Tính đặc hiệu của mồi thể hiện ở đặc tính chỉ bắt cặp với DNA đích mà không bắt cặp với các DNA khác. Do đó, để xác định tính đặc hiệu của hai cặp mồi (Cp1-F, Cp1-R) và (Cp2-F, Cp2-R), chúng tôi tiến hành thiết lập chương trình PCR1 và PCR2 như sau:
- Phản ứng PCR1 được thực hiện với việc sử dụng cặp mồi Cp1-F và Cp1-R. Các DNA khác nhau được sử dụng trong phản ứng PCR bao gồm: (1) DNA đích của các vi khuẩn Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis và (2) DNA của một số loài khác bao gồm: Escherichia coli, Salmonella spp., Clostridium perfringens, Mycoplasma gallisepticum, Pasteurella multocida, Virus gây bệnh Newcastle, virus gây bệnh IB (Infectious Bronchitis) và virus cúm A-H5N1.
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR1 như sau:
- Giai đoạn một: 940C trong 10 phút (một chu kỳ) - Giai đoạn hai: (35 chu kỳ)
Bước 1: 940C trong 1 phút
Bước 2: T= T1opt (0C) trong 1 phút
Bước 3: 720C trong 1 phút
- Giai đoạn ba: ủ ở 720C trong 10 phút (một chu kỳ)
- Giai đoạn bốn: Hạ nhiệt độ xuống 40C để bảo quản mẫu PCR
Kết quả phản ứng PCR1 sẽ được xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%.
Ở phản ứng PCR2, sản phẩm PCR dương tính của phản ứng PCR1 sẽ được sử dụng cho phản ứng PCR2 sử dụng cặp mồi Cp2-F và Cp2-R.
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR2 như sau:
- Giai đoạn một: 940C trong 10 phút (một chu kỳ) - Giai đoạn hai: (30 chu kỳ)
Bước 1: 940C trong 1 phút
Bước 2: T= T2opt(0C) trong 1 phút
- Giai đoạn ba: ủ ở 720C trong 10 phút (một chu kỳ)
- Giai đoạn bốn: Hạ nhiệt độ xuống 40C để bảo quản mẫu PCR
Kết quả phản ứng PCR2 sẽ được xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%.
Đọc kết quả: Kết quả điện di được đọc qua máy đọc kết quả điện di. Kết quả dương tính sẽ cho các vạch trắng trên thạch gel agarose tương ứng với DNA có kích thước 384-404 bp và ngược lại kết quả âm tính sẽ không xuất hiện vạch trắng nào.