Nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào trên dòng tế bào hep g2 của cao chiết từ lá cây sen nelumbo nucifera

Bệnh béo phì, tế bào Hep - G2 sử dụng trong nghiên cứu béo phì, sự tích tụ lipid nội bào .... Từ lâu đã có nhiều thuốc điều trị béo phì ra đời, tuy nhiên ngoài tác dụng chính, các thuốc

- -

BÙI THỊ THANH HƯƠNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TÍCH TỤ LIPID NỘI BÀO TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEP - G2 CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY SEN

NELUMBO NUCIFERA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

- -

BÙI THỊ THANH HƯƠNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TÍCH TỤ LIPID NỘI BÀO TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEP - G2 CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY SEN

1 Bộ môn Dược học cổ truyền

2 Khoa Dược lý – Sinh hóa

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới:

Th.S Phạm Thái Hà Văn - giảng viên bộ môn Dược học cổ truyền - Trường Đại Học Dược Hà Nội - người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên

và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài

Th.S Phí Thị Xuyến, TS Phạm Thị Nguyệt Hằng - Cán bộ phòng Dược

lý - Sinh hóa - Viện Dược liệu đã giúp đỡ em nhiều kiến thức bổ ích và những kinh nghiệm trong nghiên cứu khoa học

Em xin cảm ơn tập thể cán bộ phòng Dược lý - Sinh hóa - Viện Dược liệu đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Nhân dịp này, em cũng xin cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường cùng toàn thể các thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy cho em cũng như các bạn sinh viên trong trường trong suốt năm năm học tập

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ tạo đều kiện tốt nhất để em thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày 6 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Bùi Thị Thanh Hương

MỤC LỤC

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 2

1.1 Cây Sen 2

1.1.1 Thành phần hóa học 2

1.1.2 Tác dụng dược lý 4

1.1.3 Công dụng 6

1.2 Bệnh béo phì, tế bào Hep - G2 sử dụng trong nghiên cứu béo phì, sự tích tụ lipid nội bào 8

1.2.1 Bệnh béo phì 8

1.2.2 Tế bào Hep - G2 sử dụng trong nghiên cứu béo phì 12

1.2.3 Sự tích tụ lipid nội bào 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.1 Nguyên liệu, phương pháp xử lý nguyên liệu 15

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 15

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 16

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào 22

2.3 Xử lí số liệu 25

CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 26

3.1.1 Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 26

3.1.2 Sắc ký lớp mỏng 27

3.2 Nghiên cứu khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào 31

3.2.1 Đánh giá mức độ độc tế bào của mẫu nghiên cứu 31

3.2.2 Nghiên cứu thăm dò nồng độ oleic 33

3.2.3 Đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid 34

3.3 Bàn luận 36

KẾT LUẬN 40

KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BMI : Body mass index

DMEM : Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO : Dimethylsulfoxid

FFA : Free fat acid

MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromid Oleic : Acid oleic

ORO : Oil Red O

PBS : Phosphat buffer salin

SKLM : Sắc ký lớp mỏng

TG : Triglycerid

WHO : World heath organization

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Phân loại béo phì theo chỉ số BMI……….…… 8 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong lá Sen………….… ……26 Bảng 3.2: Kết quả khai triển SKLM cao chiết cồn, hệ dung môi Cloroform:

methanol: nước [50:7,5:1]……… ……… …….28

Bảng 3.3: Kết quả khai triển SKLM cắn alcaloid và cao chiết cồn , hệ dung

môi Cloroform: methanol: amoniac [50:9:1]……… ….… 29

Bảng 3.4: Kết quả khai triển SKLM cắn flavonoid và cao chiết cồn , hệ dung

môi Cloroform: methanol: nước [7:4:1]……….……….…… 31

Bảng 3.5: Kết quả đánh giá mức độ độc tế bào của mẫu nghiên cứu…….…32 Bảng 3.6: Kết quả thăm dò nồng độ oleic……… ……… …….33 Bảng 3.7: Kết quả đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao chiết

nước ……….……… ……… 34

Bảng 3.8:Kết quả đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao chiết

cồn……… ……….35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1: Sự tích tụ lipid ở mô mỡ……… ………….….14 Hình 3.1: Sắc ký đồ định tính cao chiết cồn, hệ dung môi Cloroform:

methanol: nước [50:7,5:1]……….……… 27

Hình 3.2: Sắc ký đồ định tính cắn alcaloid và cao chiết cồn, hệ dung môi

Cloroform: methanol: amoniac [50:9:1] ……….……… ….29

Hình 3.3: Sắc ký đồ định tính cắn flavonoid và cao chiết cồn, hệ dung môi

Cloroform: methanol: nước [7:4:1]……….30

Hình 3.4: Kết quả đánh giá mức độ độc tế bào của mẫu nghiên cứu…… 32 Hình 3.5: Kết quả thăm dò nồng độ oleic ……… ………33 Hình3.6:Kết quả đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao chiết

