khảo sát tình hình nhiễm chlamydophila psittaci trên gà tại khánh hòa

i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Tiến sĩ Lê Lập, trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Tiến sĩ Võ Thành Thìn, phó trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, anh Lê Trung Hiếu, chị Đặng Thị Sao Mai, anh Lê Đình Hải và các anh chị thuộc Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện thú y miền Trung đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực tập tại phân viện. Tôi xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Văn Hồng Cầm, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, đã luôn luôn nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua. Nha Trang, tháng 06 năm 2012 Sinh viên Đoàn Văn Tiến ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC…… ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Khái niệm và lịch sử bệnh Chlamydophilosis 3 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Chlamydophila psittaci 4 1.2.1. Phân loại vi khuẩn Cp. psittaci 4 1.2.2. Hình thái vi khuẩn Cp. psittaci 4 1.2.3. Các tính chất sinh hóa vi khuẩn Cp. psittaci 6 1.2.4. Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn Cp. psittaci 6 1.2.5. Độc lực của vi khuẩn Cp. psittaci 8 1.2.6. Con đường lây nhiễm Cp. psittaci 9 1.3. Triệu chứng bệnh Chlamydophilosis 10 1.4. Bệnh tích bệnh Chlamydophilosis 11 1.5. Chẩn đoán bệnh Chlamydophilosis 12 1.5.1. Thu thập và xử lý mẫu 12 1.5.2. Quan sát trực tiếp bằng phương pháp nhuộm 13 1.5.3. Phân lập vi khuẩn Cp. psittaci 13 1.5.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào 13 1.5.3.2. Phương pháp gây nhiễm vi khuẩn trên phôi gà 14 1.5.4. Phát hiện các kháng nguyên đặc hiệu cho vi khuẩn Cp. psittaci 14 1.5.5. Phát hiện các gen đặc hiệu cho vi khuẩn Cp. psittaci 14 1.5.6. Xét nghiệm huyết thanh học 16 1.5.7. Chẩn đoán phân biệt 17 iii 1.6. Điều trị bệnh Chlamydophilosis 17 1.7. Phòng bệnh Chlamydophilosis 19 1.8. Bệnh Chlamydophilosis ở người 19 CHƯƠNG II: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.2. Nội dung nghiên cứu 21 2.3. Nguyên liệu nghiên cứu 21 2.3.1. Mẫu bệnh phẩm 21 2.3.2. Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu 21 2.3.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 22 2.4. Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu ngoáy hầu họng ở gà 23 2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA Cp. psittaci từ mẫu ngoáy hầu họng 23 2.4.2.1. KIT chiết tách DNA 23 2.4.2.2. Quy trình chiết tách DNA 23 2.4.3. Chuẩn hóa nested PCR phát hiện Cp. psittaci trong mẫu bệnh phẩm 24 2.4.3.1. Phương pháp xác định nhiệt độ gắn tối ưu của mồi 25 2.4.3.2. Phương pháp xác định tính đặc hiệu của mồi 25 2.4.4. Phương pháp nested PCR phát hiện gen omp1 27 2.4.5. Phát hiện DNA: Phương pháp điện di trên gel agarose 29 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Chuẩn hóa phản ứng nested PCR 31 3.1.1. Xác định nhiệt độ gắn tối ưu của mồi 31 3.1.2. Xác định tính đặc hiệu của mồi 35 3.2. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm Cp. psittaci trên gà tại Khánh Hòa 37 3.2.1. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo độ tuổi của gà 41 3.2.2. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo loại gà 43 iv 3.2.3. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo phương thức chăn nuôi 44 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 4.1. Kết luận 46 4.2. Kiến nghị 46 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các serovar của Chlamydophila psittaci 8 Bảng 2.1. Thành phần bộ kít tách chiết QIAamp DNA Mini Kit 22 Bảng 2.2. Trình tự mồi dùng cho phản ứng nested PCR 28 Bảng 2.3. Thành phần của một phản ứng nested PCR 28 Bảng 3.1. Nhiệt độ nóng chảy của các cặp mồi 31 Bảng 3.2. Kết quả xác định nhiệt độ gắn thích hợp của cặp mồi xuôi và cặp mồi ngược 34 Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả PCR các mẫu thu được tại hai địa điểm Ninh Hòa và Cam Lâm (Khánh Hòa) 40 Bảng 3.4. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo độ tuổi của gà 42 Bảng 3.5. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo loại gà 43 Bảng 3.6. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo phương thức chăn nuôi 44 vi DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Ảnh chụp hiển vi điện tử về sự lan truyền của vi khuẩn Chlamydophila psittaci dạng thể vùi (INCLUS) trong các tế bào L929 được gây nhiễm. 5 Hình 2.1. Sơ đồ minh họa vị trí gắn hai cặp mồi Cp1-F, Cp1-R, Cp2-F và Cp2-R trên gen omp1 của vi khuẩn Chlamydophila psittaci 28 Hình 3.1. Kết quả điện di gradient PCR gen omp1 của vi khuẩn Chlamydophila spp. sử dụng cặp mồi Cp1-F và Cp1-R với nhiệt độ bắt cặp dao động trong khoảng Ta = 48-58 0 C 32 Hình 3.2. Kết quả điện di gradient PCR gen omp1 của vi khuẩn Chlamydophila spp. sử dụng cặp mồi Cp2-F và Cp2-R với nhiệt độ bắt cặp dao động trong khoảng Ta = 50-62 0 C 33 Hình 3.3. Kết quả chạy PCR xác định tính đặc hiệu của cặp mồi ngoài Cp1-F và Cp1-R 35 Hình 3.4. Kết quả chạy PCR xác định tính đặc hiệu của cặp mồi trong Cp2-F và Cp2-R 37 Hình 3.5. Kết quả chạy PCR1 của 29 mẫu ngoáy hầu họng (1-29) thu tại thị xã Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa 38 Hình 3.6. Kết quả chạy PCR1 của 35 mẫu ngoáy hầu họng (30-64) thu tại huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa 39 Hình 3.7. Kết quả chạy PCR2 các mẫu dương tính với PCR1 (3, 4, 7, 9, 11, 13, 18 và 26) 40 Hình 3.8. Kết quả PCR2 các mẫu dương tính với PCR1 (30, 37, 38, 41, 45,61, 63 và 64) 41 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Chữ viết tắt ppm part per million DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction µl microlitre opt optimum T Temperature P-value Trị số thống kê VD variable domain LD Leading peptide MOMP Major outer membrane protein 1 LỜI MỞ ĐẦU Chăn nuôi gà là nghề chăn nuôi có truyền thống lâu đời và chiếm vị trí quan trọng thứ hai (sau chăn nuôi lợn) trong toàn ngành chăn nuôi của Việt Nam. Theo Trần Công Xuân (2008), ngành chăn nuôi gà cung cấp khoảng 350-450 ngàn tấn thịt và hơn 2,5-3,5 tỷ quả trứng hàng năm. Chăn nuôi gà chiếm 72-73% trong tổng số đàn gia cầm hàng năm (Quyết định của Thủ tướng Chính phủ số 10/2008/QĐ-TTg ngày 16/01/2008). Mỗi năm ngành chăn nuôi gà đã sản xuất một khối lượng thịt hơi chiếm khoảng 14- 15% trong tổng khối lượng thịt hơi các loại (thịt lợn chiếm 75-76%). Theo số liệu của Tổng Cục thống kê năm 2003, sản lượng thịt, trứng