Nghiên cứu khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào- 123docz.net

3.2.1. Đánh giá mức độ độc tế bào của mẫu nghiên cứu

Tiến hành đánh giá mức độ độc tế bào của mẫu nghiên cứu bằng thử nghiệm MTT ở mục 2.2.2.2. Kết quả được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.5: Kết quả đánh giá mức độ độc tế bào của mẫu nghiên cứu.

Nhóm nghiên cứu Liều

100mg/ml 200mg/ml 300mg/ml 400mg/ml Fenofibrat (%) 100,8 ± 6,61 Cao nước (%) 100,8 ± 2,21 99,5 ± 2,81 90,8 ± 7,71 89,2 ± 6,03 Cao chiết cồn (%) 95,4 ± 3,55 90,0 ± 8,72 84,6 ± 2,91 78,5 ± 2,94 Chứng (%) 100,0 ± 0,92

Hình 3.4: Kết quả đánh giá mức độ độc tế bào của mẫu nghiên cứu.

* Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy:

- Đối với cao nước nồng độ 100mg/ml và 200mg/ml không ảnh hưởng

đến khả năng sống sót của tế bào (% tế bào sống sót lần lượt là 100,8 ± 2,21% và 99,5 ± 2,81%). Nồng độ 300mg/ml và 400mg/ml gây giảm khả năng sống sót của tế bào (% tế bào sống sót lần lượt là 90,8 ± 7,71% và 89,2 ± 6,03%) 0 20 40 60 80 100 120 % tế bào s ống sót

- Đối với cao chiết cồn nồng độ 100mg/ml không ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bào (% tế bào sống sót là 95,4 ± 3,55%). Nồng độ 200mg/ml, 300mg/ml, 400mg/ml gây giảm khả năng sống sót của tế bào (% tế bào sống sót lần lượt là 90,0 ± 8,72% , 84,6 ± 2,91% , 78,5 ± 2,94%)

* Kết luận: Chọn cao nước 100mg/ml, 200mg/ml và cao chiết cồn 100mg/ml làm mẫu thử cho thí nghiệm nghiên cứu khả năng ức chế tích tụ lipid.

3.2.2. Nghiên cứu thăm dò nồng độ oleic

Để chọn nồng độ acid oleic phù hợp cho thí nghiệm, tiến hành định lượng acid oleic tích tụ vào tế bào. Kết quả được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.6: Kết quả thăm dò nồng độ oleic

Nhóm nghiên cứu Kết quả

P so với nhóm chứng

Chứng (%) 100,0 ± 10,09

Acid oleic 0,5mM (%) 310,1 ± 6,67 P <0,001

Acid oleic 1mM (%) 428,0 ± 3,57 P <0,001

Hình 3.5: Kết quả thăm dò nồng độ oleic (aaap< 0,001 so với chứng).

aaa aaa 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

control oleic 0.5 mM oleic 1 mM

% tí ch tụ li pi d

* Nhận xét: Cả hai nồng độ acid oleic 0,5mM và 1mM đều cho kết quả tích tụ lipid vào tế bào cao. Tuy nhiên nồng độ acid oleic 1mM gây tăng tích tụ lipid cao hơn 27,6 % so với nồng độ 0,5mM.

* Kết luận: Chọn nồng độ oleic 0,5mM cho thí nghiệm nghiên cứu khả năng ức chế tích tụ lipid.

3.2.3. Đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào 3.2.3.1. Cao chiết nƣớc 3.2.3.1. Cao chiết nƣớc

Tiến hành định lượng acid oleic tích tụ vào tế bào thông qua giá trị mật độ quang đo được của thuốc nhuộm Oil Red O. Kết quả được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.7: Kết quả đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao nước

Nhóm nghiên cứu Kết quả P so với

nhóm chứng

Chứng (acid oleic 0,5 mM) (%) 100,0 ± 6,67

Acid oleic 0,5 mM và fenofibrat 200mg/ml (%) 84,1 ± 8,85 P <0,05

Acid oleic 0,5mM và cao nước 200mg/ml (%) 109,4 ± 2,98 P <0,05

Acid oleic 0,5mM và cao nước 100mg/ml (%) 116,9 ± 6,15 P <0,05

Hình 3.6: Kết quả đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao nước.

