Nghiên cứu quá trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG HỒ THỊ HẢO NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ TINH BỘT HẠT MÍT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Đà Nẵng – Năm 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG HỒ THỊ HẢO NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ TINH BỘT HẠT MÍT Chun ngành: CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Mã số: 60 54 02 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH Đà Nẵng - Năm 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG HỒ THỊ HẢO NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ TINH BỘT HẠT MÍT Chun ngành: Cơng nghệ thực phẩm ñồ uống Mã số: 60 54 02 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Đà Nẵng - Năm 2011 Cơng trình hồn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH Phản biện 1: PSG.TS TRẦN THỊ XÔ Phản biện 2: PGS.TS PHẠM NGỌC ANH Luận văn ñược bảo vệ trước hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Kỹ thuật họp Đại Học Đà Nẵng vào ngày 23 tháng năm 2011 * Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Hình thái kiểu lên men lactic số vi khuẩn lactic 11 1.2 Thành phần hóa học hạt mít 21 2.1 Thành phần môi trường lên men axit lactic 28 2.2 Thành phần môi trường MRS Agar 29 3.1 Ảnh hưởng nồng độ xút đến q trình tách lớp vỏ nâu hạt mít 31 3.2 Hàm lượng tinh bột hạt mít 33 3.3 Kết đo OD dịch kiểm chứng mẫu thí nghiệm 34 3.4 Hàm lượng ñường khử tạo thành sau trình thủy phân 38 3.5 Hiệu suất lên men theo nồng ñộ dịch ñường 48 3.6 Các điều kiện thí nghiệm TYT 22 51 3.7 Kết thí nghiệm theo thực nghiệm TYT 22 52 3.8 Bảng giá trị tính phương sai dư 55 3.9 Kết tính bước chuyển động δ j yếu tố 56 3.10 Kết thực nghiệm tối ưu hóa theo đường lên dốc 57 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu Tên hình hình Trang 1.1 Hai dạng ñồng phân axit lactic 1.2 Lên men axit lactic đồng hình nhờ phản ứng theo đường EMP 1.3 Lên men axit lactic dị hình theo phản ứng ñường PP 1.4 Lactobacillus casei 12 1.5 Lactobacillus bulgaricus 13 1.6 Lactobacillus acidophilus 13 1.7 Streptococcus lactic 13 1.8 Thuốc Biolactyl 15 1.9 Cây mít 20 1.10 Hạt mít 20 1.11 Hình chụp phân tử tinh bột hạt mít 22 2.1 Máy so màu hiệu JENWAY 6305 23 2.2 Tủ sấy nguyên liệu 23 3.1 Bột hạt mít thu nhận 33 3.2 Khuẩn lạc L.casei sau hoạt hóa 36 3.3 Đường chuẩn glucoza 37 3.4 Dịch ñường sau thủy phân 39 3.5 Dịch ñường ñã khảo sát nồng ñộ trước lúc lên men 40 3.6 Các khuẩn lạc Lactobacillus casei mức pha loãng 10-3 42 3.7 Đường cong biểu diễn mật ñộ tế bào mức pha loãng 42 khác 3.8 Dịch ñường ñã chuẩn bị trước lúc lên men 43 3.9 Quá trình lên men lactic 44 3.10 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hàm lượng axit lactic tạo thành 45 3.11 Ảnh hưởng tỷ lệ giống ñến lượng axit lactic tạo thành 46 3.12 Ảnh hưởng nồng ñộ dịch ñường ñến hàm lượng axit lactic tạo 47 thành 3.13 Ảnh hưởng thời gian lên men ñến hàm lượng axit lactic tạo 49 thành 3.14 Các mẫu dịch sau kết thúc trình lên men 50 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT EMP : Embden-Mayerhoff-Parnas ATP : Adenosine Triphosphate ADP : Adenosine Diphosphate PP : Pentoza Phosphat L.bulgaricus : Lactobacillus bulgaricus: L acidophilus : Lactobacillus acidophilus Opt : Optimum LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Số liệu, kết báo cáo luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Hồ Thị Hảo 10 2.2.1.6 Xác ñịnh hoạt lực γ-amilaza theo phương pháp vi lượng V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina 2.2.2 Phương pháp cơng nghệ 2.2.2.1 Xử lí hạt mít sản xuất bột hạt mít 2.2.2.2 Phương pháp thủy phân tinh bột hạt mít chế phẩm enzyme α-amylaza γ-amylaza 2.2.2.3 Môi trường lên men lactic 2.2.3 Phương pháp vi sinh vật 2.2.3.1 Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn 2.2.3.2 Phương pháp xác ñịnh gián tiếp số lượng tế bào cách đếm khuẩn lạc phát triển mơi trường thạch 2.2.3.3 Phương pháp chuyển giống sang môi trường lên men 2.2.4 Phương pháp toán học 11 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát ñặc ñiểm nguyên liệu nghiên cứu 3.1.1 Bột hạt mít 3.1.1.1 Xử lí thu nhận bột hạt mít Để tìm nồng độ xút thích hợp cho việc tách vỏ nâu, chúng tơi tiến hành ngâm hạt mít dung dịch NaOH có nồng độ: 1%, 2%, 3% 4% khoảng thời gian từ - phút Kết ñược thể bảng 3.1 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ xút đến q trình tách lớp vỏ nâu hạt mít STT NaOH, % Kết 1 Lớp vỏ nâu tách không hết, màu hạt ñậm tối 2 Lớp vỏ nâu chưa tách hết triệt để, màu hạt khơng đẹp, vàng nâu 3 Đã tách lớp vỏ nâu hạt, màu hạt ñẹp, trắng 4 Đã tách lớp vỏ nâu hạt, màu hạt ñẹp, trắng Như vậy, bắt ñầu nồng ñộ NaOH 3% ñã tách hết lớp vỏ nâu, ngâm lại nước lạnh rửa để khơng cịn lưu lại mùi xút 3.1.1.2 Xác ñịnh hàm lượng tinh bột hạt mít Với loại hạt mít thu mua kết tinh bột trình bày theo bảng sau: 12 Bảng 3.2 Hàm lượng tinh bột hạt mít Số lần đo Lần Lần Lần Lần Trung KQ ño (ml) (ml) (ml) (ml) bình (ml) Glucoza 0,5% 2,7 2,8 2,8 2,9 2,8 Dịch ñường 2,5 2,4 2,3 2,4 2,4 a (gam) 0,014 Mbột, % 65,62 Dựa vào kết thu ñược từ thực nghiệm thấy rằng, hàm lượng tinh bột hạt mít trung bình đạt 65,62% Trong đó, theo tài liệu hàm lượng tinh bột hạt mít 77.76 ± 0.96% 3.1.2 Chế phẩm enzyme Trong q trình thủy phân tinh bột hạt mít, chúng tơi sử dụng loại chế phẩm enzyme trình bày mục 2.2.2.2 3.1.2.1 Xác định hoạt lực chế phẩm enzyme α-amylaza Dịch enzyme ñưa ñược pha lỗng 10 lần để xác định hoạt lực, ñó: HdA = 588,235 x 10 = 5882,35 ñơn vị/ml Kết luận: Từ kết trên, suốt trình nghiên cứu, theo định kỳ chúng tơi kiểm tra lại hoạt lực chế phẩm enzyme ñể thuận lợi cho việc khảo sát hàm lượng enzyme bổ sung thủy phân 3.1.2.3 Xác ñịnh hoạt lực chế phẩm enzyme γ - amylaza HñG = 146,52 *10 = 1465 ñơn vị/ml Kết luận: Cũng tương tự chế phẩm enzyme α-amylaza, chúng tơi xác định hoạt lực chế phẩm γ - amylaza với mục đích thuận lợi cho suốt trình nghiên cứu Vì thời gian nghiên cứu, hoạt lực chế phẩm enzyme bị giảm, 13 thay chế phẩm sản xuất khác tăng hàm lượng chế phẩm enzyme bổ sung thủy phân 3.1.3 Vi khuẩn lên men lactic Trong nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactobacillus casei Sau hoạt hóa, chúng tơi chọn đốm khuẩn có màu trắng sữa, trịn ñều nhân giống cấp theo thời gian, bảo quản nhiệt ñộ thấp ñể phục vụ cho nghiên cứu 3.2 Nghiên cứu trình thủy phân tinh bột Sau dịch hóa chế phẩm α-amylaza với tỷ lệ 0,1% so với lượng bột có dịch bột , chúng tơi đưa nhiệt độ xuống 60oC điều chỉnh pH = 4,25, bổ sung chế phẩm γ - amylaza với tỷ lệ khác nhau: 0,12%; 0,14%; 0,16%; 0,18% 0,20% Giữ bể ổn nhiệt thời gian 175 -180 phút Để ñịnh lượng hàm lượng ñường khử tạo thành sử dụng phương pháp DNS trình bày mục 2.2.1.4 phụ lục 3.6 Trong phương pháp này, tiến hành xây dựng ñường chuẩn ñường glucose 3.2.1 Xây dựng ñường chuẩn ñường glucose Từ ñồ thị ñường chuẩn, xác ñịnh hàm lượng ñường khử tạo thành mức bổ sung chế phẩm enzyme γ - amylaza khác trình bày Mục đích để tìm hàm lượng chế phẩm γ - amylaza thích hợp cho q trình đường hố cho sau kết thúc q trình thủy phân lượng đường khử tạo thành cao 14 Hình 3.3 Đường chuẩn glucoza 3.2.2 Khảo sát hàm lượng chế phẩm γ - amylaza cần dùng Dịch đường sau thủy phân, chúng tơi tiến hành pha lỗng 100 lần đo OD Dựa vào ñồ thị ñường chuẩn 3.3, kết ñược thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Hàm lượng ñường khử tạo thành sau trình thủy phân STT Lượng enzyme γ amylaza bổ sung, % Lượng ñường khử tạo thành, gam/100ml Hiệu suất thủy phân,% 0,12 10,769 49,233 0,14 11,667 53,339 0, 16 14,000 64,005 0,18 20,000 91,436 0,20 15,556 71,119 Qua bảng kết ta thấy, thời ñiểm khảo sát, lượng chế phẩm enzyme γ - amylaza bổ sung tăng lượng dịch ñường tạo thành cao Khi hàm lượng enzyme 0,18% dịch bột lượng đường tạo thành cao nhất, ñồng thời hiệu suất thủy phân ñạt ñược cao 3.3 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến qúa trình lên men lactic Chúng tơi tiến hành thực trình lên men với ñiều kiện yếu tố khảo sát khác 15 Dịch ñường sau ñã ñiều chỉnh nồng độ khảo sát, chúng tơi tíến hành bổ sung thành phần dinh dưỡng trình bày mục 2.2.2.3 Tiếp đến hấp trùng mơi trường lên men 3.3.1 Khảo sát ñộng thái sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactobacillus casei Các khuẩn lạc Lactobacillus casei mức pha lỗng 10-3 thể hình 3.6 Pha lỗng 10-3 Hình 3.6 Các khuẩn lạc Lactobacillus casei mức pha loãng 10-3 Đồng thời với việc hút cấy canh trường vào môi trường MRS Chúng tơi tiến hành đo OD bước sóng 620nm mật độ pha lỗng khác Kết việc ño OD tương ứng với số lượng khuẩn lạc ñếm ñược mật ñộ pha lỗng khác nhau, chúng tơi xác định số lượng khuẩn lạc OD ñể thuận lợi cho lần lên men sau Từ ñường cong biểu diễn hình 3.7, chúng tơi suy luận lượng khuẩn lạc có dịch khuẩn chuẩn bị để cân đối lượng vi khuẩn cho mẽ lên men nghiên cứu Ở chúng tơi thấy bước sóng 620nm OD = 0,173, tương ứng với mức độ pha lỗng 10-3 lần, số lượng vi khuẩn đếm 51.103 tế bào/ml 16 Hình 3.7 Đường cong biểu diễn mật độ tế bào mức pha lỗng khác 3.3.2 Q trình lên men xử lí sau lên men Ở nghiên cứu này, sử dụng bình tam giác nhỏ để lên men Ở bình tam giác, chúng tơi lấy xác lượng dịch ñường ñã ñiều chỉnh nồng ñộ, bổ sung thành phần dinh dưỡng cần thiết cho môi trường mục 2.2.2.3 trình bày Sau hấp trùng 121oC 20 phút tiến hành lên men theo quy trình sau: Dịch đường Bổ sung thành phần dinh dưỡng CaCO3 Dịch ñường Bổ sung thành phần dinh dưỡng cấy vi khuẩn Lên men Dịch sau lên men Xử lý Axit lactic dạng thô Định lượng Nuôi 24 17 3.3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên men Kiểm sốt mật độ tế bào trước thực cấy giống cho trình lên men Dịch ni cấy từ bình nhân giống cấp sang bình lên men phải đạt giá trị OD620nm ≈ 0,173 (sau pha loãng 10-3 lần) Kết ñược thể hình 3.10 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hàm lượng axit lactic tạo thành Từ ñồ thị cho ta thấy lượng axit lactic tạo thành nhiệt o ñộ 37 C cao 3.3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ giống vi khuẩn lên men Kiểm sốt mật độ tế bào trước thực cấy giống cho trình lên men Dịch ni cấy từ bình nhân giống cấp sang bình lên men phải đạt giá trị OD620nm ≈ 0,173 (sau pha lỗng 10-3 lần) Kết thể hình 3.11 18 18.5 18 Lượng axit lactic, g/l 17.5 17 16.5 16 15.5 15 14.5 14 Tỷ lệ vi khuẩn, % Hình 3.11 Ảnh hưởng tỷ lệ giống ñến lượng axit lactic tạo thành Nhận xét: Kết qủa thể ñồ thị cho thấy lượng giống ban đầu thích hợp cho việc lên men tạo axit lactic 5% v/v 3.3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ dịch đường Kiểm sốt mật ñộ tế bào trước thực cấy giống cho q trình lên men Dịch ni cấy từ bình nhân giống cấp sang bình lên men phải đạt giá trị OD620nm ≈ 0,173 (sau pha loãng 10-3 lần) Kết thể hình 3.12 Hình 3.12 Ảnh hưởng nồng ñộ dịch ñường ñến hàm lượng axit lactic tạo thành 19 Thơng qua đồ thị cho thấy hàm lượng đường dịch đường thích hợp cho việc tạo axit lactic cao nồng ñộ ñường 5% (g/100ml) 3.3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lên men Kiểm sốt mật độ tế bào trước thực cấy giống cho trình lên men Dịch ni cấy từ bình nhân giống cấp sang bình lên men phải ñạt giá trị OD620nm ≈ 0,173 (sau pha lỗng 10-3 lần) Kết thể hình 3.13 Hình 3.13 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hàm lượng axit lactic tạo thành Chúng tơi ñã xác ñịnh với khoảng thời gian 72 lượng axit lactic sinh cao 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng ñồng thời hai yếu tố ñến trình lên men lactic 3.4.1 Lập ma trận quy hoạch thực nghiệm xác ñịnh hệ số phương trình Căn vào giá trị thích hợp ñã khảo sát mục 3.3.2.3 3.3.2.4, chọn mức trên, mức cho yếu tố sau: 20 - Các yếu tố ảnh hưởng: z1 nồng ñộ dịch ñường ban ñầu (%), z2 thời gian lên men (giờ) - Hàm mục tiêu y: hàm lượng axit lactic tạo thành sau lên men ( y → max) Phương trình biểu diễn có dạng: y = f (Z1, Z2) Từ yếu tố trên, chúng tơi dây dựng điều kiện thí nghiệm theo bảng sau: Bảng 3.6 Các điều kiện thí nghiệm TYT 22 Chỉ số z1 z2 y (Zjo) 72 - Khoảng biến thiên - Mức (Zjmax) 80 - Mức (Zjmin) 64 - Mức * Chọn phương án quy hoạch trực giao cấp I (TYT 2k) Lập thí nghiệm tối ưu hóa theo thực nghiệm yếu tố tồn phần 2k dựa điều kiện ñã khảo sát (k số yếu tố ảnh hưởng, thí nghiệm k = 2) Các thí nghiệm thực điều kiện pH ban ñầu, chế ñộ lắc nhiệt ñộ tối ưu Phương trình hồi qui có dạng: y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 (3.1) Trong đó: x1: Biến số mã hố biến thực Z1- Nồng độ dịch đường x2: Biến số mã hoá biến thực Z2 - Thời gian lên men y: Hàm mục tiêu - Hàm lượng axit lactic tạo thành, g/l b0, b1, b2, b12: Các hệ số phương trình hồi quy * Bố trí thí nghiệm trực giao cấp I: 21 Kết thí nghiệm thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết thí nghiệm theo thực nghiệm TYT 22 Hàm mục Biến mã STT Số thí tiêu x1 x2 x1.x2 y nghiệm - - + 17,68116 phương án 2k - + - 17,97101 + - - 18,15384 + + + 18,82353 Số thí 0 18.18182 nghiệm 0 18,48484 tâm 0 18.20896 Tương ứng với số liệu từ thực nghiệm bảng kết quả, chúng tơi tiến hành tính hệ số b kết sau: b0 = 18,1574, b1 = 0,3313 , b2 =0,2398, b12=0,0949 Từ kết trên, thay hệ số b vào phương trình (3.1), ta có dạng phương trình hồi quy sau: y = 18,1574 + 0,3313x1 + 0,2398x2 + 0.0949x1x2 3.4.2 Kiểm định có nghĩa hệ số theo tiêu chuẩn Student Để kiểm tra ý nghĩa hệ số b phương trình hồi cần tính phương sai tái Để xác định phương sai tái hiện, chúng tơi làm thí nghiệm tâm phương án Sau tính kiểm tra ý nghĩa hệ số b, thu phương trình hồi quy thực có dạng sau là: y = 18,1574 + 0,3313x1 + 0,2398x2 (3.5) 22 3.4.3 Kiểm tra tương thích phương trình hồi quy Chúng tơi kiểm tra tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm định theo tiêu chuẩn Fisher Sau tính tốn kiểm tra chúng tơi thấy phương trình phù hợp với số liệu thực nghiệm Vậy phương trình hồi quy là: y = 18,1574 + 0,3313x1 + 0,2398x2 (3.8) 3.4.4 Tối ưu hóa thực nghiệm Cũng từ mơ hình tốn học cho thấy muốn tăng giá trị thơng số tối ưu hóa cần tăng giá trị yếu tố x2 tăng giá trị yếu tố x1 Như ñể thu nhận ñược nhiều axit lactic phải thực tối ưu hóa phương pháp leo dốc (phương pháp Box-Wilson), bắt ñầu từ ñiểm không, mức sở: z1 = 5, z2= 72 Bảng 3.10 Kết thí nghiệm leo dốc theo phương pháp Box-Wilson Thí nghiệm Biến thực Biến mã Hàm mục tiêu Z1 (%) Z2 (giờ) x1 x2 Y TN tâm 72 0 18,2918 78 0,75 18.3301 84 1,50 18,7052 90 2,25 19,9415 96 3,00 17,6742 23 Vậy kết nhận thí nghiệm cao nhất, với hàm lượng axit lactic tạo thành 19,9415 (mg/10ml), ứng với nồng ñộ dịch ñường lên men 8% thời gian lên men 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Hàm lượng tinh bột có bột hạt mít nghiên cứu 65,62% Trong q trình dịch hóa tinh bột hạt mít, với hàm lượng enzyme α-amylaza bổ sung 0,1% đường hóa tinh bột hạt mít lượng enzyme γ - amylaza bổ sung 0,18% Sau q trình thủy phân, dịch đường tạo thành đạt 20gam/100ml, hiệu suất thủy phân ñạt 91,43% Sau kiểm định có nghĩa hệ số theo tiêu chuẩn Student kiểm tra tương thích phương trình hồi quy, chúng tơi xây dựng phương trình phù hợp với số liệu thực nghiệm sau: y = 18,1574 + 0,3313x1 + 0,2398x2 Trong đó: x1 biến số mã hóa biến thực z1 (nồng độ dịch đường) x2 biến số mã hóa biến thực z2 (thời gian lên men) y hàm lượng axit lactic tạo thành (g/l) Xác ñịnh ñược ñiều kiện tối ưu lên men + Nồng ñộ dịch ñường lên men 8% + Nhiệt ñộ lên men 37oC 24 + pH =6 + Thời gian lên men 90 + Hàm lượng axit lactic tạo thành ñạt ñến 19,9415 g/l KIẾN NGHỊ Nếu tiếp tục nghiên cứu lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít, chúng tơi đề nghị ñược lên men ñiều kiện tối ưu hơn, tức có thiết bị lên men với suất nhỏ Từ từ kết qủa thực nghiệm, chúng tơi mạnh dạn đưa quy mơ sản xuất axit lactic theo pilot Từ axit lactic tạo thành, tinh chế ứng dụng vào nhiều ngành cơng nghiệp khác ... đề tài ? ?Nghiên cứu q trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít? ?? việc làm cấp thiết -32 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Sử dụng hạt mít làm nguyên liệu để tiến hành thủy phân thu nhận dịch lên men -... lí hạt mít sản xuất bột hạt mít Hạt mít thu nhận từ nhiều sở sản xuất nhỏ lẻ Quá trình xử lý thu nhận bột hạt mít trình bày quy trình bên Hạt mít thu nhận ñược tách hợp chất hữu xơ, vỏ, cồi mít. .. để lên men axit lactic phong phú rỉ đường, đường củ cải, nước mía, phế phẩm công nghiệp khác…Nhưng nghiên cứu lên men thu nhận axit lactic từ tinh bột hạt mít chưa nhà khoa học quan tâm, hạt mít