gà đạt cao nhất; khối lượng thịt gà là 271,7 ngàn tấn và số lượng trứng là 3,5 tỷ quả. Năm 2004, do dịch cúm xảy ra, ngành chăn nuôi gà bị thiệt hại lớn, sản lượng sản phẩm thịt, trứng đều giảm sút. Tính đến 1/8/2004 khối lượng thịt 231 ngàn tấn (bằng 84,89% của năm 2003), sản lượng trứng đạt 2,8 tỷ quả (bằng 81,27% của năm 2003). Theo số liệu tính quay vòng, năm 2005 sản lượng thịt đạt 453,6 ngàn tấn, sản lượng trứng đạt 2,87 tỷ quả. Năm 2006, do ảnh hưởng của dịch cúm gia cầm sản lượng thịt, trứng giảm hơn năm 2005 (thịt gà đạt 538,9 ngàn tấn, trứng đạt 2,4 tỷ quả) (Trần Công Xuân, 2008). Chăn nuôi gà phát triển mạnh, nhất là vùng Đồng bằng sông Hồng, Đồng bằng sông Cửu Long và Đông Bắc. Sản lượng đầu con của các vùng này năm 2003 tương ứng là 50,13; 34,58 và 26,57 triệu con, chiếm 60% đàn gà của cả nước. Các vùng phát triển tiếp theo là Đông Nam Bộ và Bắc Trung Bộ, chiếm 26%, các vùng có sản lượng thấp nhất là Tây Bắc và Tây Nguyên, chỉ chiếm từ 4-5% về số lượng đầu con. Do phương thức chăn nuôi nhỏ lẻ, thả rông, buôn bán, giết mổ phân tán, không đảm bảo an toàn sinh học nên dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra, gây tổn thất lớn về kinh tế. Các bệnh thường gặp là: Niucátxơn Gumbôrô, Tụ huyết trùng… 2 Trong đó, tỷ lệ gà bị bệnh Niucátxơn từ 40-53%, bệnh Gumbôrô 27-32%, tụ huyết trùng 14-15%. Theo số liệu điều tra của viện Chăn nuôi quốc gia, tỷ lệ chết từ khi nở ra cho đến lúc trưởng thành của đàn gà nuôi thả rông là 47%; chi phí thuốc thú y trị bệnh lên đến 10-12% giá thành (Trần Công Xuân, 2008). Chăn nuôi gà nông hộ vẫn bấp bênh, ngành chăn nuôi gà phát triển không bền vững. Khánh Hòa là một tỉnh thành có ngành chăn nuôi khá phát triển, đặt biệt là chăn nuôi gà. Tuy nhiên, đặc điểm khí hậu và các điều kiện tự nhiên thường thuận lợi cho sự phát triển của nhiều dịch bệnh, trong đó bệnh Chlamydophilosis do Cp. psittaci gây ra là một bệnh đáng quan tâm. Hiện nay ở nước ta chưa có những báo cáo nào liên quan đến vi khuẩn Chlamydophila psittaci và bệnh Chlamydophilosis do chúng gây ra. Tuy nhiên do đặc điểm bệnh lây lan nhanh và nguy hiểm ở cả gia cầm và người nên bệnh có thể bùng phát gây thiệt hại cho người chăn nuôi cũng như ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng. Nhằm hiểu biết thêm về tình hình nhiễm bệnh Chlamydophilosis do vi khuẩn Chlamydophila psittaci gây ra trên gà tại nội tỉnh Khánh Hòa, chúng tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát tình hình nhiễm Chlamydophila psittaci trên gà tại Khánh Hòa”. Mục tiêu của đề tài là đánh giá tình hình nhiễm Cp. psittaci trên gà ở mọi lứa tuổi tại tỉnh Khánh Hòa. Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm: - Chuẩn hóa phản ứng PCR phát hiện Cp. psittaci trong mẫu bệnh phẩm. - Xác định tỷ lệ nhiễm Chlamydophila psittaci trên gà theo các chỉ tiêu về độ tuổi, loại gà và phương thức chăn nuôi. 