nghiên cứu quá trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít

Axit lactic ñược hình thành do quá trình lên men tự nhiên trong các sản phẩm như phomai, sữa chua, nước tương, bột chua, sản phẩm từ thịt, rau muối chua… Axit lactic ñược dùng sản xuất t

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH

Đà Nẵng - Năm 2011

* Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng

- Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng

Số hiệu

1.1 Hình thái và kiểu lên men lactic của một số vi khuẩn lactic 111.2 Thành phần hóa học của hạt mít 21 2.1 Thành phần môi trường lên men axit lactic 28 2.2 Thành phần môi trường MRS Agar 29 3.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ xút ñến quá trình tách lớp vỏ nâu ở

hạt mít

31

3.2 Hàm lượng tinh bột của hạt mít 33 3.3 Kết quả ño OD của dịch kiểm chứng và mẫu thí nghiệm 34 3.4 Hàm lượng ñường khử tạo thành sau quá trình thủy phân 38 3.5 Hiệu suất lên men theo nồng ñộ dịch ñường 48 3.6 Các ñiều kiện thí nghiệm TYT 22 51 3.7 Kết quả thí nghiệm theo thực nghiệm TYT 22 52 3.8 Bảng giá trị tính phương sai dư 55 3.9 Kết quả tính bước chuyển ñộng δj của các yếu tố 56 3.10 Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa theo ñường lên dốc 57

1.11 Hình chụp phân tử tinh bột hạt mít 22 2.1 Máy so màu hiệu JENWAY 6305 23 2.2 Tủ sấy nguyên liệu 23 3.1 Bột hạt mít thu nhận 33 3.2 Khuẩn lạc L.casei sau khi hoạt hóa 36 3.3 Đường chuẩn glucoza 37 3.4 Dịch ñường sau thủy phân 39 3.5 Dịch ñường ñã khảo sát nồng ñộ trước lúc lên men 40 3.6 Các khuẩn lạc Lactobacillus casei ở các mức pha loãng 10-3 42 3.7 Đường cong biểu diễn mật ñộ tế bào ở các mức pha loãng

khác nhau

42

3.10 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hàm lượng axit lactic tạo thành 45 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống ñến lượng axit lactic tạo thành 46 3.12 Ảnh hưởng của nồng ñộ dịch ñường ñến hàm lượng axit lactic tạo

EMP : Embden-Mayerhoff-Parnas

ATP : Adenosine Triphosphate

ADP : Adenosine Diphosphate

PP : Pentoza Phosphat

L.bulgaricus : Lactobacillus bulgaricus:

L acidophilus : Lactobacillus acidophilus

Opt : Optimum

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Số liệu, kết quả báo cáo trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố ở bất cứ công trình nào khác

Tác giả

Hồ Thị Hảo

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Axit lactic là axit hữu cơ không màu, có hương vị nhẹ Axit lactic ñược hình thành do quá trình lên men tự nhiên trong các sản phẩm như phomai, sữa chua, nước tương, bột chua, sản phẩm từ thịt, rau muối chua… Axit lactic ñược dùng sản xuất trong một số thực phẩm như các sản phẩm bánh, ñồ uống, các sản phẩm từ sữa, thịt, xà lách Trong các sản phẩm thực phẩm ñồ uống, axit lactic ñược sử dụng

ñể ñiều chỉnh ñộ pH hoặc như một chất bảo quản [27], [30]

Trong công nghiệp nhẹ, axit lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm và thuộc da Trong công nghiệp rượu, axit lactic ñược dùng dưới dạng muối của canxi Đặc biệt là gần ñây, các nhà khoa học trên thế giới ñã nghiên cứu tổng hợp nhựa axit polylactic (PLA) – một loại nhựa sinh học từ axit lactic PLA là sự lựa chọn thích hợp thay cho nhựa có nguồn gốc từ dầu mỏ, vì nó vừa có thể phân huỷ ñược, vừa ít ñộc tính ñối với con người PLA ñược sử dụng làm nguyên liệu sản xuất bao bì phân bón, thực phẩm và các loại bát, ñĩa dùng một lần Đặc biệt trong y học và dược học, kết hợp với sự phát triển của công nghệ sinh học

và di truyền, axit lactic ñược nghiên cứu nhằm sản xuất phục vụ những nhu cầu thiết yếu về sức khỏe của con người Trong phẫu thuật chỉnh hình, các hợp chất cao phân tử tổng hợp từ axit lactic và những dẫn xuất của nó là những chất liệu cấy ghép sinh học thích hợp và hiệu quả cao Canxi lactat là loại dược phẩm nhằm bổ sung canxi dưới dạng dễ hấp thu cho cơ thể Sắt lactat ñược sử dụng ñể chữa bệnh thiếu máu…[16], [28], [37]

Axit lactic ñược sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như rỉ ñường,

củ cải ñường, nước mía, tinh bột Nhằm ñể hạ chi phí sản xuất axit lactic, ngày nay ñang có rất nhiều nghiên cứu thay thế nguồn cacbon và nitơ ñắt tiền trong môi trường lên men bằng các nguyên vật liệu rẻ tiền hơn Trong ñó, tập trung chủ yếu

vào việc tận dụng các phế phẩm nông nghiệp như bã mía, bã ngô, lõi ngô, cám mỳ, rơm rạ, rỉ ñường [16],[23],[28],[36]

Mít là loại trái cây nhiệt ñới có giá trị Quả mít ñã ñược sử dụng ñể ăn tươi từ lâu ñời Trong những năm gần ñây mít ñược sử dụng rất nhiều trong các ngành chế biến thực phẩm ñể tạo ra các sản phẩm khác nhau như: mứt mít, mít sấy, sản xuất bánh kẹo,…Hạt mít ở trong quả mít chiếm trung bình từ 10 – 15% trọng lượng trái, ngoài ra trong hạt mít chứa một hàm lượng khá lớn tinh bột và protein Mặc dù khối lượng nhiều nhưng nó chỉ ñược coi là phế phụ phẩm và thường bị loại bỏ trong quá trình sử dụng, sản xuất và gây khó khăn cho việc xử lý rác thải ô nhiễm môi trường Chúng ta ñã biết sử dụng hạt mít ñể chế biến một số món ăn nhỏ tuy nhiên sự hiểu biết về các thành phần dinh dưỡng còn hạn chế [35]

Quá trình nghiên cứu xác ñịnh thành phần dinh dưỡng của hạt mít ñã ñược khảo sát trong thời gian gần ñây, trong hạt mít có chứa tới 77,76% tinh bột và là một nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có [38], [43] Thủy phân tinh bột từ hạt mít ñể lên men sản xuất cồn và axit lactic là một hướng mới nhưng chưa ñược nghiên cứu nhiều

