Trong phản ứng PCR, mồi (primers) được xem là một nhân tố quan trọng quyết định phản ứng PCR có diễn ra thành công hay không vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu. Do đó, để tối ưu hóa phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành xác định tính đặc hiệu của hai cặp mồi (Cp1-F và Cp1-R) và (Cp2-F và Cp2-R).
Để xác định tính đặc hiệu của cặp mồi Cp1-F và Cp1-R, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Cp1-F và Cp1-R với các DNA của các vi khuẩn đã được nêu ở trong phần phương pháp (mục 2.3.5.2.). Nhiệt độ bắt cặp T = T1opt = 530C.
Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được chạy điện di trên gel agarose 1,5%. Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu của cặp mồi Cp1- F và Cp1-R được thể hiện ở hình 3.3.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Hình 3.3. Kết quả chạy PCR xác định tính đặc hiệu của cặp mồi ngoài Cp1-F và Cp1-R
500 bp
100 bp
576bp
(Trong đó: Giếng 1(-): Đối chứng âm; giếng 2 (C.sp): Chlamydophila pneumoniae; giếng 3 (c.sp): Chlamydia trachomatis; giếng 4, 5 (Cp. và Cp):
Chlamydophila psittaci; giếng 6 (M): marker (100bp DNA ladder); giếng 7:
Escherichia coli; giếng 8: Salmonella spp.; giếng 9: Clostridium perfringens; giếng 10: Mychoplasma gallisepticum; giếng 11: Pasteurella multocida; giếng 12: Virus gây bệnh Newcastle; giếng 13: Virus gây bệnh IB; giếng 14: Virus cúm A H5N1)
Từ kết quả điện di thể hiện ở hình 3.3, chúng tôi nhận thấy rằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Cp1-F và Cp1-R đã cho kết quả dương tính với các chủng vi khuẩn thuộc giống Chlamydophila hay Chlamydia. Các chủng vi khuẩn khác (Escherichia coli, Salmonella spp., Clostridium perfringens, Mycoplasma gallisepticum, Pasteurella multocida, virus gây bệnh Newcastle, virus gây bệnh IB, virus cúm A-H5N1) đều cho kết quả âm tính. Nói cách khác, cặp mồi trong Cp1-F và Cp1-R chỉ bắt cặp một cách chính xác với khuôn mẫu DNA của giống
Chlamydophila hay Chlamydia mà không bắt cặp với các DNA của các loài vi khuẩn khác. Điều này chứng tỏ cặp mồi Cp1-F và Cp1-R có tính đặc hiệu cao và vì vậy có thể được sử dụng cho phản ứng PCR1 trong chu trình nhiệt chuẩn PCR phát hiện Chlamydophila psittaci trong mẫu bệnh phẩm.
Để xác định tính đặc hiệu của cặp mồi Cp2-F và Cp2-R, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR2 sử dụng sản phẩm được khuếch đại trong phản ứng PCR1 với cặp mồi trong Cp2-F và Cp2-R. Sản phẩm PCR2 sau đó được xác định bằng phương pháp điện di trên gen agarose 1,5 %.
Kết quả điện di sản phẩm PCR2 xác định tính đặc hiệu của cặp mồi Cp2-F và Cp2-R được thể hiện ở hình 3.4.
Kết quả điện di thể hiện ở hình 3.4 cho thấy có hai vệt băng sáng tương ứng với hai mẫu DNA của vi khuẩn Cp. psittaci. Ngược lại, kết quả điện di âm tính đối với mẫu chứa DNA của vi khuẩn Chlamydophila pneumoniae và Chlamydia trachomatis. Điều này khẳng định cặp mồi Cp2-F và Cp2-R chỉ bắt cặp trên khuôn DNA của vi khuẩn Chlamydophila psittaci mà không bắt cặp trên các mạch DNA
khác. Nói cách khác, cặp mồi Cp2-F và Cp2-R có tính đặc hiệu cao với loài
Chlamydophila psittaci nên có thể được sử dụng cho phản ứng nested PCR giai đoạn hai (PCR2) nhằm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydophila psittaci trong mẫu bệnh phẩm.
1 2 3 4 5 6
Hình 3.4. Kết quả chạy PCR xác định tính đặc hiệu của cặp mồi trong Cp2-F và Cp2-R
(Trong đó: Giếng 1 (-): đối chứng âm; Giếng 2 (M): marker (100bp DNA ladder); giếng 3 (C.sp): Chlamydophila pneumoniae; giếng 4 (Csp): Chlamydia trachomatis; giếng 5, 6 (Cp.): Chlamydophila psittaci)