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái niệm và lịch sử bệnh Chlamydophilosis Bệnh Chlamydophilosis (Chlamydiosis) trên gia cầm do vi khuẩn Chlamydophila psittaci (Cp. psittaci) gây ra. Bệnh được phát hiện lần đầu tiên trên Vẹt và được gọi là “bệnh sốt vẹt” (psittacosis) vào những năm 1929-1930. Trong khoảng thời gian này, bệnh được chú ý trên phạm vi toàn thế giới khi xuất hiện trên các đối tượng gia cầm ở 12 quốc gia. Tại Mỹ, người ta cho rằng bệnh lây lan do Vẹt rừng Amazon vùng Nam Mỹ. Năm 1931, các điều lệ gắt gao đã được thực hiện nhằm hạn chế việc nhập khẩu vẹt từ các nước nhiệt đới. Suốt thời gian này, Leventhal, Cole và Lillie độc lập quan sát các thể ái kiềm rất nhỏ trong mô của chim và người bị nhiễm bệnh và cho rằng chính các thể này là tác nhân gây bệnh. Mối quan hệ giữa các thể ái kiềm và nguyên nhân gây bệnh Chlamydophilosis cuối cùng cũng được thiết lập bởi Bedson và Bland (Meyer, 1965). Năm 1939, vi khuẩn Cp. psittaci phân lập được từ bồ câu tại Nam Phi và California (Mỹ). Cũng tại thời điểm này, bệnh do Cp. psittaci xuất hiện trên hai người dân New York (Mỹ) sau khi có tiếp xúc với bồ câu hoang dã nhiễm bệnh. Năm 1942, kết quả khảo sát huyết thanh cho thấy vịt và gà tây là loài vật nhiễm Cp. psittaci với tỉ lệ cao nhất. Hơn nữa, những người ở California và New York (Mỹ) tiếp xúc với vịt, gà tây nhiễm bệnh đều cho kết quả dương tính với kháng thể kháng Cp. psittaci. Đầu những năm 1950, vi khuẩn Cp. psittaci phân lập được từ gà tây và người có tiếp xúc với gà tây nhiễm bệnh tại các trang trại chăn nuôi lớn ở Mỹ. Thống kê cho thấy số lượng các loài gia cầm bị nhiễm bệnh tăng nhanh và hiện nay có trên 400 loài chim thuộc hơn 21 bộ chim bị nhiễm bệnh (Andersen và Vanrompay, 2008). Bệnh do Cp. psittaci lại bùng phát trên gà tây tại Mỹ vào những năm 1980, tại châu Âu vào những năm 1990 (Vanrompay và cs., 1993b; Ryll và cs., 1994). Tại Bỉ, bệnh do Cp. psittaci xảy ra thường xuyên trên gà tây tại các trại nuôi công [...]... gia c m nhi m Cp psittaci ngày càng tăng Theo Ito và cs (2002), có kho ng 465 loài chim (k c gia c m) ư c xác nh là ã nhi m Cp psittaci T l nhi m Cp psittaci cao nh t ư c phát hi n là trên loài v t và b câu Kh o sát huy t thanh cho th y có kho ng 16-81% loài v t nhi m Cp psittaci và t l ch t kho ng 50% (Raso và cs., 2002; Vanrompay, 2008) M t s nghiên c u cho th y t l nhi m Cp Psittaci trên b câu là 35,9-60%,... gà 2.2 N i dung nghiên c u - Chu n hóa ph n ng nested PCR - Xác phát hi n Cp psittaci trong m u b nh ph m nh t l nhi m Chlamydophila psittaci trên gà theo các ch tiêu v tu i, lo i gà và phương th c chăn nuôi 2.3 Nguyên li u nghiên c u 2.3.1 M u b nh ph m M u b nh ph m là d ch ngoáy h u h ng c a gà các l a tu i nuôi t i Khánh Hòa 2.3.2 Môi trư ng, hóa ch t dùng trong nghiên c u - Dung d ch m PBS (Phosphate... 1.5.3.2 Phương pháp gây nhi m vi khu n trên phôi gà Tr ng gà có phôi 6-7 ngày tu i s ư c gây nhi m v i 0,2 – 0,5 ml dung d ch vi khu n/phôi thông qua túi noãn hoàng Theo dõi s phát tri n c a phôi 370C n 10 ngày sau gây nhi m T t ngh n m ch máu là t n thương l n nh t ư c tìm th y phôi gà ch t do b nhi m vi khu n Cp psittaci Túi noãn hoàng ư c thu nh n t phôi ã ch t 3-10 ngày sau gây nhi m N u phôi không ch... Cp pneumoniae (gây b nh cho ngư i) và Cp pecorum (gây b nh trên ng v t nhai l i) 1.2.2 Hình thái vi khu n Cp psittaci Vi khu n Cp psittaci là c u khu n gram âm, s ng ký sinh trong t bào v t ch Thành t bào c a Cp psittaci không có l p peptidoglycan Trong t bào v t ch , vi khu n Cp psittaci thư