(ap < 0,05 so với chứng) a a a 0 20 40 60 80 100 120 140 oleic 0.5 oleic 0.5 và fenofibrat 200 oleic 0.5 và cao

nước 200 oleic 0.5 và cao nước 100

% tí ch tụ li pi d

* Nhận xét: Kết quả cho thấy nhóm tế bào được xử lý bằng oleic 0,5mM và fenofibrat 200mg/ml có tác dụng ức chế tích tụ lipid so với nhóm chứng (% tích tụ lipid là 84,1 ± 8,85% ). Cao nước với nồng độ 100mg/ml và 200mg/ml đều chưa thể hiện tác dụng ức chế tích tụ lipid (% tích tụ lipid là 109,4 ± 2,98% và 116,9 ± 6,15%).

* Kết luận: Cao nước với nồng độ 100mg/ml và 200mg/ml đều chưa thể hiện tác dụng ức chế tích tụ lipid.

3.2.3.2. Cao chiết cồn

Bảng 3.8: Kết quả đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao chiết cồn

Nhóm nghiên cứu Kết quả P so với

nhóm chứng

Chứng (acid oleic 0,5mM) (%) 100,0 ± 10,67

Acid oleic 0,5mM và fenofibrat 200mg/ml (%) 76,9 ± 5,38 P <0,05

Acid oleic 0,5mM và cao chiết cồn 100mg/ml

Hình 3.7: Kết quả đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao chiết cồn

(ap<0,05 so với chứng)

* Nhận xét: Kết quả cho thấy cả hai nhóm tế bào được xử lý bằng oleic 0,5mM và fenofibrat 200mg/ml cùng với nhóm oleic 0,5mM và cao chiết cồn 100mg/ml đều có tác dụng ức chế tích tụ lipid so với nhóm chứng (% tích tụ lipid là76,9 ± 5,38% và 80,0 ± 1,69%).

* Kết luận : Cao chiết cồn 100mg/ml có tác dụng ức chế tích tụ lipid.

3.3. Bàn luận

3.3.1. Về thành phần hóa học Nguyên tắc chung:

Ngay khi mẫu thu hái xong phải được diệt men để tránh sự chuyển hóa do các quá trình sinh tổng hợp xảy ra ở thực vật, sấy khô ở nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu trong điều kiện khô ráo.

Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau, trong trường hợp này việc chiết lấy các chất từ lá Sen được chiết

nóng trực tiếp bằng cồn 70o. Một số nghiên cứu cho thấy phương pháp chiết

nóng hiệu quả hơn phương pháp chiết lạnh. Sau đó, định tính các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết cồn. Các kết quả thường đủ tin cậy để xác nhận sự có mặt của nhóm hợp chất trong dịch chiết. Với một số nhóm hợp chất như coumarin, flavonosid, glycosid tim, saponin phản ứng định tính có thể bị che

a a 0 20 40 60 80 100 120

oleic 0.5 oleic 0.5 và fenofibrat 200 oleic 0.5 và cồn 100 % tí ch tụ li pi d

lấp bởi các tạp chất làm cho việt kết luận gặp khó khăn. Trong trường hợp này thực hiện thêm việc thủy phân các nhóm chất, chiết lấy dạng aglycon và định tính dạng aglycon của chúng. Kết quả định tính dương tính sẽ làm tăng khả năng kết luận sự có mặt của các nhóm hợp chất này trong dịch chiết. [1]

Kết quả nghiên cứu TPHH của cao chiết từ lá Sen cho thấy có các nhóm chất Alcaloid, Flavonoid, Tanin, Acid hữu cơ, Saponin, Đường tự do và Sterol. Kết quả thu được không phải luôn có ý nghĩa tuyệt đối, chỉ là kết luận sơ bộ về sự có mặt của các chất trong lá Sen. Nguyên nhân có thể là:

- Trường hợp dương tính giả: một số nhóm chất khác cũng phản ứng với

thuốc thử.