Việc tận dụng ñược nguồn phụ phẩm rẻ tiền, dễ kiếm, cũng như nhằm hạn chế lượng chất thải trong quá trình chế biến, chống ô nhiễm môi trường là một thiên hướng lớn ñối với các nhà nghiên cứu Trong công nghệ sản xuất axit lactic, việc sử dụng các nguồn nguyên liệu như ñường, rỉ ñường, nước mía ép, củ cải ñường, tinh bột…ñã ñược nghiên cứu nhiều nhưng hiện nay việc sử dụng tinh bột hạt mít ñể sản xuất axit lactic thì chưa thấy công bố

Ở nước ta, việc sử dụng axit lactic trong công nghệ thực phẩm và phi thực phẩm khá nhiều nhưng chủ yếu là thu mua từ nước ngoài với giá thành cao Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột hạt mít (một nguồn phế phẩm công nghiệp khổng lồ và rẻ tiền) ñể làm nguyên liệu trong công nghệ lên men lactic nhằm hạ giá thành cho sản phẩm axit lactic là thật sự có ý nghĩa không chỉ về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về bảo vệ môi trường sống của chúng ta

Chính vì những thực tế trên, chúng tôi mạnh dạn chọn ñề tài “Nghiên cứu quá

trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít” là một việc làm cấp thiết hiện nay.

2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

- Sử dụng hạt mít làm nguyên liệu chính ñể tiến hành thủy phân thu nhận dịch lên men

- Xác ñịnh các thông số công nghệ tốt nhất như nồng ñộ dịch ñường, nhiệt

ñộ lên men, thời gian lên men, pH lên men cho quá trình lên men axit lactic bằng cách sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa nhằm thu ñược hàm lượng axit lactic sau lên men là cao nhất

- Đề xuất ñược quy trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít

3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Sử dụng hạt mít làm nguồn nguyên liệu chính ñể tiến hành thủy phân thu nhận dịch ñường

- Sử dụng chế phẩm enzyme α-amylaza do hãng Novozymes – Đan Mạch sản xuất và chế phẩm γ-amylaza của Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất

- Sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus casei ñể lên men dịch sau thủy phân

4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Sử dụng hạt mít ñược thu mua tại các ñầu mối nguyên liệu của Công ty cổ phần Vinamit trên Daklak

- Lên men axit lactic từ dịch thủy phân từ tinh bột hạt mít

- Phương pháp lấy mẫu, chuẩn bị mẫu và bảo quản mẫu

6 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

- Phân tích và xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít, thành phần dịch lên men và xác ñịnh hàm lượng axit lactic bằng các phương pháp hóa học

- Thực hiện lên men axit lactic trên môi trường lỏng

- Tối ưu hóa các ñiều kiện lên men bằng phương pháp quy hoạch thực

nghiệm và phương pháp tối ưu nhằm thu ñược hàm lượng axit lactic là cao nhất

7 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Tận dụng lượng phế phụ phẩm trong quá trình chế biến các sản phẩm từ quả mít ñể tạo ra nguồn nguyên liệu chính ñể sản xuất axit lactic

- Giải quyết ñược vấn ñề ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng ñồng, nâng cao hiệu quả kinh tế trong sản xuất

- Tăng nguồn thu nhập cho người trồng mít

- Giảm lượng axit lactic ngoại nhập, chủ ñộng sản xuất, tiết kiệm ngoại tệ

8 CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN

Ngoài phần mở ñầu, kết luận và kiến nghị, tài liệu tham khảo, phụ lục, trong luận văn gồm có các chương sau:

+ Chương 1: Tổng quan

+ Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

+ Chương 3: Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về axit lactic

1.1.1 Lịch sử lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí ñường tạo thành axit lactic ñã ñược biết và sử dụng từ lâu ñời trong dân gian như: lên men chua rau quả, làm sữa chua…

Năm 1780 nhà bác học Thụy Điển Shale lần ñầu tiên ñã tách ñược axit lactic

từ sữa bò lên men chua Năm 1857 Pasteur ñã chứng minh ñược sự lên men chua sữa là do nhóm vi khuẩn lactic Năm 1878 Lister phân lập thành công vi khuẩn

lactic ñầu tiên và ñặt tên là Bacterium lactis, nay gọi là Streptococus lactic Về sau

các nhà khoa học liên tiếp phân lập ñược nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau Từ

ñó công nghiệp lên men sản xuất axit lactic ñược hình thành từ năm 1881 [1], [3]

Ngày nay, việc sản xuất và tiêu thụ axit lactic trên thế giới khá nhiều Vì axit lactic ñược lên men từ nhiều nguyên liệu khác nhau, chủ yếu là những nguyên liệu

có chứa tinh bột, ñường và nguyên liệu có khả năng chuyển hóa thành ñường Hơn nữa, ña số các loại nguyên liệu này thường là phế phẩm trong nhiều ngành công nghiệp như rỉ ñường, rơm rạ… [16], [25], [28], [36]

1.1.2 Cấu tạo của axit lactic

Công thức phân tử: C3H6O3, khối lượng phân tử là 90,08; tỉ trọng 1,21; nhiệt ñộ sôi 122oC; ñiểm tan 18oC [1] Axit lactic là hỗn hợp của 2 dạng ñồng phân D-axit lactic và L-axit lactic:

D-axit lactic L-axit lactic

Hình 1.1 Hai dạng ñồng phân của axit lactic [52]

Axit lactic là axit hữu cơ không màu, có mùi nhẹ, tan trong nước và trong cồn Trong cấu tạo phân tử của chúng có một cacbon bất ñối xứng nên chúng có hai ñồng phân quang học: D-axit lactic và L-axit lactic Hai ñồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một quay sang phải và một quay sang trái Do ñó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau

Loại L-axit lactic ở dạng tinh thể không màu Chúng có khả năng tan trong nước, tan trong cồn etylic, tan trong eter, không tan trong CHCl3 Nhiệt ñộ nóng chảy là 28oC, góc quay cực ở 15oC là 2,67o

Loại D-axit lactic là dạng tinh thể, tan trong nước, tan trong cồn Nhiệt ñộ nóng chảy là 28oC, nhiệt ñộ sôi 103oC, góc quay ở 15o là -2,26o

Nếu D-axit lactic và L-axit lactic có trong hỗn hợp theo tỉ lệ 50:50, người ta gọi là hỗn hợp raxemic Hỗn hợp này ñược kí hiệu là DL-axit lactic Trong quá trình lên men không có một hỗn hợp lý tưởng này mà chỉ có ñược hỗn hợp này khi tiến hành tổng hợp hữu cơ DL-axit lactic là dịch lỏng dạng sino, có khả năng tan trong nước, trong cồn, không tan trong CHCl3, nhiệt ñộ nóng chảy của chúng là 16,8oC, nhiệt ñộ sôi là 122oC [1], [3]

