiết insulin và sự chuyển hóa lipid thông qua cả cơ chế thụ thể estrogen cũng như cơ chế không qua thụ thể [12].
1.3.4. Diosgenin
Diosgenin (25R-spriost-5-en-3β-ol), một sapogenin steroid có cấu trúc tương tự như cholesterol và estrogen, là sản phẩm thủy phân của dioscin, một saponin có trong nhiều loại cây (Hình 1.5). Diosgenin được tìm thấy ở một số loài cây bao gồm
Costus speciosus, Smilax menispermoidea, Trigonella sp., Trillium sp. và nhiều loài
thuộc chi Dioscorea - D.althaeoides, D. colletti, D. zingiberensis, D. villosa [37].
17β-estradiol Cholesterol
Diosgenin Dioscin
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của 17β-estradiol, cholesterol, diosgenin và dioscin Diosgenin được sử dụng như là nguồn nguyên liệu ban đầu cho công nghiệp tổng hợp một phần các loại thuốc ngừa thai, hormone sinh dục và các steroid khác.
Diosgenin nhận được nhiều sự quan tâm bởi nhiều đặc tính dược lý tiềm năng của nó. Một số nghiên cứu cho thấy diosgenin mang lại nhiều lợi ích như ngăn ngừa bệnh tim mạch, ung thư, kháng viêm và ngừa thai [37].
Do có cấu trúc tương tự như estrogen, diosgenin được giả thuyết là có tác dụng kiểu estrogen (estrogenic-like effect) [53]. Sản phẩm kem hoặc thực phẩm bổ sung từ củ mài dại Dioscorea villosa (wild yam), chứa diosgenin và một số hợp chất khác, được quảng cáo như là một sự thay thế cho liệu pháp estrogen dùng để trị những rối loạn ở phụ nữ tiền mãn kinh. Tuy nhiên vẫn chưa có đủ bằng chứng chứng minh tác dụng estrogen này là của riêng diosgenin. Do vậy, việc khảo sát tác dụng estrogen của diosgenin là rất cần thiết.
Ngoài ra, diosgenin còn có vai trò có ích trong các loại rối loạn chuyển hóa bao gồm cả đái tháo đường. Diosgenin có tác dụng giảm đường huyết và kháng oxy hóa tốt [37] cũng như giúp giảm cholesterol, tăng nồng độ HDL trong máu [44].
1.3.5. Các phương pháp đánh giá tác dụng estrogen của phytoestrogen
Do tác dụng kiểu estrogen mang bản chất phức tạp nên đến nay vẫn chưa có một thử nghiệm đơn lẻ nào có thể bao hàm tất cả phạm vi của nó. Thay vào đó, người ta sử dụng một vài thử nghiệm in vitro và in vivo để đánh giá hoạt tính estrogen của các hợp chất.
Những thử nghiệm gắn ER in vitro cung cấp thông tin về khả năng của các phytoestrogen trong việc tương tác với các ER, gắn với ERE (estrogen responsive element) trên promoter của gene mục tiêu sau khi tạo phức hợp ligand-ER và tương tác giữa các tác nhân đồng hoạt hóa (co-activator) và các ER theo kiểu phụ thuộc ligand. Ngoài ra, các thử nghiệm chuyển hoạt hóa (transactivation) trên tế bào giúp dò tìm sự kích hoạt gene thông qua ER. Những phân tích sinh hóa in vitro có thể được sử dụng để kiểm tra tác động khả dĩ trên hoạt động của protein. Thử nghiệm E- screen dùng để đo lường đáp ứng tăng sinh hoặc kháng tăng sinh trên những tế bào đáp ứng với estrogen.