- Trường hợp âm tính giả: xuất hiện khi phương pháp chiết không tách

được các chất ra khỏi dạng liên kết của nó với tanin, đường hoặc hàm lượng các chất trong dược liệu quá thấp.

Để khắc phục các trường hợp trên, đề tài đã tiến hành áp dụng phương pháp sau:

- Làm giàu nhóm hợp chất cần định tính trong môi trường phản ứng bằng

lượng dược liệu lớn.

- Loại bớt các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng bằng cách sử dụng các

quy trình chiết chuyên biệt hơn.

Triển khai SKLM không còn là mới nhưng cũng đòi hỏi nhiều kỹ thuật để sắc ký đồ đạt yêu cầu. Thứ nhất, bản mỏng cần được hoạt hóa ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trước khi chạy sắc ký. Thứ hai, chọn hệ dung môi khai triển cho sắc ký đồ tách được nhiều vết và rõ nhất. Trước hết phải xác định cần chạy sắc ký nhóm hợp chất gì? Căn cứ vào tính phân cực của nhóm chất này để lựa chọn dung môi. Flavonoid phân cực hơn Alcaloid nên sẽ dùng hệ dung môi phân cực hơn. Ngoài ra, alcaloid có tính kiềm nên thành phần thứ 3 là một lượng nhỏ amoniac để vết sắc ký tách rõ, gọn hơn. Hệ dung môi được

pha trước với lượng đủ dùng bảo quản kín ở một nhiệt độ cố định để kết quả dễ lặp lại. Thứ ba, dịch chấm mẫu thử phải có nồng độ không quá cao( không chấm được, vết quá đậm) hay quá thấp( vết loang rộng, vết quá mờ), kiểm tra bằng đèn UV. Dung môi pha mẫu thử phải hòa tan tốt và dễ bay hơi, trong trường hợp này chọn methanol. Thứ tư, chấm mẫu thử lên bản mỏng phải lưu ý mẫu thử được chấm thành điểm hoặc chấm thành vạch dưới nguồn nhiệt để vết được nhỏ gọn, dày 1-2mm, cách mép bản 1-1,5 cm để tránh hiệu ứng bờ. Thứ năm, bình khai triển phải được bão hòa dung môi trước khi khai triển và khi đang khai triển tuyệt đối không di chuyển bình sắc ký.

3.3.2. Về khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào

Nuôi cấy tế bào: Trong quá trình nuôi cấy, tiến hành soi tế bào dưới kính hiển vi mỗi khi thay môi trường nuôi cấy, nhận thấy tế bào có hình đa giác và bám dính ổn định, đặc trưng của dòng tế bào Hep-G2. Mặt khác tế bào cũng thể hiện khả năng sinh trưởng tốt, ít bị vón cục yếu tố quan trọng để những thí nghiệm về sau cho kết quả tốt.

Đánh giá mức độ độc tế bào của mẫu nghiên cứu: Tiến hành đánh giá ảnh hưởng của cao chiết nước và cao chiết cồn lên sự sống của tế bào Hep-G2. Tỷ lệ sống sót của tế bào khi ủ với cao chiết nước và cao chiết cồn ở các nồng độ 100, 200, 300, 400mg/ml trong 24h đã cho thấy, nồng độ cao nhất không gây chết tế bào là cao chiết nước 100mg/ml với tỷ lệ sống sót là 101%, bắt đầu thể hiện độc tính rõ ở nồng độ cao nước 300, 400mg/ml với tỷ lệ tế bào sống sót lần lượt là 90.61%, 89,1% và cao cồn 200, 300, 400mg/ml với tỷ lệ tế bào sống sót lần lượt là 89,84%, 84,46%, 78,32%. Như vậy, chọn cao chiết nước 100mg/ml, 200mg/ml và cao chiết cồn 100mg/ml làm mẫu thử cho thí nghiệm thử khả năng ức chế tích tụ lipid.