1.1.3 Cơ sở của qúa trình lên men axit lactic

Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong quá trình lên men lactic là những phản ứng chuyển hydro và ñiện tử Các enzyme xúc tác quá trình tách nguyên tử hydro khỏi cơ chất là các enzyme oxy hóa – khử (dehydrogenase, oxydase…) chủ yếu từ

vi sinh vật Như vậy, lên men là quá trình oxy hóa - khử sinh học ñể thu năng lượng

và các hợp chất trung gian Tùy thuộc vào các sản phẩm tạo thành mà quá trình lên men lactic ñược chia thành 2 loại: lên men lactic ñồng hình và lên men lactic dị

hình [8], [11]

Lên men lactic ñồng hình, thực tế chỉ xuất hiện axit lactic, còn trong lên men

dị hình các sản phẩm cuối cùng khá ña dạng: axit lactic, etanol, axit axetic và CO2 Chỉ có lên men lactic ñồng hình là có ý nghĩa về mặt công nghiệp

Các vi khuẩn lactic ñồng hình phân giải glucose theo con ñường EMP [3] Tùy thuộc vào tính chuyển hóa không gian của men xúc tác cho phản ứng tạo axit lactic, lactac dehdrogenase, và tùy vào sự tồn tại của men lactate-racemase mà có thể xuất hiện các dạng decacboxyl hóa và chuyển thành axit axetic, etanol và CO2

cũng như tạo thành axeton Mức ñộ tạo thành sản phẩm này phụ thuộc vào sự có mặt của oxi

Sự hình thành nên axit lactic trải qua hàng loạt giai ñoạn trung gian với sự tham gia của các enzyme tương ứng Các phản ứng chuyển hóa glucose theo con ñường EMP ñược chia làm 2 giai ñoạn:

- Giai ñoạn ñầu ñược gọi là giai ñoạn ñầu tư năng lượng, gồm 5 phản ứng ñầu tiên Ở giai ñoạn này, ñường ñược hoạt hóa bởi sự photphoril hóa Phản ứng này tạo ra 1 mol ñường 6 cacbon ñã ñược photphoril hóa, fructozo – 1,6 – diphotphat Đường này sau ñó ñược cắt thành 2 mol trizophotphat Hai mol trizophotphat ñược hình thành từ 1 mol glucose sau 2 lần photphoril hóa mức ñộ

cơ chất tạo thành 4 mol ATP

- Giai ñoạn thứ hai, là giai ñoạn phát sinh năng lượng Giai ñoạn này gồm những phản ứng còn lại Ở giai ñoạn này, các trizophotphat sẽ ñược hoạt hóa tiếp

ñể tạo thành hai hợp chất chứa các liên kết photphat cao năng diphotphoglycerat và photpho enolpiruvat Cả hai hợp chất này ñược coi như hợp chất siêu cao năng lượng Hai chất này sẽ chuyển photpho cao năng cho ADP ñể tạo thành ATP Quá trình này ñược gọi là photphoril hóa ở mức cơ chất

1,3-Lượng axit lactic tạo thành chiếm hơn 90% Chỉ một lượng nhỏ pyruvat bị khử cacbon ñể chuyển thành axit lactic, etanol, CO2 và axeton [1], [3]

Phương trình phản ứng tạo axit lactic: C6H12O6 = 2CH3CHOHCOOH +225cal Sự lên men lactic ñồng hình ñược biểu diễn theo sơ ñồ sau:

Glucose Gluco-6- photphat Fructo-1,6-diphotphat Glyceraldehyt-3-photphat Dihydroaxeton photphat NAD

NADH2

1,3-Diphotphoglyxerat 3-Photphoglyxerat 2-Photphoglyxerat Photphoenol pyruvat Pyruvat NADH2

NAD

Lactat

Hình 1.2 Lên men axit lactic ñồng hình nhờ các phản ứng theo con ñường EMP [3]

Các vi khuẩn lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con ñường EMP,

do bị ñột biến một hoặc nhiều hơn một enzyme của con ñường này, ñó là aldolase

và trizophotphatizomerase

Hình 1.3 Lên men axit lactic dị hình theo các phản ứng của con ñường PP [4]

Trong sự lên men lactic dị hình, nhiều sản phẩm khác nhau ñược tạo thành Các

tác nhân gây lên men lactic dị hình là Lactobacillus brevis, Leuconostoc mensenteroides

Sự lên men lactic dị hình xảy ra khi vi khuẩn gây lên men thiếu enzyme cơ bản của sự ñường phân là aldolase và trioso isomerase Khi ñó, glucose ñược chuyển hoá theo con ñường pentosophosphat từ glucoso 6 phosphat ñến xiluloso 5 phosphat Sau ñó,

dưới tác dụng của enzyme pentosophosphat cetolase mà xiluloso 5 phosphat bị phân ly

tạo thành glyceraldehyd 3 phosphat và acetyl phosphat Acetyl phosphat có thể ñược chuyển hoá tiếp tục thành ethanol hoặc axit axetic tuỳ theo hệ enzyme của từng vi sinh vật Còn glyceraldehyd 3 phosphat thì bị khử H2 ñể chuyển thành axit lactic giống như trường hợp lên men lactic ñồng hình

Sự lên men lactic dị hình ñược ứng dụng trong lên men thức ăn gia súc và muối chua rau quả Các vi khuẩn có khả năng gây lên men các ñường mono và disaccharid (sau khi ñã thuỷ phân thành monosaccharid nhờ enzyme tương ứng của vi khuẩn)

1.2 Tác nhân tổng hợp axit lactic

Vi sinh vật là tác nhân chủ yếu gây nên sự lên men Trong tế bào vi sinh vật

có một hệ enzyme rất phức tạp Tuy nhiên, không phải tất cả vi sinh vật ñều có khả năng tổng hợp một phức hệ enzyme như nhau Nhiều thí nghiệm nghiên cứu các enzyme riêng biệt có nguồn gốc từ vi sinh vật chứng tỏ rằng ngay cả cùng một loài, khác nhau về lượng enzyme tổng hợp ñược Vì vậy, việc tuyển chọn chủng có hệ enzyme ñặc trưng cho một sản xuất nào ñó luôn luôn liên quan tới việc khảo nghiệm hàng chục, hàng trăm loài vi sinh vật khác nhau Để có ñược chủng ứng dụng cho từng sản xuất riêng là vấn ñề khó khăn, phức tạp và lâu dài [1]

1.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic

Theo khóa phân loại Bergey, nhóm vi khuẩn lactic thuộc:

Giới: Bateria

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli

Bộ: Lactobacillates

Họ: Lactobacillaceae & Streptococcaceae…

Vi khuẩn lactac có chung các ñiểm như: bắt màu gram (+), không di ñộng, không tạo bào tử (dù vậy, ngày nay người ta tìm thấy một số vi khuẩn sinh axit

lactic có khả năng tạo bào tử), nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, kị khí tùy ý, tế bào

không chứa cytochobrom và enzyme catalase, lên men tổng hợp axit lactic [1], [5]

