2.3.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm là dịch ngoáy hầu họng của gà các lứa tuổi nuôi tại Khánh Hòa.
2.3.2. Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu
- Dung dịch đệm PBS (Phosphate buffer saline) 1X với các thành phần: NaCl: 0,8 g/l; KCl: 0,2 g/l; KH2PO4:0,2 g/l; MgHPO4.7H2O: 1,15 g; Nước cất: 1 lít. Điều chỉnh pH môi trường đạt 7,2 ± 0,2. Hấp ở 1210C trong 15 phút. Sau đó để nguội và cho vào các ống nghiệm nhựa có nút, mỗi ống 2 ml. Bảo quản ở nhiệt độ 40C.
- Bộ kit chiết tách DNA: QIAamp DNA Mini Kit (51304, Qiagen) có thành phần như bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần bộ kít tách chiết QIAamp DNA Mini Kit
STT Tên thành phần Số lượng / thể tích
1 QIAamp Mini Spin Columns 50 ống
2 Collection Tubes (2 ml) 150 ống
3 Buffer AL 12 ml
4 Buffer ATL 10 ml
5 Buffer AW1 (concentrate) 19 ml
6 Buffer AW2 (concentrate) 13 ml
7 Buffer AE 22 ml
8 Proteinase K 1,25 ml
- 100bp DNA ladder (Promega, Madison, USA) - Đệm TBE 1X (Tris/Borate/EDTA)
- Agarose
- Thuốc nhuộm Ethidium bromide (C21H20BrN3)
- GoTaq Green master mix gồm: Tag DNA polymerase; dNTPs gồm dATPs, dCTPs, dGTPs và dTTPs; MgCl2; Reaction buffers (Đệm phản ứng)
- Mồi cho phản ứng PCR: Cp1-F, Cp1-R, Cp2-F và Cp2-R do IDT (Mỹ) cung cấp
- Mẫu DNA Cp. psittaci chuẩn do Viện IZSVe (Ý) cung cấp
2.3.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Ống eppendorf 1.5ml vô trùng - Ống nghiệm nhựa có nút - Micropipette các loại
- Tủ ấm 250C (± 20C) và 300 C (± 20C) - Máy li tâm lạnh
- Buồng cấy an toàn sinh học cấp độ 2 - Máy PCR Thermal Px2
- Tủ đông -200C - Máy Vortex
- Bộ nguồn và khay điện di
- Hệ thống máy đọc kết quả điện di trên gel - Nồi hấp thanh trùng
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu ngoáy hầu họng ở gà
Dùng tăm bông vô trùng ngoáy vào phần hầu họng của gà rồi cho vào ống nghiệm có nút chứa dung dịch đệm PBS. Sau đó bảo quản lạnh mẫu ở 40C và đem về phòng thí nghiệm xử lý.
2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA Cp. psittaci từ mẫu ngoáy hầu họng 2.4.2.1. KIT chiết tách DNA 2.4.2.1. KIT chiết tách DNA
Sử dụng bộ kit chiết tách DNA: QIAamp DNA Mini Kit của hãng sản xuất Qiagen (Code: 51304)
2.4.2.2. Quy trình chiết tách DNA
Bước 1. Xử lý mẫu
- Vortex ống li tâm hoặc ống nghiệm chứa mẫu trong 15 giây
- Hút 1ml mẫu vào ống eppendorf, sau đó li tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng (25oC)
- Hút 400 µl nước nổi cho vào ống eppendorf mới
Tiến hành chiết tách DNA theo hướng dẫn của QIAamp DNA Mini Kit
Bước 2. Bổ sung 20 µl Proteinase K và 400 µl dung dịch Buffer AL, trộn đều 15 giây
Bước 3. Ủ các ống eppendorf ở nhiệt độ 560C trong 10 phút trong waterbath; sau đó ly tâm nhanh (spindown) mẫu trong 30 giây
Bước 4. Bổ sung 400 µl ethanol (96-100%) vào ống eppendorf, ly tâm nhanh (spindown) mẫu trong 30 giây
Bước 5. Chuyển 700 µl mẫu ở bước 4 sang ống eppendorf đã gắn ống lọc, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút
Bước 6. Loại bỏ nước ở ống eppendorf, chuyển lượng mẫu còn lại ở bước 4 sang ống eppendorf đã gắn ống lọc vừa ly tâm ở bước 5, ly tâm 8.000 vòng/ phút trong 1 phút
Bước 7. Loại bỏ nước ở ống eppendorf, bổ sung 500 µl dung dịch Buffer AW1, ly tâm 8.000 vòng/ phút trong 1 phút
Bước 8. Loại bỏ nước ở ống eppendorf, bổ sung 500 µl dung dịch Buffer AW2, ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 3 phút
Bước 9. Loại bỏ nước ở ống eppendorf, ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút
Bước 10. Lấy ống lọc bỏ vào ống eppendorf mới, bổ sung 150 µl dung dịch Buffer AE, ủ ấm 1 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 8.000 vòng/ phút trong 1 phút
Thu hoạch DNA trong ống eppendorf. DNA được bảo quản ở nhiệt độ -200C để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.4.3. Chuẩn hóa phản ứng nested PCR phát hiện Cp. psittaci trong mẫu bệnh phẩm
2.4.3.1. Phương pháp xác định nhiệt độ gắn tối ưu của mồi
Để xây dựng được chu trình nhiệt chuẩn cho phản ứng nested PCR phát hiện
Cp. psittaci trong mẫu bệnh phẩm, chúng tôi tiến hành xác định nhiệt độ gắn tối ưu của hai cặp mồi: cặp mồi trong (Cp1-R và Cp1-F) và cặp mồi ngoài (Cp2-R và Cp2- F) bằng phản ứng gradient-PCR tương ứng với dãy thay đổi nhiệt độ gắn của mồi (Ta). Trình tự mồi được thể hiện ở bảng 2.3.
- Đối với phản ứng PCR1, dãy thay đổi nhiệt độ gắn của cặp mồi Cp1-F và Cp1-R là: Ta= 48-580C (48,00C; 48,30C; 48,90C; 49,80C; 50,90C; 52,20C; 53,50C; 54,90C; 56,40C; 57,30C; 57,80C và 58,10C)
- Đối với phản ứng PCR2, dãy thay đổi nhiệt độ gắn của cặp mồi Cp2-R và Cp2-F là: Ta= 50-620C (50,00C; 50,40C; 51,00C; 52,20C; 53,50C; 55,00C; 56,60C; 58,30C; 60,10C; 61,20C; 61,60C và 62,20C)
Kết quả của phản ứng PCR1 và PCR2 sẽ được xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%.
Đọc kết quả: Kết quả nhiệt độ gắn tối ưu của cặp mồi trong (T1opt) và cặp mồi ngoài (T2opt) thể hiện ở các vạch trắng trên thạch agarose hiện lên sau khi điện di. Nhiệt độ gắn tối ưu của mồi được chọn là nhiệt độ cao nhất trong dãy nhiệt độ khảo sát cho vạch trắng sáng và rõ.
2.4.3.2. Phương pháp xác định tính đặc hiệu của mồi
Tính đặc hiệu của mồi thể hiện ở đặc tính chỉ bắt cặp với DNA đích mà không bắt cặp với các DNA khác. Do đó, để xác định tính đặc hiệu của hai cặp mồi (Cp1-F, Cp1-R) và (Cp2-F, Cp2-R), chúng tôi tiến hành thiết lập chương trình PCR1 và PCR2 như sau:
- Phản ứng PCR1 được thực hiện với việc sử dụng cặp mồi Cp1-F và Cp1-R. Các DNA khác nhau được sử dụng trong phản ứng PCR bao gồm: (1) DNA đích của các vi khuẩn Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis và (2) DNA của một số loài khác bao gồm: Escherichia coli, Salmonella spp., Clostridium perfringens, Mycoplasma gallisepticum, Pasteurella multocida, Virus gây bệnh Newcastle, virus gây bệnh IB (Infectious Bronchitis) và virus cúm A-H5N1.
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR1 như sau:
- Giai đoạn một: 940C trong 10 phút (một chu kỳ) - Giai đoạn hai: (35 chu kỳ)
Bước 1: 940C trong 1 phút
Bước 2: T= T1opt (0C) trong 1 phút
Bước 3: 720C trong 1 phút
- Giai đoạn ba: ủ ở 720C trong 10 phút (một chu kỳ)
- Giai đoạn bốn: Hạ nhiệt độ xuống 40C để bảo quản mẫu PCR
Kết quả phản ứng PCR1 sẽ được xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%.
Ở phản ứng PCR2, sản phẩm PCR dương tính của phản ứng PCR1 sẽ được sử dụng cho phản ứng PCR2 sử dụng cặp mồi Cp2-F và Cp2-R.
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR2 như sau:
- Giai đoạn một: 940C trong 10 phút (một chu kỳ) - Giai đoạn hai: (30 chu kỳ)
Bước 1: 940C trong 1 phút
Bước 2: T= T2opt(0C) trong 1 phút
- Giai đoạn ba: ủ ở 720C trong 10 phút (một chu kỳ)
- Giai đoạn bốn: Hạ nhiệt độ xuống 40C để bảo quản mẫu PCR
Kết quả phản ứng PCR2 sẽ được xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%.
Đọc kết quả: Kết quả điện di được đọc qua máy đọc kết quả điện di. Kết quả dương tính sẽ cho các vạch trắng trên thạch gel agarose tương ứng với DNA có kích thước 384-404 bp và ngược lại kết quả âm tính sẽ không xuất hiện vạch trắng nào.
2.4.4. Phương pháp nested PCR phát hiện gen omp1
Phương pháp nested PCR gồm hai giai đoạn tương ứng với hai lần khuếch đại: - Lần khuếch đại thứ nhất (PCR1): còn được gọi là PCR vòng ngoài do sử dụng cặp mồi ngoài (Cp1-F và Cp1-R) nhằm khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu giống
Chlamydophila hay Chlamydia (theo hệ thống phân loại cũ). Vị trí gắn của cặp mồi ngoài nằm trong các vùng bảo tồn giữa VD II/ VD III và vùng downstream VD IV (hình 2.1). Sản phẩm tạo thành trong lần khuếch đại thứ nhất có kích thước 576-597 bp.
Trình tự nucleotide của cặp mồi ngoài (Cp1-F và Cp1-R) được thể hiện ở bảng 2.2. - Lần khuếch đại thứ hai (PCR2): còn gọi là PCR vòng trong. Sản phẩm DNA được tạo thành từ lần khuếch đại thứ nhất sẽ được cho vào ống PCR có chứa cặp mồi trong (Cp2-F và Cp2-R) nhằm khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu loài
Chlamydophila psittaci. Vị trí gắn của cặp mồi trong nằm ở vùng trái của VD III và vùng phải của VD IV (hình 2.1). Sản phẩm tạo thành trong lần khuếch đại thứ hai có kích thước 389-404 bp.
Trình tự nucleotide của cặp mồi trong (Cp2-F và Cp2-R) được thể hiện ở bảng 2.2.
Hình 2.1. Sơ đồ minh họa vị trí gắn hai cặp mồi Cp1-F, Cp1-R, Cp2-F và Cp2-R trên gen omp1 của vi khuẩn Chlamydophila psittaci (LD: leading peptide và VD I-IV : 4 vùng biến đổi I-IV)
Bảng 2.2. Trình tự mồi dùng cho phản ứng nested PCR
Tên Trình tự nucleotide (5' 3')* Base
Cp1-F GCI YTI TGG GAR TGY GGI TGY GCI AC 26
Cp1-R TTA GAA ICK GAA TTG IGC RTT IAY GTG IGC IGC 33
Cp2-F GTA ATT TCI AGC CCA GCA CAA TTY GTG 27
Cp2-R CCR CAA GMT TTT CTR GAY TTC AWY TTG TTR AT 32 * Degenerate nucleotides: K=G, T; M=A, C; R=A, G; W=A, T; Y=C , T; I=inosine. Thành phần của một phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần của một phản ứng nested PCR
Hóa chất Nồng độ PCR
(µl/phản ứng)
Nước 11,5
GoTaq Green master mix 1X 10
Mồi xuôi 10µM 0,25
Mồi ngược 10µM 0,25
DNA 3
Hỗn hợp trên được trộn đều, chuyển vào máy PCR và tiến hành chạy PCR.
2.4.5. Phát hiện DNA: Phương pháp điện di trên gel agarose
Sản phẩm phản ứng PCR được điện di trên thạch agarose 1,5% có bổ sung ethidium bromide.
Các bước chuẩn bị thạch agarose:
1. Tiến hành lắp khay và lược vào bể điện di. 2. Chuẩn bị gel agarose 1,5%:
Cân 1,5 gam agarose hòa vào 100 ml dung dịch đệm TBE 1X trong bình Schott chịu nhiệt.
Đun sôi 5 phút hoặc hơn cho tới khi agarose tan hết
Để nguội đến khoảng 500C
Bổ sung 6 µl Ethidium Bromide
Xoay, lắc nhẹ bình (tránh tạo bọt) để trộn đều Ethidium Bromide 3. Rót hỗn hợp trên vào khay và để một khoảng thời gian 30 phút để gel
đông lại.
4. Sau khi gel đông, tháo lược, ta được một dãy các giếng tra gel. Đổ dung dịch đệm TBE vào bể điện di cho ngập mặt gel.
5. Tiến hành tra mẫu vào các giếng, mỗi giếng 10 µl mẫu.
6. Tra DNA ladder, đối chứng dương (chứa DNA chuẩn của vi khuẩn
Chlamydophila psittaci) và đối chứng âm vào các giếng. 7. Đậy nắp buồng điện di và cắm 2 điện cực vào.
Chú ý khi cắm điện cực phải cắm đầu âm ở vị trí các giếng, còn đầu dương là đầu còn lại vì DNA mang điện tích âm sẽ di chuyển về phía điện tích dương.
8. Điện di với hiệu điện thế 115V trong 45 phút.
Đọc kết quả: Sau khi điện di, thạch agarose được đưa vào máy đọc kết quả điện di để xác định kết quả điện di. Sản phẩm của phản ứng PCR thực hiện thành công là những vạch trắng hiện lên dưới tác động của tia UV trong máy đọc điện di. Ngược lại, đối với các phản ứng PCR không thành công, kết quả điện di là những vạch trắng rất mờ hoặc không có vạch trắng.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Chuẩn hóa phản ứng nested PCR 3.1.1. Xác định nhiệt độ gắn tối ưu của mồi 3.1.1. Xác định nhiệt độ gắn tối ưu của mồi
Ta (annealing temperature) là nhiệt độ cho phép mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn mẫu. Ta thường chênh lệch 5 – 100C so với Tm (melting temperature). Tm còn được gọi là nhiệt độ nóng chảy của DNA, là nhiệt độ mà tại đó một nửa số liên kết hydro nối hai mạch DNA bị phá vỡ. Mỗi mồi đều có Tm riêng tùy thuộc vào thành phần và số lượng nucleotide tạo thành mồi đó. Tương tự, mỗi mồi cũng có khoảng nhiệt độ mà ở đó chúng bắt cặp tốt nhất và đặc hiệu nhất với mạch khuôn mẫu. Do đó, để phản ứng PCR đạt hiệu quả cao thì việc lựa chọn nhiệt độ bắt cặp của mồi một cách phù hợp là công việc quan trọng. Một cách cụ thể, cần chọn Ta sao cho mồi bắt cặp bổ sung hoàn toàn với mạch khuôn chứa đoạn DNA cần khuếch đại và sau phản ứng PCR chỉ thu nhận sản phẩm khuếch đại mong muốn. Do vậy, cần tiến hành thử nghiệm các phản ứng PCR ở những nhiệt độ Ta gần Tm để tìm Ta thích hợp nhất sao cho sản phẩm PCR thu được là duy nhất.
* Nhiệt độ gắn của cặp mồi Cp1-F và Cp1-R xác định Chlamydophila spp.
Để có thể xác định được nhiệt độ gắn thích hợp của cặp mồi Cp1-F và Cp1-R cho phản ứng PCR1, phản ứng được thực hiện ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau dao động trong khoảng Ta= 48-580C. Khoảng nhiệt độ này được thiết lập dựa trên nhiệt độ nóng chảy của mồi được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nhiệt độ nóng chảy của các cặp mồi
STT Mồi Nhiệt độ nóng chảy (0C)
1 Cp1-F 68,8
2 Cp1-R 68
3 Cp2-F 59,4
Dãy thay đổi nhiệt độ được phân chia tự động từ máy luân nhiệt như sau: 48,00C; 48,30C; 48,90C; 49,80C; 50,90C; 52,20C; 53,50C; 54,90C; 56,40C; 57,30C; 57,80C và 58,10C.
Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn tối ưu của cặp mồi Cp1-F và Cp1-R được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả điện di gradient PCR gen omp1 của vi khuẩn
Chlamydophila spp. sử dụng cặp mồi Cp1-F và Cp1-R với nhiệt độ
bắt cặp dao động trong khoảng Ta = 48-580C (M = Marker (100bp DNA ladder))
Sau khi phân tích sản phẩm gradient PCR trên thạch agarose, chúng tôi nhận thấy, khoảng nhiệt độ từ 480C đến 57,30C đã cho sản phẩm PCR rõ nét (hình 3.1). Ngược lại, khoảng nhiệt độ từ 57,80C đến 58,10C cho kết quả dương tính nhưng vệt băng DNA tương đối mờ, chứng tỏ cặp mồi Cp1-F và Cp1-R tuy có bắt cặp trên khuôn mẫu DNA nhưng hiệu suất bắt cặp không cao. Chính vì vậy, lượng DNA đích chỉ có thể khuếch đại lên với số lượng không nhiều và do đó cho kết quả điện di tương đối mờ. Từ những phân tích trên, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ gắn của cặp mồi Cp1-F và Cp1-R là 530C để xây dựng chương trình chuẩn cho phản ứng PCR1 phát hiện vi khuẩn Chalamydophila spp.trong mẫu bệnh phẩm.
1500 bp
100 bp 500 bp
* Nhiệt độ của cặp mồi Cp2-F và CP2-R xác định Chlamydophila psittaci
Để xác định được nhiệt độ gắn thích hợp của cặp mồi Cp2-F và Cp2-R cho phản ứng PCR2, chúng tôi thực hiện phản ứng với dãy thay đổi nhiệt độ gắn mồi trong khoảng: Ta=50-620C. Khoảng nhiệt độ này được thiết lập dựa trên nhiệt độ nóng chảy của cặp mồi Cp2-F và Cp2-R (xem bảng 3.1).
Dãy thay đổi nhiệt độ được phân chia tự động từ máy luân nhiệt như sau: 50,00C; 50,40C; 51,00C; 52,20C; 53,50C; 55,00C; 56,60C; 58,30C; 60,10C; 61,20C; 61,60C và 62,20C.
Sản phẩm của PCR1 được sử dụng để chạy tiếp PCR2.
Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn tối ưu của cặp mồi Cp2-F và Cp2-R được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Kết quả điện di gradient PCR gen omp1 của vi khuẩn
Chlamydophila spp. sử dụng cặp mồi Cp2-F và Cp2-R với nhiệt
độ bắt cặp dao động trong khoảng Ta = 50-620C
(Trong đó, M: Marker (100bp DNA ladder))
Sau khi phân tích sản phẩm gradient PCR trên thạch agarose, chúng tôi nhận thấy, khoảng nhiệt độ 50,00C đến 55,00C đã cho sản phẩm PCR rõ nét (hình 3.2).
500 bp 1500 bp
100 bp
Trong khi đó, khoảng nhiệt độ từ 56,60C đến 61,20C dù cho kết quả dương tính nhưng vệt băng tương đối mờ, đặc biệt là vệt băng ở nhiệt độ 61,20C, chứng tỏ khoảng nhiệt độ này cặp mồi Cp2-F và Cp2-R có bắt cặp vào khuôn mẫu DNA đích nhưng hiệu suất bắt cặp không cao nên lượng DNA đích tạo thành không nhiều. Khoảng nhiệt độ từ 61,60C đến 62,20C hầu như cho kết quả âm tính, điều này chứng tỏ trong khoảng nhiệt độ này cặp mồi Cp2-F và Cp2-R hầu như không bắt cặp trên