Phương pháp nested PCR gồm hai giai đoạn tương ứng với hai lần khuếch đại: - Lần khuếch đại thứ nhất (PCR1): còn được gọi là PCR vòng ngoài do sử dụng cặp mồi ngoài (Cp1-F và Cp1-R) nhằm khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu giống
Chlamydophila hay Chlamydia (theo hệ thống phân loại cũ). Vị trí gắn của cặp mồi ngoài nằm trong các vùng bảo tồn giữa VD II/ VD III và vùng downstream VD IV (hình 2.1). Sản phẩm tạo thành trong lần khuếch đại thứ nhất có kích thước 576-597 bp.
Trình tự nucleotide của cặp mồi ngoài (Cp1-F và Cp1-R) được thể hiện ở bảng 2.2. - Lần khuếch đại thứ hai (PCR2): còn gọi là PCR vòng trong. Sản phẩm DNA được tạo thành từ lần khuếch đại thứ nhất sẽ được cho vào ống PCR có chứa cặp mồi trong (Cp2-F và Cp2-R) nhằm khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu loài
Chlamydophila psittaci. Vị trí gắn của cặp mồi trong nằm ở vùng trái của VD III và vùng phải của VD IV (hình 2.1). Sản phẩm tạo thành trong lần khuếch đại thứ hai có kích thước 389-404 bp.
Trình tự nucleotide của cặp mồi trong (Cp2-F và Cp2-R) được thể hiện ở bảng 2.2.
Hình 2.1. Sơ đồ minh họa vị trí gắn hai cặp mồi Cp1-F, Cp1-R, Cp2-F và Cp2-R trên gen omp1 của vi khuẩn Chlamydophila psittaci (LD: leading peptide và VD I-IV : 4 vùng biến đổi I-IV)
Bảng 2.2. Trình tự mồi dùng cho phản ứng nested PCR
Tên Trình tự nucleotide (5' 3')* Base
Cp1-F GCI YTI TGG GAR TGY GGI TGY GCI AC 26
Cp1-R TTA GAA ICK GAA TTG IGC RTT IAY GTG IGC IGC 33
Cp2-F GTA ATT TCI AGC CCA GCA CAA TTY GTG 27
Cp2-R CCR CAA GMT TTT CTR GAY TTC AWY TTG TTR AT 32 * Degenerate nucleotides: K=G, T; M=A, C; R=A, G; W=A, T; Y=C , T; I=inosine. Thành phần của một phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần của một phản ứng nested PCR
Hóa chất Nồng độ PCR
(µl/phản ứng)
Nước 11,5
GoTaq Green master mix 1X 10
Mồi xuôi 10µM 0,25
Mồi ngược 10µM 0,25
DNA 3
Hỗn hợp trên được trộn đều, chuyển vào máy PCR và tiến hành chạy PCR.