Bảng 1.1 Hình thái và kiểu lên men lactic của một số vi khuẩn lactic [1], [3]

lên men (tỉ lệ phân tử) axit lactic

Pediococcus cerevisiae ñồng hình lactat DL

Leuconostoc cremoris dị hình lactat : acetat : CO2 (1:1:1) D(-)

Leuconostoc mesenteroides dị hình lactat : acetat : CO2 (1:1:1) D(-)

Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều loài khác nhau về hình dạng, song về

mặt sinh lý và khả năng lên men chúng tương ñối ñồng nhất Môi trường sinh

trưởng của chúng ngoài gluxit, khoáng, muối amon, photphat còn cần vitamin

nhóm B, vitamin H, axit folic, axit nicotinic và axit amin khác [1], [11]

1.2.2 Một số vi khuẩn lactic ñiển hình

Lactobacillus casei:

- Thuộc loại trực khuẩn nhỏ, có kích thước rất ngắn

Chúng có thể tạo chuỗi, không di ñộng, gram (+)

- Có khả năng lên men một số loại ñường như

glucose, fructose, galactose, maltose, mannose, lactose

- Trong quá trình lên men chúng tạo ra L-axit lactic

Hình 1.4 Lactobacillus casei [52]

- Lactobacillus casei thuộc nhóm các vi khuẩn lên men lactic ñồng hình

Cấu trúc tế bào của lactobacillus casei thường thẳng, hình que và sắp xếp

theo dây chuyền Kích thước tế bào khoảng 0,7-1,1 x 2,0-4,0 micrometer Nó thuộc

dạng yếm khí tùy tiện Điều này có nghĩa nó là một sinh vật có khả năng phát triển

trong cả hai môi trường hiếu khí và kỵ khí, nhưng phát triển tốt hơn và nhanh hơn

trong sự hiện diện của oxygen

Điều ñặc biệt của vi khuẩn này là có khả năng hoạt ñộng trong một khoảng

nhiệt ñộ và pH tương ñối rộng, nhiệt ñộ hoạt ñộng nằm trong khoảng: 30-40oC, pH

tối thích vào khoảng 5.5

trợ sức khỏe con người Nó có thể cải thiện và tăng cường tiêu hóa Một số chủng

vi khuẩn giúp kiểm soát tiêu chảy, có tác dụng chống viêm ruột, giảm dung nạp

ñường lactose, giảm táo bón, Ngoài ra, nó còn là vi sinh vật sử dụng ñể sản xuất

axit lactic, một sản phẩm ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học và trong

công nghiệp, nhất là trong sản xuất sữa

Lactobacillus bulgaricus:

- Thuộc loại trực khuẩn có kích thước rất dài, liên kết với nhau tạo thành

chuỗi, gram (+)

- Chúng không có khả năng di ñộng

- Chúng có khả năng lên men ñược các loại ñường

như glucose, lactose, galactose, fructose

- Chúng không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate

Hình 1.5 L.bulgaricus [52]

Lactobaciilus acidophilus:

- Thuộc loại trực khuẩn gram (+) di ñộng

- Kích thước: rộng 0,6µ – 0,9µ

- Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ Đôi

khi cũng tạo thành chuỗi ngắn

- Có khả năng lên men một số loại ñường như

glucose, fructose, galactose, maltose, mannose, lactose,

saccharose ñể tạo thành axit lactic Hình 1.6 L.acidophilus [52]

- Chúng không có khả năng lên men một số loại ñường như xylose,

arabinose, rhamnose, glycerol, mantitol, sorbitol, dulcitol, inositol

- Nhiệt ñộ phát triển tối ưu là 45 – 50oC

Streptococcus lactic:

- Có dạng hình cầu, dạng chuỗi

- Nhiệt ñộ thích hợp phát triển: 30oC

- Chúng lên men ñược các loại ñường như:

glucose, maltose, rhamnose, lactose Hình 1.7 Streptococcus lactic[52]

1.3 Ứng dụng của axit lactic

1.3.1 Trong công nghệ thực phẩm

Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên, do ñó chúng rất gần gũi với

những hoạt ñộng sống của con người, trong ñó phần lớn là trong ngành chế biến

thực phẩm

Ứng dụng vi khuẩn lactic ñể len men sữa chua: nhiều loại vi khuẩn lactic ñược ñưa vào quá trình sản xuất sữa chua Sự lên men lactic trong quá trình sản xuất vừa tăng giá trị dinh dưỡng vừa có tính chất chữa bệnh ñường ruột giúp ăn ngon miệng, dễ tiêu hóa vừa có tác dụng bảo quản lâu hơn sản phẩm sữa khỏi bị hư hỏng

Ứng dụng ñể sản xuất dưa chua: muối chua rau quả là một quá trình hoạt ñộng của vi khuẩn lactic và vi khuẩn axetic Trong rau quả, vi khuẩn sẽ phát triển tạo axit lactic và axit axetic cùng với một số chất hữu cơ khác Các axit hữu cơ này làm giảm pH của dịch, chống lại sự phát triển của các vi sinh vật gây thối làm hư thối rau quả Bên cạnh ñó, nhờ có lượng axit hữu cơ tạo thành sẽ làm tăng hương vị của khối ủ chua rau quả, ñồng thời giữ ñược màu tự nhiên và bảo ñảm ñược chất lượng của sản phẩm ủ chua Vì vậy, cũng như sản xuất sữa chua, muối chua rau quả

là quá trình vừa mang ý nghĩa chế biến vừa mang ý nghĩa bảo quản

Ứng dụng trong sản xuất tương: sản xuất tương theo phương pháp của người miền Bắc (Việt Nam) có giai ñoạn ngả nước ñậu sau khi rang Quá trình ngả nước ñậu này có nhiều phản ứng sinh hóa khác nhau xảy ra, trong ñó có quá trình lên men lactic tạo pH thích hợp cho sản phẩm và làm tăng hương vị cho sản phẩm

Ứng dụng sản xuất ñậu phụ: giai ñoạn kết tủa protein của ñậu trong quá trình sản xuất ñậu phụ theo phương pháp truyền thống thường dùng nước dưa chua (có vi khuẩn lactic) ñể tạo kết tủa nhờ pH giảm ñến ñiểm ñẳng ñiện của protein ñậu nành

Ứng dụng ñể sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa: các sản phẩm sữa có sử dụng lên men lactic thông thường là: sữa chua uống, sữa chua ăn, phomat, bơ…Các qúa trình biến ñổi và chuyển hóa trong sản xuất ñều làm cho sản phẩm thêm giàu dinh dưỡng và tạo cho sản phẩm có hương vị ñặc trưng

Ứng dụng ñể ủ thức ăn cho gia súc: về nguyên tắc trên các loại cỏ, lá cây có chứa các chất dinh dưỡng phù hợp với vi khuẩn lactic nên khi tiến hành ủ các loại

cỏ, lá cây thì khối ủ này trở nên chua và giữ ñược màu sắc hương vị của cây, lá Quá trình ủ chua này cũng góp phần bảo quản thức ăn cho gia súc [5], [8], [15]