nước……….…34

Hình 3.7: Kết quả đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao chiết

cồn……… 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của đời sống xã hội tỉ lệ người dân mắc bệnh béo phì ngày càng gia tăng Bệnh béo phì không chỉ ảnh hưởng đến thẩm mỹ, tâm lý mà còn ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người Nó là nguyên nhân của các bệnh nguy hiểm như tim mạch, đái tháo đường, ung thư, rối loạn lipid

máu Theo một nghiên cứu của Kelly T và cộng sự (2008), trên thế giới trong

năm 2005 có 937 triệu người thừa cân và 396 triệu người béo phì, đến năm

2030 là 1,35 tỷ và 573 triệu người Do đó, thừa cân và béo phì là một gánh nặng cho y tế và cộng đồng trên toàn thế giới Phòng ngừa và điều trị các bệnh đi kèm và tử vong do thừa cân, béo phì phải được ưu tiên [35] Từ lâu đã

có nhiều thuốc điều trị béo phì ra đời, tuy nhiên ngoài tác dụng chính, các thuốc tân dược còn có nhiều tác dụng phụ, gây nhiều độc tính trên bệnh nhân [62] Vì vậy, việc điều trị bằng các thuốc tân dược không phải là lựa chọn tốt nhất Hiện nay, nghiên cứu các vị thuốc đông dược điều trị bệnh béo phì đang

là một hướng có triển vọng Ở Việt Nam, dân gian từ lâu đã sử dụng nhiều dược liệu trong các bài thuốc để giảm cân như chè xanh, cà phê, cát cánh

Lá cây Sen là một trong số những vị thuốc được sử dụng để hạ cholesterol máu và chữa bệnh béo phì hiệu quả Mặc dù đã có một số nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học của lá Sen và tác dụng điều trị bệnh béo phì, nhưng vẫn chưa đầy đủ về mặt số lượng và chất lượng [2-6] Do đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào trên dòng tế bào Hep - G2 của cao chiết từ lá cây Sen

Nelumbo nucifera” Với hai mục tiêu nghiên cứu sau:

 Nghiên cứu thành phần hóa học của cao chiết từ lá cây Sen

 Nghiên cứu khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào trên dòng tế bào Hep -G2

được gây tích tụ lipid bằng acid oleic của cao chiết từ lá cây Sen

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1 Cây Sen

Cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn, Nelumbonaceae )

Các bộ phận dùng làm thuốc: Hạt sen, tâm sen, tua sen, gương sen, lá sen, ngó sen, cuống sen, củ sen

1.1.1 Thành phần hóa học

Các thành phần hóa học trong cây được phân lập từ hạt, lá, hoa, thân rễ

rất phong phú và đa dạng, bao gồm: alcaloid, steroid, triterpenoid, flavonoid, glycosid, polyphenol và các khoáng chất [67], [78]

1.1.1.1 Thành phần hóa học của lá Sen

Thành phần hóa học trong lá Sen bao gồm các nhóm chất như alcaloid, flavonoid, tanin, acid hữu cơ, saponin, đường tự do, sterol và nhóm chất màu Trong đó alcaloid và flavonoid là hai thành phần chính và quan trọng nhất [22], [51], [67]

 Nhóm chất alcaloid gồm:

- Nhóm aporphin alcaloid: nuciferin, nornuciferin, asimilobin, (–)-N-methylasimilobin, (–)-caaverin, (–)-anonain và (–)-roemerin

(–) Nhóm oxoaporphin alcaloid: lysicamin và liriodenin

- Nhóm dioxoaporphin alcaloid: (–)-cepharadion B

- Nhóm dehydroaporphin alcaloid: (–)-7-hydroxydehydronuciferin

- Nhóm benzylisoquinolin alcaloid: (+)-1(R)-coclaurin và

(–)-1(S)-norcoclaurin [22], [46], [51]

 Nhóm chất flavonoid gồm:

- Nhóm euflavonoid: luteolin, quercetin, quercetin 3-O-β-D-glucuronic, quercetin 3-O-β-D-glucosid, isorhamnetin 3-O-rutinosid, rutin, leucocyanidin, leucodelphinidin, (+)-catechin, astragalin [51]

- Nhóm isoflavonoid: isoquercitin [51]

Ngoài ra, một số thành phần hóa học cũng được tìm thấy là:

 Nhóm sterol: acid alphitolic, acid maslinic [37]

 Nhóm chất màu clorophyl: pheophytin-a , aristophyl-c [67]

1.1.1.2 Thành phần hóa học của các bộ phận khác

- Hạt Sen chứa nhiều tinh bột (60%) Ngoài ra hạt còn chứa đường raffinose,

1% chất đạm, 2% chất béo, một số chất khác như canxi 0,089%, phosphor 0,285%, sắt 0,0064% và các chất lotusin, demethyl coclaurin, liensinin, isoliensinin Các protein hạt rất giàu threonin, acid glutamic, leucin, arginin

và acid aspartic (26,73%, 17,28%, 13,11%, 9,47% và 7,76%) Các acid béo chính của dầu hạt là oleic (61,93%), linoleic (18,31%) và palmitic (9,14%) [51], [72]