Thử nồng độ oleic phù hợp: Để tế bào tích tụ lipid, thông thường sử dụng hỗn hợp (acid oleic/ acid pamitic, 2:1). Trong nghiên cứu này tôi chọn acid

oleic thay cho hỗn hợp trên, khảo sát khả năng tích tụ lipid với hai nồng độ là 0,5mM và 1mM. Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ acid oleic phù hợp là 0,5mM. Phù hợp với các nghiên cứu trước đó.

Đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid: Tiến hành đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid với các mẫu thử đã được chọn ở trên. Khả năng ức chế lipid của các mẫu thử được so sánh với chứng âm (không có mẫu thử) và chứng dương (thay mẫu thử bằng fenofibrat). Kết quả cho thấy trong ba mẫu thử cao nước 100mg/ml, 200mg/ml và cao cồn 100mg/ml chỉ có cao cồn cho kết quả biểu hiện khả năng ức chê tích tụ lipid giảm 17,93% so với chứng âm. Đây là một kết quả không quá cao để khẳng định ngay khả năng ức chế tích tụ lipid của cao cồn 100mcg/ml, nhưng cũng đáng tin cậy để bước đầu nghiên cứu khả năng ức chế tích tụ lipid của cao chiết từ lá Sen.

Để chọn được nồng độ acid oleic phù hợp và đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid với các mẫu thử, chúng tôi đã tiến hành phương pháp nhuộm bằng thuốc nhuộm ORO. Mặc dù là một phương pháp nhuộm đã biết đến từ lâu trong các nghiên cứu với lipid, nhưng do một số ưu điểm như thuốc nhuộm dễ tìm, hóa chất ít độc hại, thiết bị đánh giá đơn giản nên cho đến nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này. Tuy nhiên, cũng giống như các phương pháp khác, phương pháp nhuộm bằng thuốc nhuộm ORO cũng có một số nhược điểm ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Cụ thể là

- Thuốc nhuộm ORO dễ bị thủy phân bởi ánh sáng nên chỉ pha thuốc

nhuộm trước khi tiến hành thí nghiệm 5 phút và trong quá trình ủ với thuốc nhuộm thì tiến hành bọc giấy bạc để tránh ánh sáng.

- Phương pháp nhuộm sử dụng nhiều thao tác bằng tay, hút rửa nhiều lần

ảnh hưởng đến kết quả nên người tiến hành thí nghiệm phải cẩn thận, chính xác.

KẾT LUẬN

1. Về thành phần hóa học:

- Bằng phương pháp hóa học đã xác định các nhóm chất trong cao chiết

lá Sen bao gồm: alcaloid, flavonoid, tanin, acid hữu cơ, saponin, đường tự do và sterol.

- Bằng phương pháp SKLM cho kết quả sắc ký đồ của cao chiết cồn 70o

có 11 vết, cắn alcaloid có 5 vết trùng với cao chiết cồn với hệ dung môi phù hợp là Cloroform: methanol: amoniac [50:9:1], cắn favonoid có 5 vết trùng với cao chiết cồn với hệ dung môi phù hợp là Cloroform: methanol: nước [7:4:1].

2. Về khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào:

- Nồng độ oleic phù hợp cho các thí nghiệm tích tụ lipid nội bào là

0,5mM.

- Cao chiết cồn 100mg/ml có khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào và cao

nước chưa thể hiện khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào ở các nồng độ thử.