1.3.2 Trong y học

Ứng dụng vi khuẩn lactic ñể chữa bệnh

ñường ruột: nước Pháp ñã sản xuất và ñưa ra thị

trường hàng chục năm nay một sản phẩm mang tên

biolactyl Sản phẩm này chuyên trị tiêu chảy bằng

một nhóm nhiều vi khuẩn lactic

Hình 1.8 Thuốc Biolactyl [50]

Ứng dụng axit lactic theo phương pháp vi lượng ñồng cân (homeopathy):

trong quá trình vận ñộng của cơ thể, mô cơ hoạt ñộng mạnh và trong một thời gian

dài sẽ gây ra hiện tượng mệt mỏi Hiện tượng mệt mỏi này do các phản ứng sinh

hóa xảy ra trong mô cơ, tạo axit lactic Các thầy thuốc ñã tạo ra một vị thuốc bao

gồm axit lactic kết hợp với cây kim sa có khả năng giúp cơ thể không còn mệt mỏi

và có khả năng làm việc trong thời gian dài

Ứng dụng axit lactic trong phẩu thuật chỉnh hình, người ta thường sử dụng

loại vật liệu có tên là purasorb

- Purasorb là một hợp chất cao phân tử ñược sản xuất từ axit lactic

- Purasorb ñược sử dụng như những ñinh gim, gắn phần xương lại với nhau;

khi xương ñịnh hình, purasorb sẽ tự tiêu hủy

Ứng dụng axit lactic trong nha khoa: Trong nha khoa có hai chế phẩm ñược

sử dụng nhiều ñó là puramex và puracal Puramex gồm các thành phần như

amulinium lactac, Fe-lactac, Mg-lactac, Mn-lactac, Zn-lactac; puracal chỉ có canxi

lactac Các chế phẩm này thường làm răng khỏe hơn

Ứng dụng trong sản xuất vật liệu sinh học (biomaterials): các nhà khoa học

ñang nghiên cứu tạo ra những vật liệu sinh học dùng trong y học bằng các

copolymer của axit lactic Các copolymer này có tính năng rất giống những bộ

khung xương ñộng vật Hướng này ñang ñược nghiên cứu và trong tương lai nó sẽ

ñược ứng dụng nhiều

Ứng dụng trong sản xuất các loại sữa bột giàu canxi: Bổ sung lactac canxi vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh ngọt, bánh nướng ñể tăng lượng canxi

cho cơ thể [8], [15]

1.3.3 Ứng dụng trong công nghệ vật liệu

Chất dẻo trong tương lai: người ta ñã nghiên cứu những chất dẻo mới thay thế cho chất dẻo cũ khó bị phân hủy Chất dẻo mới này là một loại polymer có tên gọi là axit polylactic (PLA) Đó là sản phẩm ñược tạo ra nhiều loại vật liệu ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp dệt, công nghiệp thuộc da, công nghiệp bao bì…Những vật liệu này sau khi vứt bỏ chúng sẽ bị phân hủy bởi vi sinh vật, không gây ô nhiễm môi trường [13], [16], [17]

1.3.4 Ứng dụng trong mỹ phẩm

Các loại lactate kim loại ñược sử dụng trong thành phần của một số mỹ phẩm chăm sóc da như punosal của hãng mỹ phẩm Punac Mỹ phẩm này có tác dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm và sang da [8], [18]

1.4 Tình hình nghiên cứu axit lactic trên thế giới

Axit lactic ñược các nhà nghiên cứu nước ngoài quan tâm khá nhiều, nhưng chủ yếu tập trung ứng dụng của axit này trong công nghiệp thực phẩm, trong nông nghiệp và lâm nghiệp, trong y tế và y học

- Năm 1780 nhà bác học Thụy Điển Scheele lần ñầu tiên ñã tách ñược axit lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1857 Pasteur ñã chứng minh ñược lên men sữa là

do nhóm vi khuẩn lactic [1] Năm 1878 , Joseph Lister (1827 – 1912) ñã phân lập thành

công vi khuẩn lactic ñặt tên là Bacterium lactic nay gọi là Streptococcus lactic [13]

Sau ñó có nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới ñã nghiên cứu và khảo sát lên men sản xuất axit lactic từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau Vi khuẩn lên men chủ yếu

từ nguồn cacbon chính là dịch ñường, từ một số nguyên liệu có khả năng chuyển biến thành ñường Năm 2001, Hassan K Sreenath, AnaB.Moldes, RichardG Koegel

& Richard J Straub, Sản xuất axit lactic từ chất thải nông nghiệp [36] Năm

2003, Takashi Ueno, Yasuhiro Ozawa, Masaki Ishikawa, Kotoyoshi Nakanishi & Toshinori Kimura, Sản xuất axit lactic từ chất thải thực phẩm như bã dứa (từ dứa

ñóng hộp) và bã nho (từ sản xuất vang nho) [39] Năm 2006, Walaiporn Timbuntam Klanarong Sriroth, Yutaka Tokiwa, nghiên cứu sản xuất axit lactic

từ nước mía bởi lactobacillus sp Năm 2007, Buenaventurada P Calabia

Yutaka Tokiwa, Sản xuất D- axit lactic từ rỉ ñường, nước mía và nước ép

củ cải ñường của Lactobacillus delbrueckii [16]

- Năm 2007, Sarote Sirisansaneeyakul Tiyaporn Luangpipat Wirat Vanichsriratana Thongchai Srinophakun Henry Ho-Hsien Chen Yusuf Chisti,

Tối ưu hóa sản xuất axit lactic bằng cách cố ñịnh lacbacillus lactic IO-1 [33]

- Năm 2007, Se´ bastien Givry Vincent Prevot Francis Duchiron, sản

xuất axit lactic từ thủy phân hemicenllulo bởi các tế bào của Lactobacillus bifermentans cố ñịnh trong Alginat- Ca bằng cách sử dụng phương pháp phản

ứng bề mặt [22]

Hầu hết các ñề tài nghiên cứu ñều tập trung sản xuất axit lactic từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau Nhưng chưa có ñề tài nào dùng tinh bột từ hạt mít ñể lên men lactic

1.5 Tình hình nghiên cứu axit lactic trong nước

Tại Việt Nam, việc sử dụng axit lactic vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau và nguồn axit lactic chủ yếu thu nhập từ nước ngoài với giá thành khá cao Sự quan tâm của các nhà khoa học trong nước về lên men sản xuất axit lactic chủ yếu

từ nguồn nguyên liệu chính là rỉ ñường Tháng 1 năm 2010, PGS.TS Lê Thanh Mai, nghiệm thu ñề tài cấp bộ “sản xuất axit lactic từ rỉ ñường”, trường Đại Học

Bách Khoa Hà Nội [49] Tuy nhiên, việc sử dụng hạt mít làm nguyên liệu cho quá

trình lên men lactic thì chưa ñược nghiên cứu Tuy vậy, hạt mít ñược quan tâm và nghiên cứu ở một số Trường Đại Học tuy không nhiều Năm 2009, tại trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Minh Hiền, Nguyễn Thúy

Hương, Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột hạt mít bằng enzyme Termamyl 120L và AMG 300L ñể lên men rượu chưng cất [42]

Như vậy, việc sử dụng axit lactic hiện nay ở nước ta rất nhiều, trong khi ñó quá trình lên men sản xuất axit lactic thì còn hạn chế Hơn nữa, các nguồn nguyên

liệu khác nhau ñể có thể lên men axit lactic thì khá phong phú như rỉ ñường, ñường

củ cải, nước mía, các phế phẩm công nghiệp khác…Nhưng nghiên cứu lên men thu nhận axit lactic từ tinh bột hạt mít thì chưa ñược các nhà khoa học quan tâm, hạt mít lại là một nguồn phế phẩm trong công nghệ sản xuất các sản phẩm thực phẩm

từ quả mít, chính vì vậy mà chúng tôi ñã mạnh dạn ñề cập ñến việc nghiên cứu lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít

1.6 Các yếu tố ảnh hưởng ñến tổng hợp axit lactic từ vi sinh vật

1.6.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng

1.6.1.1 Nguồn cacbon

Nguồn cacbon có ý nghĩa hàng ñầu trong sự sống sinh vật, thức ăn chủ yếu cùa vi sinh vật hyñrocacbon Trao ñổi, chuyển hóa hyñrocacbon ñáp ứng ba nhu cầu của tế bào: sản sinh ra năng lượng, tạo ra những tiền chất, tạo ra các quá trình oxy hóa-khử ñể biến ñổi những tiền chất thành các sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm cuối cùng dùng ñể xây dựng tế bào, ñồng thời tích tụ trong môi trường một hoặc một vài sản phẩm sinh tổng hợp thừa [1], [3]

1.6.1.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nitơ là nguyên tố quan trọng trong tế bào Vi sinh vật cũng như các cơ thể sống khác ñều cần nitơ trong quá trình sống ñể xây dựng tế bào Chúng góp phần tạo nên nhóm amin (_NH2) và nhóm imin (_NH_) trong các phân tử axit amin cấu tạo nên protein, các vòng purine và pyrimidine, trong nhiều vitamin và trong một số hợp chất khác có trong nguyên sinh chất của tế bào Việc chọn nguồn nitơ là rất cần thiết ñể ñảm bảo ñược hiệu suất sinh tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế [1], [3]

1.6.1.3 Ảnh hưởng của photphat vô cơ

Tất cả các hoạt ñộng của tế bào ñều cần năng lượng, nguồn năng lượng ñược tích trữ chủ yếu ở các liên kết cao năng với gốc phosphat Vì thế các gốc này có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học ở tế bào [1], [3]

1.6.1.4 Ảnh hưởng của nguồn muối khoáng

Môi trường tổng hợp ñòi hỏi phải bổ sung các nguyên tố khoáng cần thiết Nhu cầu của các nhóm vi sinh vật khác nhau thì khác nhau về nguyên tố khoáng hoặc nguyên tố vi lượng Nguyên tố vi lượng ñóng vai trò rất quan trọng vì chúng

có chức năng giúp cho một số enzyme hoạt ñộng trong quá trình trao ñổi chất của tế bào

Nếu trong môi trường thiếu một số nguyên tố vi lượng vi sinh vật sẽ không phát triển bình thường, dễ dẫn ñến chết tế bào hoặc có sự phát triển bất thường [1], [3], [4]

1.6.2 Ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy

Sinh trưởng và trao ñổi chất của chúng nghiên cứu liên quan chặt chẽ ñến hàng loạt các yếu tố khác nhau, tác ñộng qua lại với nhau và với môi trường bên ngoài Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài thường thể hiện dưới dạng thích hợp hay không thích hợp cho hoạt ñộng của tế bào và các enzyme trong chuỗi trao ñổi chất [1], [3]

1.6.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ

Hoạt ñộng trao ñổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết quả của các phản ứng hóa học Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt ñộ nên yếu tố nhiệt

ñộ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc ñến các quá trình sống của tế bào Tế bào thu ñược nhiệt chủ yếu từ môi trường bên ngoài, một phần cũng do cơ thể thải ra, do kết quả của hoạt ñộng trao ñổi chất Vấn ñề ñáng lưu ý là cùng một loài vi sinh vật, tùy theo quá trình sinh lý khác nhau mà ñòi hỏi những nhiệt tối thích khác nhau

Hầu hết tế bào sinh dưỡng bị ức chế ở nhiệt ñộ cao do protein bị biến tính, một hoặc hàng loạt enzyme bị mất bất hoạt, ngược lại ở nhiệt ñộ thấp có thể làm bất hoạt quá trình vận chuyển các chất qua màng tế bào do ảnh hưởng ñến cấu hình của enzyme [1], [3]

1.6.2.2 Ảnh hưởng của pH

Vi sinh vật sống và phát triển trong các môi trường lỏng chịu ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp của các ion H+ và OH- do các phân tử nước phân ly ra Trong

các dung dịch thường xuyên có ion H+ tự do Nồng ñộ H+ trong môi trường dinh

dưỡng có ảnh hưởng lớn ñến sự trao ñổi chất và phát triển của vi sinh vật

pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn ñến sự phát triển và khả năng sinh

tổng hợp của vi sinh vật Sự ảnh hưởng của pH ñến vi sinh vật một cách không

giống nhau Có những pH mà ở ñó vi sinh vật vẫn phát triển bình thường, nhưng

các sản phẩm tạo thành ít hoặc hoàn toàn không tạo thành [1], [3], [4]

1.7 Hạt mít

1.7.1 Đặc ñiểm và thành phần của hạt mít

Cây mít có tên khoa học là: Artocarpus heterophyllus Lam

Họ khoa học: Moraceae

Đây là một loại cây ăn quả ñược trồng ở vùng

nhiệt ñới hoặc cận nhiệt ñới

Cây mít không thể phát triển ở vùng có

cho từ 200 – 300 quả, khối lượng mỗi quả trung

bình khoảng 2–5 kg (các giá trị trên khác nhau

tùy theo giống loài và từng khu vực)

Hạt mít ñược coi là phế phụ phẩm trong

quả mít, hạt mít chiếm khoảng 10 – 15% tổng

khối lượng của trái mít. Hình 1.10 Hạt mít [45]

Hạt mít ñược chứa bên trong múi mít và ñược bao bọc trong một lớp vỏ mỏng

màu trắng Hạt mít tươi thường có màu nâu sáng cho ñến nâu, có hình bầu dục hoặc

hình tròn

Chiều dài hạt khoảng 2 – 3 cm (0.8 – 1.2 inch), ñường kính khoảng 1.0 –

1.5cm (0.4 – 0.6 inch) Trung bình trong một quả mít có 100 – 500 hạt Hạt mít có

thể bảo quản trong thời gian một tháng nếu ñược bảo quản trong ñiều kiện lạnh và

Amylose của tinh bột

Protein của tinh bột

pH

Khả năng hấp thụ nước

Khả năng hấp thụ dầu

7.70 ± 0.20 11.02 ± 0.46 1.01 ± 0.12 2.36 ± 0.04 3.97 ± 0.04 81.64

8.57 ± 0.25 11.17 ± 0.21 0.99 ± 0.08 1.67 ± 0.11 3.92 ± 0.03 82.25 77.76 ± 0.96 32.05 ± 1.20 1.84 5.68

205 92.6

5.1 17.2 2.2 3.06 3.6

1.7.2 Tinh bột hạt mít

Từ bảng 1.2, tôi thấy hàm lượng tinh bột trong hạt mít ñạt tới 77.76 ±0.96%

so với tổng số hàm lượng chất khô có trong hạt Dưới kính hiển vi ñiện tử quét

(SEM), và kính hiển vi quang dưới ánh sáng bình thường cho thấy các hạt tinh bột

có hình tròn và hình vuông là chiếm ưu thế (hình 1.11) [19]

Hình 1.11 Hình chụp cấu hình phân tử tinh bột hạt mít [19]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Hạt mít

Hạt mít ñược thu mua tại một số cơ sở bóc múi mít cung cấp cho Công ty Vianamit - tại thị xã Buôn Hồ, huyện Krôngbuk, tỉnh Daklak

2.1.2 Enzyme thủy phân

Tinh bột hạt mít ñược thủy phân bởi 2 loại chế phẩm enzyme: α-amylaza và γ-amylaza Chế phẩm enzyme α-amylaza do hãng Novozymes - Đan Mạch sản xuất Còn chế phẩm γ-amylaza do Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất Chế phẩm α-amylaza có dạng lỏng màu nâu ñậm, không có mùi, nhiệt ñộ tối thích từ 90

÷105oC, pH tối thích từ 4,5÷5 Chế phẩm enzyme γ-amylaza cũng có dạng lỏng, màu

nâu ñen, có mùi hắt khó chịu, pHopt=3,5 – 5, topt= 50 – 60oC

2.1.3 Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactobacillus casei ñược lấy từ công ty Nanogen Biopharma, thành

phố Hồ Chí Minh Chủng ở dạng ñông khô nên cần phải hoạt hoá lại trước khi sử dụng Chúng tôi bảo quản chủng vi khuẩn này ở ñiều kiện 0-5oC trong suốt thời gian nghiên cứu

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất trong quá trình nghiên cứu

- Một số thiết bị thông dụng khác như: Tủ cấy Laminar; Nồi hấp thanh trùng Hirayama HVE-50; Cân ñiện tử Excell; Tủ ấm Memmert; Máy lắc Edmund Buhler Gmbtt… (phụ lục 2.1)

- Dụng cụ, vật liệu dùng trong thực nghiệm (phụ lục 2.2)

Hóa chất: Sử dụng các hóa chất trong phòng thí nghiệm Trường Đại học

Bách Khoa Đà Nẵng và một số hóa chất liên quan mua tại Đà Nẵng và TP Hồ Chí Minh (phụ luc 1.1 và 1.2)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp hóa học

2.2.1.1 Xác ñịnh hàm lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân nhờ axit [6]

Nguyên tắc: Thủy phân tinh bột thành ñường bởi dung dịch HCl 2% ở ñiều

kiện ñun sôi trong bình cách thủy với thời gian là 2 giờ Dịch ñã thủy phân ñược làm nguội và trung hòa bằng NaOH với chỉ thị metyl da cam Hàm lượng ñường trong dung dịch ñược xác ñịnh theo các phương pháp Graxianop (ñược trình bày ở

mục 2.2.1.2 bên dưới) Từ hàm lượng ñường ñịnh lượng ñược, áp dụng công thức

ñể xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít, xem phụ lục 3.1 và 3.2

2.2.1.2 Xác ñịnh hàm lượng ñường khử bằng phương pháp Graxianop [6]

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng

2K3Fe(CN)6 + 2KOH 2K4Fe(CN)6 +H2O + O

Tiếp theo oxi hóa ñường ñể tạo thành axit ñường

CH2CH(CHOH)4 + O COOH(CHOH)4COOH

- Dung dịch para oxydiphenyl 0,75%

+ Para oxydiphenyl 0,75gam + NaOH 2% vừa ñủ 100ml Cách tiến hành và tính toán theo phụ lục 3.5

2.2.1.4 Xác ñịnh hàm lượng ñường khử bằng phương pháp so màu sử dụng acid dinitro salicylic (DNS) [6]

Mục ñích: Nhằm kiểm tra và ñiều chỉnh nồng ñộ dịch ñường sau thủy phân

ñể thuận lợi cho quá trình lên men

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng tạo màu giữa ñường khử với thuốc thử axit

dinitrosalicylic DNS Cường ñộ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng ñộ dịch ñường khử trong phạm vi nhất ñịnh Dựa trên ñồ thị ñường chuẩn ñối với glucoza tinh khiết tính ñược hàm lượng ñường khử trong mẫu phân tích

Phương pháp tiến hành ñược thể hiện ở phụ lục 3.6

2.2.1.5 Xác ñịnh hoạt lực của α- amilaza theo Rukhliadeva [6]

Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có

trong dịch chế phẩm nghiên cứu tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau Đo cường ñộ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iot bằng máy so màu quang ñiện sẽ tính ñược hoạt ñộ enzyme

Đơn vị hoạt ñộ enzyme α- amilaza là lượng enzyme chuyển hóa ñược một

gam tinh bột tan thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 30oC trong thời gian một giờ (pH cho amilaza của malt là 4.8 – 4.9, của nấm mốc là 4.7, của vi khuẩn là 6.0…)

Cách tiến hành xem phụ lục 3.3

2.2.1.6 Xác ñịnh hoạt lực của γ-amilaza theo phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina [6]

Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme

γ-amilaza có trong chế phẩm nghiên cứu Xác ñịnh lượng glucoza tạo thành sẽ tính

ñược hoạt ñộ enzyme

Đơn vị hoạt ñộ γ-amilaza là lượng enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột

tan pH= 4,7 ở nhiệt ñộ 30oC trong thời gian một giờ giải phóng ñược 1mg glucoza

là xay bột ñáp ứng cho quá trình nghiên cứu sau này

Hạt mít Làm sạch và làm ráo Tách lớp vỏ cứng bên ngoài

Tách vỏ nâu Rửa sạch và làm nhỏ Sấy khô

Xay bột

2.2.2.2 Phương pháp thủy phân tinh bột hạt mít bằng chế phẩm enzyme α-amylaza

và γ-amylaza

Quá trình thủy phân tinh bột hạt mít ñược thực hiện nhờ hai loại chế phẩm

enzyme α-amylaza và γ – amylaza [42] Bột hạt mít trước lúc dịch hóa ñược hồ hóa

ở pH = 5- 5.5, nhiệt ñộ 95oC trong bể ổn nhiệt Trong quá trình dịch hóa bằng chế

phẩm enzyme α-amylaza, tinh bột hạt mít ñược chuyển hóa thành maltoza, một ít ñường glucoza và chủ yếu là các dextrin Sau ñó chúng tôi tiến hành ñường hóa bởi chế phẩm enzyme γ – amylaza ñể cuối cùng thu nhận sản phẩm là dịch ñường ñáp

ứng cho quá trình lên men lactic

Trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và thừa kế kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh Hiền, Nguyễn Thúy Hương (Trường ĐH Bách khoa TP.HCM) [42], tác giả ñã

sử dụng chế phẩm enzyme α-amylaza của hãng Novozymes - Đan Mạch sản xuất với tỷ lệ 0,1% ñể dịch hóa tinh bột và 0,12% chế phẩm enzyme γ – amylaza cũng

do hãng này sản xuất cho quá trình ñường hóa Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chế phẩm γ-amylaza do Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất nên tỷ

lệ chế phẩm enzyme sử dụng cần phải ñược nghiên cứu thêm Chính vì thế mà chúng tôi ñã ñề xuất quy trình thủy phân như sau:

Bột hạt mít ñem hòa nước

Ở ñây chúng tôi sẽ cố ñịnh các ñiều kiện dịch hóa bởi chế phẩm α-amylaza

và chỉ khảo sát hàm lượng chế phẩm γ – amylaza bổ sung trong quá trình ñường

hóa sao cho hiệu suất thủy phân là cao nhất

2.2.2.3 Môi trường lên men lactic [34]

Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men axit lactic (Fer) [34]

Cao nấm men 8,0 Merck, Đức

K2HPO4 0,5 Merck, Đức

KH2PO4 0,5 Merck, Đức

CH3COONa.3H2O 1,0 Merck, Đức MgSO4.7H2O 0,6 Merck, Đức MnSO4.4H2O 0,03 Merck, Đức Dịch ñường vừa ñủ 1000ml

Môi trường lên men lactic trong nghiên cứu này là dịch ñường của quá trình thủy phân từ tinh bột hạt mít với nồng ñộ khảo sát phối trộn với môi trường riêng lẻ thích hợp với nhau

Sau khi phối trộn tất cả các thành phần, tiến hành hiệu chỉnh pH môi trường bằng H2SO4 20% và NaOH 5N [34] ñể ñưa pH về giá trị cần cho quá trình lên men Hấp tiệt trùng dịch lên men ở nhiệt ñộ 121oC trong thời gian 20 phút

2.2.2.4 Phương pháp lên men lactic

- Giống vi khuẩn sau khi nuôi cấy ñạt yêu cầu, kiểm tra và khảo sát theo các ñiều kiện thích hợp

- Dịch ñường sau khi xác ñịnh nồng ñộ và bổ sung một số thành phần khác Tiến hành hấp thanh trùng ở nhiệt ñộ 121oC trong 20 phút

- Chuyển giống từ môi trường nuôi cấy sang môi trường lên men theo tỉ lệ xác ñịnh trong quá trình khảo sát

2.2.3 Phương pháp vi sinh vật

2.2.3.1 Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn

Môi trường ñể nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus casei là môi trường MRS agar

của Merck, Đức Đây là môi trường có pha chế sẵn và có thành phần như sau: [14], [29]

Bảng 2.2 Thành phần môi trường MRS Agar

Peptone 10,0 Cao thịt 8,0 Cao nấm men 4,0 Glucose 20,0

K2HPO4 2,0

CH3COONa.3H2O 5,0 Triamonium citrate 2,0 MgSO4.7H2O 0,2 MnSO4.4H2O 0,05

Sorbitan mono-oleate (C24H44O6) 1ml

pH = 6,2 ±0,2

Chủng vi khuẩn lactobacillus casei ở dạng ñông khô, hoạt hóa ở môi trường

trên theo các bước sau:

- Dùng que cấy lấy một lượng vừa phải chủng ñông khô cho vào lọ ñựng 10ml nước muối sinh lý ñã qua hấp tiệt trùng, khuấy tan ñều

- Chuẩn bị môi trường MRS ñã hấp tiệt trùng, ñổ ñều trên 5 ñĩa petri, làm nguội

- Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch khuẩn trên cho vào ñĩa petri, sau ñó dùng que trang trang ñều trên bề mặt thạch

- Nuôi cấy trong thời gian 48h, ổn ñịnh ở nhiệt ñộ 30oC trong tủ bảo ôn

2.2.3.2 Phương pháp xác ñịnh gián tiếp số lượng tế bào bằng cách ñếm các khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch [5]

Nguyên tắc: Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho ñến khi hình

thành một khuẩn lạc có thể trông thấy ñược Đây là cơ sở của việc ñịnh lượng tế bào trên ñĩa thạch, bởi số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất ñịnh chỉ số lượng tế bào sống có trong thể tích giống ñó Thông thường, tất cả các tế bào ở phase tăng trưởng hay ở phase ổn ñịnh ñều có khả năng hình thành khuẩn lạc

Vì vậy, số lượng khuẩn lạc ñếm ñược gần như tương ñương với số lượng tế bào sống

Để ñịnh lượng chính xác, cần phải thực hiện sao cho mỗi một khuẩn lạc chỉ ñược hình thành từ một tế bào Do dịch tế bào sử dụng trong phòng thí nghiệm thường có nồng ñộ cao, thường nhiều hơn 106 tế bào/ml, nên cần thiết phải ñược pha loãng trước khi cấy Phương pháp chuẩn là thực hiện các bước pha loãng ñể giảm nồng ñộ tế bào từ 10 ñến 100 lần cho ñến khi ñạt vài nghìn tế bào/ml

Cách tiến hành ñược thể hiện ở phụ lục 3.8

2.2.3.3 Phương pháp chuyển giống sang môi trường lên men

Giống phải ñược hoạt hóa trước khi lên men ñể ổn ñịnh trạng thái sinh lý, tiến hành nhân giống theo các cấp, thể tích cấp sau lớn hơn cấp trước khoảng 10 lần [1], [10] Trong lên men công nghiệp việc rút ngắn thời gian lên men là cần thiết,

do ñó môi trường nhân giống ñược thiết kế có thành phần giống môi trường lên men nhằm tạo ñiều kiện thích nghi cho chủng nghiên cứu và giảm thời gian lên men