- Tâm Sen có các alcaloid sau đã được biết như liensinin, isoliensinin,

methyl-corypalin, neferin, lotusin, tetra-hydroisoquinolin, còn có nuciferin, bisclaurin (alcaloid) và betus (base hữu cơ) [5]

1-(p-hydroxybenzyl)-6,7-dihyroxy-1,2,3,4 Gương Sen có quercetin, hyperosid, isoquercitrin, quercetin1-(p-hydroxybenzyl)-6,7-dihyroxy-1,2,3,4 31-(p-hydroxybenzyl)-6,7-dihyroxy-1,2,3,4 O1-(p-hydroxybenzyl)-6,7-dihyroxy-1,2,3,4 β1-(p-hydroxybenzyl)-6,7-dihyroxy-1,2,3,4 d1-(p-hydroxybenzyl)-6,7-dihyroxy-1,2,3,4

quercetin-3-O-β-d-glucuronic, isorhamnetin-3-O-β-d -galactosid và syringetin-3-O-β-d-glucosid 4,9% chất đạm, 0,6% chất béo, 9% carbohydrat và một lượng nhỏ vitamin C 0,017% [73]

- Tua nhị Sen có tanin

- Ngó Sen chứa tinh bột, asparagin, arginin, trigonellin, tyrosinglucose,

vitamin C, A, B, PP và một ít tanin

1.1.2 Tác dụng dƣợc lý

Tác dụng dược lý của các cao chiết khác nhau của thân rễ, hạt, lá, hoa

và các hợp chất được phân lập từ các cao chiết đã được chứng minh qua nhiều

mô hình thử nghiệm in vitro và in vivo [51] Bao gồm:

1.1.2.1 Tác dụng chống béo phì

Có nhiều nghiên cứu các tác dụng của cao chiết từ lá cây Sen trên enzyme tiêu hóa, chuyển hóa lipid và tác động chống béo phì bằng cách sử dụng mô hình chuột mắc bệnh béo phì gây ra bởi một chế độ ăn giàu chất béo Các cao chiết cho thấy sự ức chế phụ thuộc nồng độ của các hoạt động của α-amylase và lipase, sự điều hòa ngược quá trình trao đổi lipid và sự biểu hiện của các protein PRKA α, β, γ trong tế bào nguyên bào sợi cơ chuột C2C12 Nó cũng có tác dụng ngăn chặn sự gia tăng trọng lượng cơ thể và TG trong mô ở gan [52]

tự do [41]

1.1.2.3 Tác dụng chống viêm, kháng khuẩn

Một số tài liệu chỉ ra rằng ở liều 10mg/kg, các cao chiết từ hạt của cây Sen ức chế sự sản xuất các procytokin, yếu tố hoại tử khối u-α (TNF-α) và tăng cytokin chống viêm IL-10 trong chuột BALB/c bị viêm nhiễm gây ra bởi tiêm màng bụng lipopolysaccharide (LPS) Các kết quả nghiên cứu ở những con chuột cho thấy liều cao (20mg/ngày) của chiết xuất hạt giảm đáng

kể nồng độ TNF-α trong huyết thanh và tăng đáng kể nồng độ IL-10 được sản

xuất bởi các đại thực bào ở phúc mạc Kết quả này đã chứng minh rằng các cao chiết từ hạt có khả năng chống viêm [52]

mô hình với liều uống 200 và 400mg/kg Trong mô hình gây sốt bởi nấm men, các chất chiết xuất cho thấy sự hạ thấp nhiệt độ cơ thể phụ thuộc vào liều lên đến 4h, kết quả so sánh với nhóm dùng paracetamol [63]

1.1.2.6 Tác dụng chống thiếu máu cục bộ

Cao chiết hạt Sen có tác dụng chống thiếu máu cục bộ mạnh trong tim chuột bị cô lập Các kết quả chống thiếu máu gây ra trong tim chuột bị cô lập được đánh giá bằng cách đo cung lượng tim; liều 0,1-30mg/ml đã được thử nghiệm Phục hồi tối đa đã được nhìn thấy ở liều 10mg/ml, mặc dù cung lượng tim tương tự như sau khi điều trị với liều 3 hoặc 10mg/ml ( 63,5 ± 3,2

và 65,8 ± 4,0ml/phút ) Như vậy, liều 3mg/ml đã được xác định là liều tối ưu cho tác dụng chống thiếu máu cục bộ ở chuột [36]

1.1.2.7 Tác dụng hạ đường huyết

Bột hoa phơi khô của cây Sen, cũng như các cao chiết nước và cồn của hoa có khả năng gây hạ đường huyết đáng kể trong lúc thỏ bạch tạng đói bình

thường Nghiên cứu in vitro cho thấy bột hoa phơi khô tăng cường đáng kể

hiệu quả của insulin Việc cải thiện dung nạp glucose có thể là do tăng sử

dụng glucose ở ngoại vi gây ra bởi sự gia tăng độ nhạy cảm của cơ xương với

insulin nội sinh [50]