Tuy nhiên, để đánh giá hoạt tính estrogen trên mô hoặc cơ quan phải cần đến phương pháp in vivo. Ở động vật cái, thử nghiệm bổ tử cung (uterotrophic assay) có
tính ứng dụng khi cần khảo sát tính đồng vận hay đối vận đối với ERα của hợp chất thử nghiệm trên đối tượng động vật trưởng thành giảm năng sinh dục hoặc động vật non. Ngoài ra, hoạt tính estrogen trên tuyến vú có thể được khảo sát thông qua sự kéo dài ống tuyến và thay đổi cấu tạo của núm vú ở những động vật non hoặc gần dậy thì. Ở con đực, thử nghiệm Hershberger trên chuột cống gần dậy thì-thiến có thể được sử dụng để kiểm tra đáp ứng (anti)androgen hoặc (anti)estrogen trên những tuyến sinh dục thứ cấp và các mô khác được điều hòa bởi hormone. Bên cạnh những thử nghiệm ngắn hạn này, các thử nghiệm độc tính đối với sinh sản (reproductive toxicity) mạn tính và cận cấp tính cũng như các nghiên cứu hai thế hệ có thể được sử dụng cho phytoestrogen để xác nhận tính an toàn khi sử dụng dài hạn [46].
Ngoài ra, một vài nghiên cứu trên phytoestrogen còn sử dụng phương pháp khảo sát chu kỳ động dục cũng như sự mở âm đạo sớm ở chuột non [31].
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu và phương pháp chiết xuất
Thân rễ cây Cát lồi (Costus speciosus) thu hái vào tháng 4 ở Vườn Bảo tồn Dược liệu của Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM được phơi khô và xay thành bột mịn. Nguyên liệu được kiểm định bởi Bộ môn Tài nguyên-Thực vật, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. HCM.
Các dạng cao chiết và hợp chất chiết xuất từ nguyên liệu để thử nghiệm gồm: Cao chiết tổng Cát lồi (cồn 95%, 45%, nước cất): được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:10 trong 72 h đối với từng dung môi, sau đó cho cô giảm áp và đông khô thu được cao chiết. Hiệu suất chiết của cao tổng là 8,81%.
Saponin toàn phần: dược liệu được chiết ngấm kiệt bằng cồn 70% (tỉ lệ
1:15). Dịch chiết được cô tới cắn, thêm nước, lắc với diethylether cho đến khi dịch ether không màu. Loại bỏ dịch ether, tiếp tục lắc dịch nước với n-butanol bão hoà nước cho đến khi lớp n-butanol nhạt màu hoặc mất màu. Dịch n-butanol được cô giảm áp tới cắn thu được saponin toàn phần. Hiệu suất chiết của saponin là 4,66%.
2.2. Đối tượng nghiên cứu
Chuột nhắt trắng cái chủng Swiss albino, non và trưởng thành, được cung cấp bởi Viện Vắcxin và Sinh phẩm Y tế - TP Nha Trang. Chuột được để ổn định 1 tuần trước khi thử nghiệm. Thể tích cho uống hoặc tiêm phúc mô (i.p.) là 10 ml/kg thể trọng chuột.
Chuột non được chọn là chuột 3-4 tuần tuổi, trọng lượng 18 ± 2 g. Chuột trưởng thành được chọn là chuột từ 7-8 tuần tuổi, trọng lượng 28 ± 2 g.
Chuột trưởng thành được gây mô hình giảm năng sinh dục bằng phẫu thuật cắt hai buồng trứng để khảo sát tác dụng estrogen của mẫu thử. Chuột được gây mô hình giảm năng sinh dục đi kèm với gây tăng đường huyết bằng streptozotocin liều 50 mg/kg i.p. vào tuần thứ ba (hai tuần sau khi cắt) để khảo sát tác dụng của mẫu thử trên rối loạn chuyển hóa gây bởi sự thiếu hụt estrogen.
2.3. Thiết bị - hóa chất2.3.1. Thiết bị 2.3.1. Thiết bị
- Bình chiết Soxhlet
- Bồn chiết siêu âm ELMA LC60H (Germany)
- Cân phân tích METTLER TOLEDO AB-204 (Switzerland) - Tủ sấy SANYO MOV-112 (Japan)
- Đèn soi UV-VIS Desaga Sarstedt Gruppe - Máy ly tâm lạnh Sartorius (Germany)
- Máy xét nghiệm các chỉ tiêu sinh hóa Screen Master 3000 (Arezzo, Italy) - Máy đọc ELISA bước sóng 450 và 620 nm hiệu Biotek Elx 808 (USA)
2.3.2. Hóa chất
- Dung môi chiết xuất dược liệu: cồn 96%, 70%, 45%, nước cất.