ng t n t i 3 d ng riêng bi t v m t hình thái (hình 1.1): - Th trung gian hay th sơ c p (elementary bodies... n Cp psittaci v i các tri u ch ng nh ư ng hô h p ho c không th hi n tri u ch ng nên gây khó khăn cho công tác ch n oán b nh (Harkinezhad và cs., 2007; Vanrompay và cs., 2008) 21 CHƯƠNG II: N I DUNG, NGUYÊN LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 i tư ng nghiên c u - Gà nuôi t i các h gia ình và các trang tr i chăn nuôi gà t i th xã Ninh Hòa và huy n Cam Lâm t nh Khánh Hòa - M u b nh ph m thu ư c t gà 2.2... lây nhi m cho con ngư i (Woldehiwet, 2008) B ng 1.1 Các serovar c a Chlamydophila psittaci Serovar Ch ng i di n V t ch A Chim h v t B CP3 B câu C GR9 V t, ng ng D NJ1 Gà tây E MN B câu, gà tây F VS225 Chim h v t M56 M56 Chu t x , th r ng tr ng B c M WC 1.2.5 VS1 WC Gia súc c l c c a vi khu n Cp psittaci Các ch ng Cp psittaci gây b nh trên gia c m thư ng có b nh th c p tính, có m c lây lan nhanh trong... a i Chlamydophila psittaci V trí g n c a c p m i trong n m o n DNA c hi u loài vùng trái c a VD III và vùng ph i c a VD IV (hình 2.1) S n ph m t o thành trong l n khu ch i th hai có kích thư c 389-404 bp Trình t nucleotide c a c p m i trong (Cp2-F và Cp2-R) ư c th hi n b ng 2.2 28 Hình 2.1 Sơ minh h a v trí g n hai c p m i Cp1-F, Cp1-R, Cp2-F và Cp2-R trên gen omp1 c a vi khu n Chlamydophila psittaci. .. psittaci thu c h Chlamydiaceae H Chlamydiaceae ư c xác nh là có 2 gi ng và g m 9 loài (Everett và cs., 1999a): • Gi ng Chlamydia (C.) g m các loài C trachomatis (gây b nh suis (gây b nh l n) và C muridarum (gây b nh ngư i), C chu t) • Gi ng Chlamydophila (Cp.) g m các loài Cp psittaci (gây b nh trên gia c m), Cp felis (gây b nh cho mèo), Cp abortus (gây b nh trên bò, dê, c u), Cp caviae (gây b nh trên. .. Chlamydophilosis trên v t và ngư i ti p xúc v i v t nhi m b nh gia tăng (Andersen và Vanrompay, 2008; Laroucau và cs., 2009) 1.2 T ng quan v vi khu n Chlamydophila psittaci 1.2.1 Phân lo i vi khu n Cp psittaci Trư c ây gi ng Chlamydia (C.) g m có 4 loài là C trachomatis, C psittaci, C pneumoniae, và C pecorum Tuy nhiên, lư ng d li u v các trình t DNA m i c a chúng tr nên nhi u hơn nên Everett và c ng s lo i d a trên. .. chim m c dù kh năng gây b nh c a chúng có v như th p hơn so v i các ch ng thu c serovar A Serovar C ư c xác nh l n u tiên trên các ch ng Cp psittaci phân l p t v t và ng ng Tuy nhiên, các ch ng thu c serovar C cũng ã ư c phân l p t gà tây và gà gô Các ch ng Cp psittaci phân l p t gà tây ch y u thu c serovar D Ngoài ra serovar D cũng ư c phân l p t di c và mòng bi n Bác sĩ thú y và ngư i ti p xúc v i . quả khảo sát tình hình nhiễm Cp. psittaci trên gà tại Khánh Hòa 37 3.2.1. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo độ tuổi của gà 41 3.2.2. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci. thêm về tình hình nhiễm bệnh Chlamydophilosis do vi khuẩn Chlamydophila psittaci gây ra trên gà tại nội tỉnh Khánh Hòa, chúng tôi tiến hành đề tài: Khảo sát tình hình nhiễm Chlamydophila psittaci. hình nhiễm Chlamydophila psittaci trên gà tại Khánh Hòa . Mục tiêu của đề tài là đánh giá tình hình nhiễm Cp. psittaci trên gà ở mọi lứa tuổi tại tỉnh Khánh Hòa. Nội dung nghiên cứu của đề