1.1.2.8 Tác dụng điều hòa miễn dịch, chống virus

Cao chiết ethanol 95% của lá đã được báo cáo cho thấy có tác dụng

chống HIV (EC50 ≤ 0,8mg/ml) Một số chất chống HIV, bao gồm (+)-1(R)-coclaurin, (-)-1(S)-norcoclaurin và quercetin 3-O- β-d-glucuronic đã

được tìm thấy ở lá Sen Cả (+)-1(R)-coclaurin và (-)-1(S)-norcoclaurin đều có

tác dụng chống HIV mạnh, với giá trị EC50= 0,8mg/ml, trong khi quercetin

3-O-β-d-glucuronic có ít tác dụng với EC50 là 2mg/ml Các alcaloid khác cũng

có tác dụng chống HIV mạnh như bisbenzylisoquinolin là nuciferin,

liensinin, neferin và isoliensinin cũng đã được phân lập từ lá Sen, với giá trị

EC50 < 0,8mg/ml [34]

1.1.3 Công dụng

Các bộ phận khác nhau của cây Sen, bao gồm lá, rễ, hạt và hoa đã được

báo cáo là có công dụng chữa trị trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh

khác nhau

Hạt Sen (Liên nhục, Liên tử): hay quả Sen thu hoạch khi quả đã chín

già với thể chất mập và chắc, nếu hạt để nguyên vỏ ngoài thì được liên thạch,

bóc bỏ vỏ là liên nhục Hạt Sen có vị ngọt, tính bình, có công dụng bổ tỳ,

dưỡng tâm, cố tinh, ích thận, chữa cơ thể suy nhược, kém ăn, mất ngủ, kiết

lỵ, di mộng tinh, khí hư, tiêu chảy kéo dài, suy dinh dưỡng Hạt Sen cũng là

một loại thực phẩm quý, thường dùng nấu chè, làm mứt, chế biến thành nhiều

món ăn ngon Hạt Sen và gạo nếp nấu thành cháo ăn, trị quen đẻ rơi, phụ nữ

có thai đau lưng hông Hạt Sen (bỏ tim) 60g, cam thảo 10g, cùng chưng nóng

bỏ đường cát vào vừa lượng mà ăn, trị nhiễm trùng hệ tiết niệu, đi tiểu nhiều

lần, tiểu gấp, hư nhược khô nóng Ngày dùng 12-20g, có thể đến 100g, dưới

dạng thuốc sắc hoặc hoàn tán

Tâm Sen (Liên tâm): Vị đắng tính hàn, có công dụng thanh tâm khí

nhiệt hạ áp Dùng an thần, trị sốt cao mê sảng, hồi hộp tim đập nhanh, huyết

áp cao Thường dùng phối hợp với một số vị thuốc khác như cúc hoa, hòe hoa, hạt muồng, pha trà uống để dễ ngủ, hạ áp Liên tâm 30 cái, đun nóng, thêm muối, ăn trước khi ngủ, trị mất ngủ, nóng trong lòng, nhiều mộng Liên tâm 1,5g dùng nước sôi ngâm như trà uống, trị cao huyết áp

Tua sen (Liên tu): Lá nhị của hoa Sen, thu hoạch khi hoa đã nở, bỏ hạt

gạo ở đầu rồi phơi hoặc sấy khô Tua Sen có tên thuốc là liên tu, có vị chát, mùi thơm, tính ấm, có công dụng ích thận, cố tinh, thanh tâm, chỉ huyết, chữa

di mộng tinh, băng huyết, thổ huyết, mất ngủ, đái són, bạch đới Dùng riêng hoặc phối hợp với hạt sen Ngày dùng 5-10g, sắc uống

Gương sen (Liên phòng): Vị ấm đắng sáp, tính ôn, có công dụng tiêu ứ

chỉ huyết, dùng trị các chứng băng lậu ra máu, tiểu ra máu Thường dùng để cầm máu bằng cách đốt thành than rồi phối hợp với các vị thuốc khác Liều dùng 5-10g

Lá sen (Liên diệp, Ngẫu diệp): Vị đắng sáp, tính bình, công dụng thanh

nhiệt, lợi thấp, phát thanh dương, cố tinh dừng huyết Dùng trị cảm nắng, say nắng, xuất huyết do sốt cao Chữa các chứng cảm sốt mùa hè rất tốt Ðã ứng dụng nhiều năm chữa sốt xuất huyết thể nhẹ Lá Sen còn dùng để hạ cholesterol và chữa bệnh béo phì [8]

Ngó sen (Ngẫu tiết): có công dụng thanh nhiệt, tỉnh rượu Là một món

ăn chữa trị hư bạch đới, tiêu chảy kéo dài Ngó Sen tươi giã lấy nước, trị trúng nắng, đau bụng, mũi ra máu, sản hậu xuất huyết, viêm ruột cấp tính, phổi kết hạch Ngó Sen tươi (bỏ đốt) 500g, gừng sống lấy 500g (bỏ vỏ sắt mỏng) bỏ vào vải sạch vắt lấy nước, ngày uống mấy lần, trị cảm mạo mùa hạ, viêm ruột, phát nhiệt, khát, nôn mửa, tiêu chảy