- Hóa chất dùng trong sắc ký lớp mỏng: toluen, ethyl acetate, acid formic, H2SO4 10%/cồn.
- Bản mỏng tráng sẵn silica gel F254, cỡ hạt 0,015-0,04 mm (Merck, Germany). - Hóa chất trong gây mô hình chuột đường huyết cao: streptozotocin (Sigma-
Aldrich, USA), dung dịch đệm Natri citrate.
- Thuốc đối chiếu: Progynova® (17β-estradiol valerate 2 mg, Bayer Co., Germany), diosgenin và genistein (Sigma-Aldrich, USA), Predian® (viên nén bao phim chứa gliclazide 80 mg, Sanofi – Synthelabo, Việt Nam; số lô 1007003, hạn dùng 27/07/2013).
- Hóa chất dùng làm tiêu bản Allen-Doisy: methanol, thuốc nhuộm Giemsa, dung dịch đệm huyết học.
- Bộ kit ELISA 17β-estradiol (E2-EASIA Kit – GenWay Biotech, Inc.) gồm: 96 giếng được phủ với anti-rabbit IgG 96 giếng
Anti-estradiol; dạng đông khô 1 chai Calibrator 0 pg/mL; dạng đông khô 1 chai Calibrator 1-5; dạng đông khô 5 chai
Chứng 1 và 2; dạng đông khô 2 chai
Phức hợp estradiol-HRP đậm đặc 1 chai 0,5 ml
Đệm phức hợp 3 chai 6 ml
Đệm rửa 1 chai 10 ml
Chromogen (TMB-tetramethylbenzidine) 1 chai 1 ml Đệm cơ chất (chứa H2O2-đệm acetate/citrate) 3 chai 21 ml Dung dịch Stop (H2SO4 1,8 N) 1 chai 6 ml - Bộ kit định lượng glucose (HUMAN, Germany) gồm:
RGT Thuốc thử enzyme chứa:
Đệm phosphate (pH 7,5) 100 mmol/L 4-Aminophenazone 0,25 mmol/L
Phenol 0,75 mmol/L
Glucose oxidase 15 KU/L
Peroxidase 1,5 KU/L
Mutarotase 2,0 KU/L
Sodium azide 0,095%
Các chất ổn định
STD Dung dịch glucose chuẩn 100 U/L hay 5,55 mmol/L
2.4. Phương pháp nghiên cứu2.4.1. Thử tinh khiết 2.4.1. Thử tinh khiết
2.4.1.1. Xác định độ ẩm trong dược liệu
Tiến hành: Đĩa sứ đựng mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi ở
1050C. Cân chính xác 2 g bột dược liệu trên đĩa, đem sấy ở tủ sấy ở nhiệt độ 1050C từ 2-3 giờ đến khối lượng không đổi. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm khoảng 15 phút. Cân và ghi kết quả. Tiếp tục sấy và cân lại như trên cho đến khi nào kết quả hai lần cân liên tiếp giống nhau hoặc chênh lệch nhau không quá 5 mg. Thực hiện trên 3 mẫu và lấy giá trị trung bình [4].
Trong đó:
X: tỉ lệ độ ẩm dược liệu (%)
X (a b)
a
100
a: khối lượng bột dược liệu trước lúc sấy (g)
b: khối lượng bột dược liệu sau khi sấy khô đến khối lượng không đổi (g)
2.4.1.2. Xác định độ tro
Tro toàn phần [2]
Tro toàn phần là cắn còn lại khi ta đốt cháy hoàn toàn một dược liệu. Các ion trong tro toàn phần ở dưới dạng carbonat hay oxyd.
Tiến hành: Nung một chén nung bằng sứ cho tới khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén. Cân chính xác khoảng 1 – 3 g dược liệu cho vào chén nung. Trải đều dược liệu ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi dược liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói.
Đặt chén vào lò nung ở 300 – 6000C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dùng cặp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong