3.1.1. Xác định nhiệt độ gắn tối ưu của mồi
Ta (annealing temperature) là nhiệt độ cho phép mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn mẫu. Ta thường chênh lệch 5 – 100C so với Tm (melting temperature). Tm còn được gọi là nhiệt độ nóng chảy của DNA, là nhiệt độ mà tại đó một nửa số liên kết hydro nối hai mạch DNA bị phá vỡ. Mỗi mồi đều có Tm riêng tùy thuộc vào thành phần và số lượng nucleotide tạo thành mồi đó. Tương tự, mỗi mồi cũng có khoảng nhiệt độ mà ở đó chúng bắt cặp tốt nhất và đặc hiệu nhất với mạch khuôn mẫu. Do đó, để phản ứng PCR đạt hiệu quả cao thì việc lựa chọn nhiệt độ bắt cặp của mồi một cách phù hợp là công việc quan trọng. Một cách cụ thể, cần chọn Ta sao cho mồi bắt cặp bổ sung hoàn toàn với mạch khuôn chứa đoạn DNA cần khuếch đại và sau phản ứng PCR chỉ thu nhận sản phẩm khuếch đại mong muốn. Do vậy, cần tiến hành thử nghiệm các phản ứng PCR ở những nhiệt độ Ta gần Tm để tìm Ta thích hợp nhất sao cho sản phẩm PCR thu được là duy nhất.
* Nhiệt độ gắn của cặp mồi Cp1-F và Cp1-R xác định Chlamydophila spp.
Để có thể xác định được nhiệt độ gắn thích hợp của cặp mồi Cp1-F và Cp1-R cho phản ứng PCR1, phản ứng được thực hiện ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau dao động trong khoảng Ta= 48-580C. Khoảng nhiệt độ này được thiết lập dựa trên nhiệt độ nóng chảy của mồi được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nhiệt độ nóng chảy của các cặp mồi
STT Mồi Nhiệt độ nóng chảy (0C)
1 Cp1-F 68,8
2 Cp1-R 68
3 Cp2-F 59,4
Dãy thay đổi nhiệt độ được phân chia tự động từ máy luân nhiệt như sau: 48,00C; 48,30C; 48,90C; 49,80C; 50,90C; 52,20C; 53,50C; 54,90C; 56,40C; 57,30C; 57,80C và 58,10C.
Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn tối ưu của cặp mồi Cp1-F và Cp1-R được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả điện di gradient PCR gen omp1 của vi khuẩn
Chlamydophila spp. sử dụng cặp mồi Cp1-F và Cp1-R với nhiệt độ
bắt cặp dao động trong khoảng Ta = 48-580C (M = Marker (100bp DNA ladder))
Sau khi phân tích sản phẩm gradient PCR trên thạch agarose, chúng tôi nhận thấy, khoảng nhiệt độ từ 480C đến 57,30C đã cho sản phẩm PCR rõ nét (hình 3.1). Ngược lại, khoảng nhiệt độ từ 57,80C đến 58,10C cho kết quả dương tính nhưng vệt băng DNA tương đối mờ, chứng tỏ cặp mồi Cp1-F và Cp1-R tuy có bắt cặp trên khuôn mẫu DNA nhưng hiệu suất bắt cặp không cao. Chính vì vậy, lượng DNA đích chỉ có thể khuếch đại lên với số lượng không nhiều và do đó cho kết quả điện di tương đối mờ. Từ những phân tích trên, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ gắn của cặp mồi Cp1-F và Cp1-R là 530C để xây dựng chương trình chuẩn cho phản ứng PCR1 phát hiện vi khuẩn Chalamydophila spp.trong mẫu bệnh phẩm.
1500 bp
100 bp 500 bp
* Nhiệt độ của cặp mồi Cp2-F và CP2-R xác định Chlamydophila psittaci
Để xác định được nhiệt độ gắn thích hợp của cặp mồi Cp2-F và Cp2-R cho phản ứng PCR2, chúng tôi thực hiện phản ứng với dãy thay đổi nhiệt độ gắn mồi trong khoảng: Ta=50-620C. Khoảng nhiệt độ này được thiết lập dựa trên nhiệt độ nóng chảy của cặp mồi Cp2-F và Cp2-R (xem bảng 3.1).
Dãy thay đổi nhiệt độ được phân chia tự động từ máy luân nhiệt như sau: 50,00C; 50,40C; 51,00C; 52,20C; 53,50C; 55,00C; 56,60C; 58,30C; 60,10C; 61,20C; 61,60C và 62,20C.
Sản phẩm của PCR1 được sử dụng để chạy tiếp PCR2.
Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn tối ưu của cặp mồi Cp2-F và Cp2-R được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Kết quả điện di gradient PCR gen omp1 của vi khuẩn
Chlamydophila spp. sử dụng cặp mồi Cp2-F và Cp2-R với nhiệt
độ bắt cặp dao động trong khoảng Ta = 50-620C
(Trong đó, M: Marker (100bp DNA ladder))
Sau khi phân tích sản phẩm gradient PCR trên thạch agarose, chúng tôi nhận thấy, khoảng nhiệt độ 50,00C đến 55,00C đã cho sản phẩm PCR rõ nét (hình 3.2).
500 bp 1500 bp
100 bp
Trong khi đó, khoảng nhiệt độ từ 56,60C đến 61,20C dù cho kết quả dương tính nhưng vệt băng tương đối mờ, đặc biệt là vệt băng ở nhiệt độ 61,20C, chứng tỏ khoảng nhiệt độ này cặp mồi Cp2-F và Cp2-R có bắt cặp vào khuôn mẫu DNA đích nhưng hiệu suất bắt cặp không cao nên lượng DNA đích tạo thành không nhiều. Khoảng nhiệt độ từ 61,60C đến 62,20C hầu như cho kết quả âm tính, điều này chứng tỏ trong khoảng nhiệt độ này cặp mồi Cp2-F và Cp2-R hầu như không bắt cặp trên DNA khuôn mẫu và vì vậy không thể khởi động quá trình sao chép nhằm khuếch đại đoạn DNA đích mong muốn. Kết quả là phản ứng khuếch đại diễn ra không thành công và DNA đích hầu như không được nhân lên.
Từ những phân tích trên, chúng tôi đã chọn nhiệt độ gắn của cặp mồi Cp2-F và Cp2-R là 550C để xây dựng chương trình chuẩn cho phản ứng PCR2 phát hiện vi khuẩn Chalamydophila psittaci trong mẫu bệnh phẩm.
Tổng hợp kết quả xác định nhiệt độ bắt cặp thích hợp của các cặp mồi được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả xác định nhiệt độ gắn thích hợp của cặp mồi xuôi và cặp mồi ngược
STT Mồi Khoảng nhiệt
độ khảo sát (0C)
Khoảng nhiệt độ cho kết quả PCR rõ nét (0C) Nhiệt độ tối ưu (0C) 1 Cp1-F và Cp1-R 48 - 58 48 – 57,3 53 2 Cp2-F và Cp2-R 50 - 62 50 – 55,0 55
Như vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 530C là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp mồi ngoài (Cp1-F và Cp1-R) trong phản ứng PCR1, nhiệt độ 550C là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp mồi trong (Cp2-F và Cp2-R) trong phản ứng PCR2.
3.1.2. Xác định tính đặc hiệu của mồi
Trong phản ứng PCR, mồi (primers) được xem là một nhân tố quan trọng quyết định phản ứng PCR có diễn ra thành công hay không vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu. Do đó, để tối ưu hóa phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành xác định tính đặc hiệu của hai cặp mồi (Cp1-F và Cp1-R) và (Cp2-F và Cp2-R).
Để xác định tính đặc hiệu của cặp mồi Cp1-F và Cp1-R, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Cp1-F và Cp1-R với các DNA của các vi khuẩn đã được nêu ở trong phần phương pháp (mục 2.3.5.2.). Nhiệt độ bắt cặp T = T1opt = 530C.
Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được chạy điện di trên gel agarose 1,5%. Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu của cặp mồi Cp1- F và Cp1-R được thể hiện ở hình 3.3.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Hình 3.3. Kết quả chạy PCR xác định tính đặc hiệu của cặp mồi ngoài Cp1-F và Cp1-R
500 bp
100 bp
576bp
(Trong đó: Giếng 1(-): Đối chứng âm; giếng 2 (C.sp): Chlamydophila pneumoniae; giếng 3 (c.sp): Chlamydia trachomatis; giếng 4, 5 (Cp. và Cp):
Chlamydophila psittaci; giếng 6 (M): marker (100bp DNA ladder); giếng 7:
Escherichia coli; giếng 8: Salmonella spp.; giếng 9: Clostridium perfringens; giếng 10: Mychoplasma gallisepticum; giếng 11: Pasteurella multocida; giếng 12: Virus gây bệnh Newcastle; giếng 13: Virus gây bệnh IB; giếng 14: Virus cúm A H5N1)
Từ kết quả điện di thể hiện ở hình 3.3, chúng tôi nhận thấy rằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Cp1-F và Cp1-R đã cho kết quả dương tính với các chủng vi khuẩn thuộc giống Chlamydophila hay Chlamydia. Các chủng vi khuẩn khác (Escherichia coli, Salmonella spp., Clostridium perfringens, Mycoplasma gallisepticum, Pasteurella multocida, virus gây bệnh Newcastle, virus gây bệnh IB, virus cúm A-H5N1) đều cho kết quả âm tính. Nói cách khác, cặp mồi trong Cp1-F và Cp1-R chỉ bắt cặp một cách chính xác với khuôn mẫu DNA của giống
Chlamydophila hay Chlamydia mà không bắt cặp với các DNA của các loài vi khuẩn khác. Điều này chứng tỏ cặp mồi Cp1-F và Cp1-R có tính đặc hiệu cao và vì vậy có thể được sử dụng cho phản ứng PCR1 trong chu trình nhiệt chuẩn PCR phát hiện Chlamydophila psittaci trong mẫu bệnh phẩm.
Để xác định tính đặc hiệu của cặp mồi Cp2-F và Cp2-R, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR2 sử dụng sản phẩm được khuếch đại trong phản ứng PCR1 với cặp mồi trong Cp2-F và Cp2-R. Sản phẩm PCR2 sau đó được xác định bằng phương pháp điện di trên gen agarose 1,5 %.
Kết quả điện di sản phẩm PCR2 xác định tính đặc hiệu của cặp mồi Cp2-F và Cp2-R được thể hiện ở hình 3.4.
Kết quả điện di thể hiện ở hình 3.4 cho thấy có hai vệt băng sáng tương ứng với hai mẫu DNA của vi khuẩn Cp. psittaci. Ngược lại, kết quả điện di âm tính đối với mẫu chứa DNA của vi khuẩn Chlamydophila pneumoniae và Chlamydia trachomatis. Điều này khẳng định cặp mồi Cp2-F và Cp2-R chỉ bắt cặp trên khuôn DNA của vi khuẩn Chlamydophila psittaci mà không bắt cặp trên các mạch DNA
khác. Nói cách khác, cặp mồi Cp2-F và Cp2-R có tính đặc hiệu cao với loài
Chlamydophila psittaci nên có thể được sử dụng cho phản ứng nested PCR giai đoạn hai (PCR2) nhằm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydophila psittaci trong mẫu bệnh phẩm.
1 2 3 4 5 6
Hình 3.4. Kết quả chạy PCR xác định tính đặc hiệu của cặp mồi trong Cp2-F và Cp2-R
(Trong đó: Giếng 1 (-): đối chứng âm; Giếng 2 (M): marker (100bp DNA ladder); giếng 3 (C.sp): Chlamydophila pneumoniae; giếng 4 (Csp): Chlamydia trachomatis; giếng 5, 6 (Cp.): Chlamydophila psittaci)
3.2. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm Cp. psittaci trên gà tại Khánh Hòa
Để xác định đối tượng gà có nhiễm Cp. psittaci hay không, chúng tôi thực hiện thử nghiệm nested PCR sử dụng một cặp mồi ngoài (Cp1-F và Cp1-R) và một cặp mồi trong (Cp2-F và Cp2-R). Như vậy, thử nghiệm gồm hai lần PCR: PCR1 và PCR2.
389bp
500 bp 100 bp 1500 bp
Kết quả phản ứng PCR1 trên 29 mẫu (1-29) thu tại thị xã Ninh Hòa (Khánh Hòa) và 35 mẫu (30-64) thu tại huyện Cam Lâm (Khánh Hòa) được thể hiện ở hình 3.5 và hình 3.6.
Các mẫu cho kết quả dương tính trong phản ứng PCR1 bao gồm 16 mẫu có mã số mẫu như sau: 3, 4, 7, 9, 11, 13, 18, 26, 30, 37, 38, 41, 45, 61, 63 và 64. Những mẫu cho kết quả dương tính trong phản ứng PCR1 được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR2 với cặp mồi trong Cp2-F và Cp2-R.
Hình 3.5. Kết quả chạy PCR1 của 29 mẫu ngoáy hầu họng (1-29) thu tại thị xã Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa
(Trong đó, M : marker (100bp DNA ladder); (+) : đối chứng dương; (-) : đối chứng âm)
100 bp 500 bp
Hình 3.6. Kết quả chạy PCR1 của 35 mẫu ngoáy hầu họng (30-64) thu tại huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa
(Trong đó, M : marker (100bp DNA ladder); (+) : đối chứng dương; (-) : đối chứng âm)
Kết quả phản ứng PCR2 được thể hiện ở hình 3.7 và 3.8.
Kết quả điện di ở hình 3.7 và 3.8 cho thấy các mẫu dương tính với vi khuẩn
Cp. psittaci bao gồm 16 mẫu có mã số mẫu như sau: 3, 4, 7, 9, 11, 13, 18, 26, 30, 37, 38, 41, 45, 61, 63 và 64. Đặc biệt, mẫu 11 cho kết quả điện di mờ ở cả phản ứng PCR1 và phản ứng PCR2. Điêu này chứng tỏ lượng DNA của vi khuẩn trong mẫu 11 rất ít và do đó, dù qua quá trình khuếch đại thì lượng DNA nhân lên vẫn không đủ để cho kết quả điện di có thể nhìn thấy rõ.
Tổng hợp kết quả PCR các mẫu thu được tại hai địa điểm Ninh Hòa và Cam Lâm (Khánh Hòa) được thể hiện ở bảng 3.3.
576bp 1500 bp
500 bp 100 bp
Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả PCR các mẫu thu được tại hai địa điểm Ninh Hòa và Cam Lâm (Khánh Hòa)
STT Địa phương Số mẫu xét nghiệm Số mẫu dương tính Tỷ lệ dương tính (%) 1 Ninh Hòa 29 8 27,59 2 Cam Lâm 35 8 22,86 Tổng 64 16 25,0
Hình 3.7. Kết quả chạy PCR2 các mẫu dương tính với PCR1 (3, 4, 7, 9, 11, 13, 18 và 26)
(Trong đó, M: marker; (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm)
1500 bp
500 bp
100 bp
Hình 3.8. Kết quả PCR2 các mẫu dương tính với PCR1 (30, 37, 38, 41, 45, 61, 63 và 64)
(Trong đó, M: marker; (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm)
3.2.1. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo độ tuổi của gà
Gà ở các độ tuổi khác nhau thường có hệ thống miễn dịch khác nhau và dinh dưỡng khác nhau. Do đó tuổi của gà sẽ có ảnh hưởng khá lớn đến mức độ nhiễm vi khuẩn trên gà. Vì vậy, để xác định tỷ lệ nhiễm Cp. psittaci trên gà theo độ tuổi, chúng tôi tiến hành thu thập như sau: 32 mẫu ngoáy hầu họng của gà có độ tuổi 0-3 tháng; 7 mẫu gà độ tuổi 4-6 tháng; 6 mẫu gà độ tuổi 7-9 tháng; 14 mẫu gà độ tuổi 10-12 tháng và 5 mẫu gà độ tuổi trên 12 tháng (ở đây là 36 tháng). Các mẫu sau khi thu thập sẽ được đưa về phòng thí nghiệm để tách chiết DNA và được chạy nested PCR để xác định tỷ lệ nhiễm Cp. psittaci. Kết quả phân tích tỷ lệ nhiễm Cp. psittaci
trên các mẫu ngoáy hầu họng gà thu thập theo độ tuổi của gà được thể hiện ở bảng 3.4. M + - 30 37 38 41 45 61 63 64 576bp 389bp 500 bp 1500 bp 100 bp
Bảng 3.4. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo độ tuổi của gà STT Độ tuổi (tháng) Số mẫu xét
nghiệm Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%)
1 ≤ 3 32 13 40,63 2 (3;6] 7 1 14,29 3 (6;9] 6 1 16,67 4 (9;12] 14 0 0 5 > 12 5 1 20,0 6 Tổng 64 16 25,0 (*: P-value > 0,05)
Kết quả phân tích tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo độ tuổi của gà ở bảng 3.4 cho thấy, các mẫu ngoáy hầu họng gà ở độ tuổi dưới 3 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm Cp. psittaci cao nhất (40,63%) trong khi các mẫu ngoáy hầu họng gà ở độ tuổi từ 10 đến 12 tháng tuổi không nhiễm khuẩn Cp. psittaci. Ngoài ra, các mẫu ngoáy hầu họng gà ở độ tuổi lớn hơn 12 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm Cp. psittaci là 20%, cao hơn so với tỷ lệ nhiễm Cp. psittaci của các mẫu ngoáy hầu họng gà ở nhóm tuổi từ 4 đến 6 tháng tuổi (14,29%) và các mẫu thuộc nhóm tuổi từ 7 đến 9 tháng tuổi (16,67%). Tuy nhiên do lượng mẫu thu được còn ít nên kết quả chưa mang tính thống kê mà chỉ là những khảo sát ban đầu về sự nhiễm Cp. psittaci
trên gà theo độ tuổi.
Mặt khác, kết quả khảo sát ở trên cũng cho thấy, nhìn chung, các mẫu gà ở độ tuổi thấp hơn có tỷ lệ nhiễm cao hơn so với các các mẫu thu ở gà có độ tuổi lớn hơn. Nguyên nhân có thể là do gà ở độ tuổi thấp thuộc nhóm gà con mới nở hoặc còn nhỏ nên khả năng đề kháng của cơ thể đối với các tác nhân gây bệnh, cụ thể là vi khuẩn Cp. psittaci, còn thấp. Chính vì vậy, chúng là đối tượng dễ bị nhiễm khuẩn và chịu tác động nhiều nhất từ môi trường. Do đó, các điều kiện chăm sóc gà con
mới đẻ và gà còn nhỏ cần phải được chú ý hơn để đảm bảo sức khỏe và sức đề kháng của chúng đối với các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn Cp. psittaci.
3.2.2. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo loại gà
Giống gà khác nhau có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm bệnh trên gà. Do đó, chúng tôi tiến hành thu thập 50 mẫu ngoáy hầu họng của giống gà ta và 14 mẫu ngoáy hầu họng của gà thuộc giống chuyên trứng. Các mẫu được tách chiết DNA và được chạy nested PCR để xác định sự có mặt của vi khuẩn Cp. psittaci trong mẫu. Kết quả phân tích tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng nhiễm Cp. psittaci theo giống gà được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo loại gà
Loại gà Số mẫu xét nghiệm Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) * Gà ta 50 12 24,0 Giống chuyên trứng 14 4 28,57 Tổng 64 16 25,0 (*: P-value > 0,05)
Kết quả tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo loại gà ở bảng 3.5 cho thấy tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà ta nhiễm Cp. psittaci là 24%, trong khi mẫu ngoáy hầu họng gà thuộc giống chuyên trứng có tỷ lệ nhiễm Cp. psittaci là