Cuống Sen: Là ngó Sen đã già, mang lá phát triển, không ăn được

nhưng có công dụng làm thuốc trị tiêu chảy, kiết lỵ

Củ Sen: Vừa có giá trị thực phẩm bổ dưỡng vừa là dược liệu trị bệnh

biếng ăn, mất ngủ, suy dinh dưỡng

1.2 Bệnh béo phì, tế bào Hep - G2 sử dụng trong nghiên cứu béo phì,

sự tích tụ lipid nội bào

1.2.1 Bệnh béo phì

1.2.1.1 Khái niệm, phân loại

Khái niệm: Béo phì là tình trạng tăng khối lượng mỡ trong cơ thể quá mức, dẫn đến cơ thể tăng trên 25% thể trọng Thể trọng hợp lý có thể căn cứ vào chỉ số khối lượng cơ thể BMI = M/H2 (M là khối lượng cơ thể tính bằng kg; H là chiều cao cơ thể tính bằng mét) Nữ có thể trọng hợp lý khi BMI nằm trong khoảng 18 - 22, được coi là béo phì khi BMI ≥ 27,5 Nam có thể trọng hợp lý khi BMI nằm trong khoảng 20 - 25, được coi là béo phì khi BMI ≥ 30 [49], [58]

Phân loại: Có nhiều tiêu chuẩn để phân loại béo phì Thông thường, ở các nước Châu Á phân loại béo phì theo chỉ số BMI [12], [53], [60]

Bảng 1.1: Phân loại béo phì theo chỉ số BMI

1.2.1.2 Rủi ro sức khỏe liên quan đến bệnh béo phì

Đái tháo đường type II

BMI cao, béo bụng và tăng cân là những yếu tố nguy cơ quan trọng cho

sự phát triển của bệnh tiểu đường type II Người ta ước tính rằng 90% người

có bệnh tiểu đường type II là béo phì [12], [18], [44]

Rối loạn lipid máu

Béo phì nội tạng có liên quan với tăng triglycerid, tăng cholesterol máu

có hệ thống và cuối cùng có thể dẫn đến tăng huyết áp động mạch phổi và suy tim phải [40]

Bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu

Béo phì có liên quan tới một bệnh gan được gọi là bệnh gan nhiễm mỡ (NAFLD) hoặc gan nhiễm mỡ không do rượu (NASH) Biểu hiện của rối loạn này bao gồm chức năng gan bất thường và mô học gan bất thường như gan

nhiễm mỡ, xơ gan [20], [25], [40], [47], [57]

Ung thƣ

Thừa cân và béo phì có liên quan với tăng nguy cơ nội mạc tử cung, thực quản, tế bào thận, tụy, buồng trứng, ung thư vú, đại trực tràng, tuyến

giáp và ung thư túi mật [15], [26], [40], [71]

Rối loạn chức năng sinh sản

Rối loạn chức năng sinh sản liên quan đến bệnh béo phì được báo cáo

là có liên quan đến cả hai giới Ở nam giới béo phì, testosteron và glubulin gắn với hormon sinh dục SHBG trong huyết tương thường giảm và nồng độ estrogen tăng Với nữ giới béo phì thường đi kèm với rối loạn kinh nguyệt và tăng sản xuất androgen, giảm SHBG và tăng sự biến đổi ngọai biên androgen thành estrogen 40% phụ nữ mắc hội chứng đa nang buồng trứng bị béo phì

[29], [39], [40]

Bệnh sỏi mật

Béo phì làm tăng nguy cơ bị sỏi mật ở mọi lứa tuổi và giới lên gấp 3-4 lần Với người béo phì, cứ 1kg mỡ thừa làm tăng tổng hợp cholesteron lên 20mg/ngày, dẫn đến tăng bài tiết mật, tăng mức độ bão hòa cholesteron trong mật, đồng thời làm giảm mức độ cơ động của túi mật là nguyên nhân trực tiếp

dẫn đến sỏi mật [19], [40], [65], [66]

1.2.1.3 Điều trị béo phì

Nguyên tắc: Béo phì là một bệnh lý mạn tính, điều trị bệnh béo phì là

một quá trình đỏi hỏi sự kiên trì của người bệnh Đó là một quá trình giảm cân đưa BMI về từ 20 đến 30 bằng nhiều phương pháp khác nhau hoặc phối hợp các phương pháp đó Bệnh nhân chỉ được chỉ định dùng thuốc khi BMI >30 hoặc BMI >25 kèm theo bệnh lý đái tháo đường hoặc có các yếu tố nguy cơ, trong quá trình dùng thuốc vẫn phải tập luyện, giảm ăn Nếu dùng thuốc và tập luyện không có hiệu quả thì bệnh nhân được chỉ định phẫu thuật dạ dày [23], [48], [55]

Một số phương pháp điều trị béo phì:

Chế độ ăn giảm năng lượng: Mục tiêu của phương pháp này là giảm năng

lượng hấp thu tới mức thấp hơn năng lượng tiêu hao Bệnh nhân ăn với khẩu phần 1000-1200 kcal/ngày liên tục sau 10-120 tuần lễ sẽ giảm hơn 15% trọng lượng cơ thể [9], [30], [61]

Chế độ ăn giảm chất béo: Ngoài việc ăn với chế độ giảm năng lượng, bệnh

nhân còn nên áp dụng phương pháp chế độ ăn giảm chất béo Vì 10-15 % năng lượng từ khẩu phần ăn là của chất béo, chế độ ăn giảm chất béo cho thấy hiệu quả rõ rệt giảm cân so với chế độ ăn chưa giảm chất béo [9], [61], [64], [74]

Nhịn ăn: Tác dụng giảm cân rất nhanh Tuy nhiên sau một thời gian nhịn ăn

cân nặng lại nhanh chóng trở lại Cách này không được khuyến khích vì rất dễ

để lại hậu quả nặng nề là loạn nhịp tim, hạ huyết áp quá mức và đã có trường hợp tử vong

Hoạt động thể lực: Mục tiêu của phương pháp này là tăng năng lượng tiêu

thụ, nâng cao hoạt động thể lực Hiện nay có rất nhiều bài tập thể lực mà người béo có thể áp dụng, nhưng dù tập cách nào cũng cần có thời gian và cường độ hợp lý Tuyệt đối không tập luyện quá mức Phải bắt đầu từ những bài tập có cường độ thấp rồi mới tăng dần Nên tập những bài phù hợp với sinh lý, tình trạng sức khỏe mỗi đợt ít nhất 3 tuần, thời gian 45 phút mỗi ngày tập luyện [30], [62]

Liệu pháp hành vi: Là phương pháp quyết định quá trình giảm béo có ý

nghĩa hay không Sau thời gian giảm béo bệnh nhân cần thay đổi cả thói quen

ăn uống trước đó Nếu không thực hiện rất dễ tăng cân trở lại [62]

Điều trị bằng thuốc:

Nhóm thuốc tân dược điều trị béo phì: có rất nhiều nhóm thuốc tân dược để

điều trị bệnh béo phì tuy nhiên do tác dụng không mong muốn và độc tính đối

với bệnh nhân nên hầu hết được khuyến cáo là không nên sử dụng Sau đây là hai thuốc hiện nay thường xuyên được chỉ định cho bệnh nhân béo phì [62]

- Orlistat: Thuốc ức chế lipase của ruột, ức chế sự thủy phân TG thành

monoglycerid và acid béo dẫn đến TG không được hấp thu và dẫn đến

giảm cân [21]

- Sibutramin: thuốc tác dụng trên thụ thể β3 làm tăng sinh nhiệt trên mô

mỡ nâu và kích thích phân hủy mỡ trên mô mỡ trắng, tăng tiêu thụ năng

lượng gây giảm cân [21]

Nhóm thuốc đông dược điều trị béo phì: Có rất nhiều bài thuốc theo y học cổ

truyền được dùng để điều trị béo phì Sau đây là một số vị thuốc hay được dùng:

- Vị thuốc:

+ Lá Sen: Sắc nước uống

+ Thảo quyết minh: Hạt được sao chín, nghiền bột uống

+ Đại hoàng: sắc nước uống

+ Câu kỳ tử: 30g sắc nước uống, ngày 1 thang

Phẫu thuật dạ dày: Khi các biện pháp trên không thành công, bệnh nhân

được chỉ định phẫu thuật dạ dày Phương pháp này thường có tác dụng giảm cân rõ rệt nhưng thường đi kèm với các rủi ro như thiếu vi chất dinh dưỡng, biến chứng thần kinh sau phẫu thuật, thiếu dinh dưỡng Cần phải thông báo cho bệnh nhân và chấp nhận rủi ro [13], [17], [27]

1.2.2 Tế bào Hep - G2 sử dụng trong nghiên cứu béo phì

Hep - G2 là một dòng tế bào ung thư gan nguyên phát của con người, thường được sử dụng như mô hình ung thư biểu mô tế bào gan [31] Chúng có khả năng tiết ra một loạt các protein huyết tương chính như: albumin, transferin và các protein thứ cấp fibrinogen, α-2-macrglobulin, α-1-antitrypsin, plasminnogen

Với các điều kiện nuôi cấy thích hợp, khi phát triển đến đỉnh sinh trưởng, tế bào Hep - G2 biểu hiện được các đặc điểm về chức năng của các enzym chuyển hóa cholesterol trong và ngoại bào của gan, huyết tương như HMG - CoA reductase và cholesterol-7-α-hydroxylase Mặc dù, có thể có sự khác biệt về số lượng trong những biểu hiện của các chức năng này, tuy nhiên

hệ thống mô hình tế bào Hep - G2 vẫn có thể cung cấp những hiểu biết hữu ích về cơ chế chuyển hóa cholesterol, lipoprotein của gan và chuyển hóa đường mật [24], [31]

Ngoài ra, một số nghiên cứu đã chứng minh được Hep - G2 còn có khả năng tích tụ lipid nội bào tốt nên dòng tế bào này được sử dụng rộng rãi trong các mô hình nghiên cứu về sự tích tụ lipid gây béo phì và ung thư gan [32], [33], [43], [56], [70], [75]

1.2.3 Sự tích tụ lipid nội bào

Sự tích tụ lipid diễn ra ở tế bào mỡ Những tế bào mỡ trưởng thành tổng hợp và tiết ra một số enzyme, các yếu tố tăng trưởng cùng với một

số protein Các chất này liên quan đến sự điều khiển hàng loạt các phản ứng sinh lý bao gồm kiểm soát việc thèm ăn và cân bằng năng lượng Quá trình trao đổi chất đặc biệt của tế bào mỡ bao gồm trao đổi lipid, cân bằng glucose nội mô, viêm nhiễm, hình thành mạch, cầm máu và huyết áp Dạng chủ yếu của tế bào mỡ ở động vật có vú là mỡ trắng (WAT) WAT bao gồm các tế bào

mỡ liên kết lỏng lẻo với nhau tập trung nhiều mạch máu và các dây thần kinh Nơi tích lũy WAT cao nhất là các vùng dưới da của cơ thể, xung quanh các nội tạng Chức năng nội tiết của WAT là điều khiển sự thèm ăn, chuyển hóa năng lượng, chuyển hóa glucose và lipid, quá trình viêm, hình thành mạch, và các chức năng sinh sản Trọng tâm chính của đề tài này là tập trung vào sự tích tụ lipid ở tế bào mỡ

Hình 1.1: Sự tích tụ lipid ở tế bào mỡ

TG được vận chuyển trong máu và bạch huyết từ ruột non về gan nhờ chylomicron và VLDL Ở tế bào nội mô mao mạch của tế bào mỡ, các phức hợp lipoprotein trên sẽ được phân hủy bởi tác dụng của lipoprotein lipase, giải phóng FFA và glycerol FFA khuếch tán từ mao mạch vào tế bào mỡ Sau đó FFA sẽ được gắn trở lại vào glycerol phosphat để tạo thành triglycerid Norepinephrin từ đầu tận của dây thần kinh sẽ hoạt hóa hệ thống tín hiệu cAMP (thụ thể β3) và hoạt hóa lipase nhạy cảm hormon để thủy phân các triglycerid dự trữ trở lại thành FFA và glycerol Các phân tử này sẽ khuếch tán trở lại vào mao mạch và tại đó, FFA sẽ gắn kết với albumin để chuyển tới các vị trí cần sử dụng năng lượng [7], [76]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu, phương pháp xử lý nguyên liệu

Nguyên liệu để nghiên cứu gồm phần lá của cây Sen, nhận từ khoa Dược lý- Sinh hóa, Viện Dược liệu Trung Ương

Mẫu lá tươi sau khi thu hái được đem sấy ở 80oC để diệt men, sau đó sấy ở nhiệt độ 60oC cho tới khi khô hoàn toàn Mẫu khô được nghiền thành bột, chiết nóng với nước và ethanol

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

Dòng tế bào Hep - G2 để thử độc tính và thử khả năng chống tích tụ lipid nội bào của cao chiết dược liệu

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

Hóa chất dùng để nghiên cứu tác dụng ức chế tích tụ lipid nội bào bao gồm:

- Fenofibrat, acid oleic, ORO, DMSO (hãng Sigma)

- Một số hóa chất khác như MTT, FBS, PBS, DMEM (hãng Invitrogen)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học

Nghiên cứu thành phần hóa học trong bộ phận lá Sen bằng phương pháp làm phản ứng hóa học phối hợp sử dụng sắc kí lớp mỏng, bao gồm:

- Chiết xuất cao bằng ethanol 70o và làm phản ứng hóa học với cao từ

lá cây Sen

- Chiết lấy nhóm chất alcaloid, flavonoid để chạy sắc kí lớp mỏng bằng bản tráng sẵn trên đế nhôm

2.2.1.1 Phương pháp chiết xuất

Cao chiết cồn: Toàn bộ phần lá Sen đã phơi, sấy khô, nghiền nhỏ được chiết

nóng bằng ethanol 70o

trong 2h Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao khô

Cao chiết nước: Toàn bộ phần lá Sen đã phơi, sấy khô, nghiền nhỏ được

chiết nóng bằng nước trong 2h Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao khô

Cắn flavonoid: Từ cặn khô của dịch chiết cồn, thêm nước vào cặn, lắc với

ether dầu hỏa đến khi lớp dầu không màu để loại tạp clorophin Loại hết lớp dầu, tiếp tục lắc với ethylacetat (3 lần) Gộp các dịch chiết, sau đó cất loại

dung môi đến cắn

Cắn alcaloid: Cân 10g bột dược liệu, thấm ẩm bằng NH4OH 10% Sau 1h thêm CHCl3 ngập dược liệu, ngâm qua đêm Lọc, lấy dịch lọc, cất thu hồi dung môi Cắn thu được hòa tan bằng HCl 5% (pH=2) Lọc, kiềm hóa dịch lọc bằng NH4OH 10% (pH=11) Chiết alcaloid bằng cách lắc với CHCl3 (3 lần) Gộp các dịch chiết , sau đó cất loại dung môi dến cắn

2.2.1.2 Phương pháp hóa học

2.2.1.2.1 Định tính các hợp chất sterol

Lấy 0,1g cắn của cao chiết cồn (tương đương 1g bột dược liệu), thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thủy đến khô Hòa tan cắn trong 3ml CHCl3, hút lấy dịch CHCl3 vào ống nghiệm nhỏ Mỗi ống nghiệm nhỏ 1 giọt thuốc thử ( 1ml anhydridacetic + 1ml CHCl3 để lạnh ở 0oC + 1 giọt H2SO4 đậm đặc), dung dịch xuất hiện màu xanh lục và bền là phản ứng dương tính

, chia vào 3 ống nghiệm

Ống 1 (Phản ứng Cyanidin): Thêm một ít bột Mg kim loại (khoảng 10mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt) Để yên một vài phút, nếu dung dịch chuyển sang đỏ hoặc hồng là phản ứng dương tính

Ông 2 (Phản ứng với kiềm): Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% nếu thấy xuất hiện tủa vàng, thêm 1ml nước cất tủa tan bớt và màu của dung dịch vàng hơn thì phản ứng là dương tính

Ống 3 (Phản ứng với FeCl3): Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, nếu xuất hiện tủa xanh đen là phản ứng dương tính

2.2.1.2.4 Định tính các courmarin

Lấy 0,1g cắn của cao chiết cồn (tương đương 1g bột dược liệu), hòa tan cắn bằng 5ml ethanol 90o, chia vào 2 ống nghiệm Ống 1 cho thêm 0,5 ml NaOH 10% rồi đun cách thủy cả 2 ống (ống có kiềm thường có màu vàng xuất hiện) Ðể nguội, thêm vào mỗi ống 4ml nước cất, nếu ống 1 trong hơn ống 2 nhưng sau đó acid hóa mà đục hoặc có kết tủa như ống 2 thì phản ứng

Phản ứng Keller-Kiliiani: Hòa tan cắn bằng 1ml ethanol 90o Lắc đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 pha trong acid acetic Lắc đều Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Nếu ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ hay nâu đỏ thì phản ứng là dương tính

2.2.1.2.7 Định tính tanin

Lấy 0,1g cắn của cao chiết cồn (tương đương 1g bột dược liệu), hòa tan bằng 5ml ethanol 90o

Lắc đều, chia vào 2 ống nghiệm

Ống 1: Thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5%, nếu thấy xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hay màu xanh nâu nhạt thì phản ứng là dương tính

Ống 2: Thêm 2 giọt chì acetat 10%, nếu thấy xuất hiện tủa bông thì phản ứng

là dương tính

2.2.1.2.8 Định tính acid hữu cơ

Lấy 0,1g cắn của cao chiết cồn (tương đương 1g bột dược liệu), hòa tan bằng 1ml ethanol 90o Cho thêm vào ống nghiệm một ít bột Na2CO3, nếu thấy

có bọt khí sủi lên thì phản ứng là dương tính

2.2.1.2.9 Định tính đường tự do

Lấy 0,1g cắn của cao chiết cồn (tương đương 1g bột dược liệu), hòa tan bằng 1ml ethanol 90o, nhỏ thêm 1-2 giọt Fehling A và 2-3 giọt Fehling B, đun nóng Nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng là dương tính

2.2.1.2.10 Định tính anthranoid

Lấy 0,1g cắn của cao chiết cồn (tương đương 1g bột dược liệu), thêm 3ml CHCl3 Lắc kỹ, hút dịch CHCl3 vào ống nghiệm để làm phản ứng Thêm 1ml dung dich NH4OH 10% vào ống nghiệm, lắc nhẹ nếu thấy lớp nước có màu đỏ sim và tiếp tục thêm 1 ml NaOH thấy màu đỏ đậm hơn thì phản ứng

là dương tính

2.2.1.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc: Một dung dịch mẫu thử được chấm lên một lớp mỏng chất

hấp phụ (thường là silicagel, nhôm oxyd) tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các thành phần của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau [1]

 Tiến hành: Chấm một lượng nhỏ dịch chấm sắc ký lên bản mỏng Sau

đó khai triển bằng các hệ dung môi sau:

Hệ I: Cloroform: methanol: nước [7:4:1]

Hệ II: Cloroform: methanol: nước [50:7,5:1]

Hệ III: Cloroform: methanol: amoniac [50:9:1]

Sau khi khai triển, bản mỏng được lấy ra để khô, đem soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng  = 254nm và 366nm Quan sát các vết trên bản sắc ký, so sánh các kết quả thu được từ 3 hệ dung môi, chọn ra hệ tách ra được nhiều vết