KIẾN NGHỊ

1. Nghiên cứu đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao

chiết cồn từ lá cây Sen (N. nucifera) trên động vật thí nghiệm.

2. Nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào của cao nước

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt.

1. Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học y dược thành phố Hồ Chí Minh (2012),

“Phân tích thành phần hóa thực vật”, Giáo trình Phương pháp nghiên cứu

dược liệu, 72.

2. Nguyễn Kim Cẩn (2001), “Phương pháp khối lượng định lượng alkaloid toàn phần của lá sen và sự thay đổi hàm lượng alkaloid theo tuổi và thời vụ

thu lá”, Tạp chí Dược liệu, 6(2+3), 45.

3. Nguyễn Ngọc Khôi (2009), “Độc tính mãn và tác dụng chống béo phì từ lá

trà xanh và lá sen”, Tạp chí Dược liệu, 14(4), 229.

4. Nguyễn Thị Nhung (2001), “Nghiên cứu thành phần hóa học của tâm sen

và gương sen”, Tạp chí Dược liệu, 6(2+3), 55.

5. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ (2011), “Nghiên cứu thành phần alkaloid trong

tâm sen (nelumbo nucifera gaertn nelumbonaceae)”, NXB Y Học TP Hồ Chí

Minh,15(1), 606-611.

6. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ (2013), “Xây dựng qui trình định lượng đồng thời quercetin, kaempferol, catechin và quercetin-3-0-glucuronid trong lá sen bằng

phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học, (5), 53.

Tài liệu tham khảo Tiếng anh

7. Ahmadian M., Duncan R.E., and Sul H.S. (2009), “Skinny on Fat

Metabolism: Lipolysis and Fatty Acid Utilization”, Trends Endocrinol Metab

TEM, 20(9), 424–428.

8. Ahn J.H., Kim E.S., Lee C., et al. (2013), “Chemical constituents from

Nelumbo nucifera leaves and their anti-obesity effects”, Bioorg Med Chem

9. Anders S. and Schroeter C. (2015), “Diabetes, diet-health behavior, and

obesity”, Front Endocrinol, 6, 33.

10. Barja Yáñez S., Arnaiz Gómez P., Villarroel Del Pino L., et al. (2015), “Dyslipidemias in school-age chilean children: prevalence and associated

factors”, Nutr Hosp, 31(5), 2079–2087.

11. Bogusiewicz A., Boysen G., and Mock D.M. (2015), “In HepG2 Cells, Coexisting Carnitine Deficiency Masks Important Indicators of Marginal

Biotin Deficiency”, J Nutr, 145(1), 32–40.

12. Booth H.P., Prevost A.T., and Gulliford M.C. (2013), “Impact of body mass index on prevalence of multimorbidity in primary care: cohort study”,

Fam Pract, 31(1), 38–43.

13. Broderick R.C., Fuchs H.F., Harnsberger C.R., et al. (2014), “Comparison of bariatric restrictive operations: laparoscopic sleeve gastrectomy and

laparoscopic gastric greater curvature plication”, Surg Technol Int, 25, 82–89.

14. Caleyachetty R., Echouffo-Tcheugui J.B., Tait C.A., et al. (2015), “Prevalence of behavioural risk factors for cardiovascular disease in adolescents in low-income and middle-income countries: an individual

participant data meta-analysis”, Lancet Diabetes Endocrinol, 8587(15), 76–

85.

15. Calle E.E. (2007), “Obesity and cancer”, BMJ, 335(7630), 1107–1108.

16. Costanzo P., Cleland J.G.F., Pellicori P., et al. (2015), “The obesity paradox in type 2 diabetes mellitus: relationship of body mass index to

prognosis: a cohort study”, Ann Intern Med, 162(9), 610–618.

17. Deviere J. (2015), “Endoscopic bariatric procedures”, Curr Treat Options

Gastroenterol, 13(2), 206–218.

18. Diaf M., Khaled B.M., and Sellam F. (2015), “Impact of corpulence