THU NHẬN ENZYME PEPSIN TỪ NỘI TẠNG ĐỘNG VẬT

THU NHẬN ENZYME PEPSIN TỪ NỘI TẠNG ĐỘNG VẬT tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất...

THU NHẬN ENZYME PEPSIN TỪ NỘI TẠNG

ĐỘNG VẬT

–A2T –

I ) TỔNG QUAN

1) Nguyên liệu: Dạ dày heo

a) Cấu trúc và chức năng của dạ dày

Cấu trúc: dạ dày là một đoạn phình ra của ống tiêu hoá có tác dụng: chứa thức ăn, nhào trộn thức ăn để thấm dịch vị Thức ăn sẽ chịu sự tiêu hoá của các enzyme tiêu hóa chứa trong dịch vị, chuẩn bị cho giai đoạn chính tiêu hoá ở ruột non

Các tuyến chính của dạ dày:

- Tế bào niêm dịch bài tiết chất nhày

- Tế bào chính bài tiết pepsinogen, rennin, gelatinase

- Tế bào viền bài tiết HCl

- Tế bào bài tiết gastrin

Dạ dày sản xuất pepsin , một enzyme chuyên phân huỷ protein Sự phân huỷ cơ chất làm giảm độ acid trong dạ dày: làm thay đổi mạnh pH trong dạ dày, và nhờ hoạt động phân huỷ protein của pepsin, khối lượng thức ăn giảm và khả năng tiêu hoá protein tăng lên

Pepsin phân bố trên những phần khác nhau của dạ dày và ở dạng tiền pepsin (pepsinogen) Pepsinogen tập trung chủ yếu ở phần đáy mỏng của dạ dày, chiếm đến 75%

b) Niêm mạc dạ dày – dịch vị dạ dày

Niêm mạc dạ dày: là lớp màng nhầy bên trong cùng của dạ dày Trong niêm mạc

có những ống bài tiết những chất khác nhau, người ta chia dạ dày ra thành từng vùng:

- Vùng quanh tâm vị của niêm mạc bài tiết nhiều chất nhầy, ít pepsinogen

- Vùng giữa ( đáy và thân dạ dày) bài tiết thành phần chính dịch vị là HCL,

pepsinogen, các enzyme tiêu hoá khác

-Vùng dưới thân dạ dày là hang vị, bài tiết chính là vị tố gastrin và ít chất nhầy Dịch vị dạ dày: dịch vị do các tuyến ống của dạ dày tiết ra Đó là một dịch không màu, trong và không mùi Trong dịch vị có 2 chất hoạt động chính là HCL và pepsin, pH= 1,5-3, tỷ trọng 1,001-1,01 Mỗi ngày dạ dày tiết khỏang 1500ml dịch vị

2) Thành phần, cấu tạo enzyme pepsin:

Pepsin hoạt động trong dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát và cá Ở heo pepsin tập trung chủ yếu ở phần đáy dạ dày Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin,

gelatinase,cathepsin và Brucke pepsin Pepsin heo thô chứa một pepsin chính A, pepsin phụ B, C,D và gastricsin(E.C.3.4.4.22)

Pepsin

a ) Cấu trúc:

Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản có thể cuộn lại thành hình cầu, pepsin là một protein vững chắc bởi các mối liên kết hydro, hyrophobic, liên kết điện tử và ba liên kết S-S

b ) Cấu tạo:

-Pepsin gồm một mạch polypeptide hợp thành bởi 329 amino acid, mà đầu C là alanin và đầu N là isoleucin Trung tâm hoạt động của pepsin gồm một hoặc hai nhóm cacboxyl của acid glutamic, một nhân thơm (phenol) của tyrosin

-Thành phần hóa học: hàm lượng N trong phân tử pepsin là 14,7% (Rajagopalan

và cộng sự, 1966)

Thành phần amino acid: pepsin chứa đặc biệt nhiều amino acid có tính acid nên pepsin thể hiện tính acid mạnh Phân tử pepsin của heo chứa khoảng 36 nhóm

cacboxyl tự do, trong khi đó chỉ chứa 2 gốc arginin, một gốc lysin, gốc histidin Pepsin cũng chứa nhiều amino acid kỵ nước (theo Perlmamn, 1959) Số lượng amino acid có mạch nhánh không phân cực là lớn, làm cho enzyme dễ tan trong rượu etylic nồng độ cao

và trong các hỗn hợp chứa nhiều dung môi phân cực

Cystin

Cystein

Methionin

Arginin

Histidin

Lysin

Acid Aspartic

Acid glutamic

Serin

Threonin

1,64 0,50 0,70 1,00 0,90 0,90 16,00 11,90 12,20 9,60

4 2 4 2 2 2 41 28 40 28

Glycin Valin Leucin Prolin Phenylalanin Isoleucin Tyrosin Trytophan Amids N

6,40 7,10 10,40 5,00 6,40 10,80 8,50 2,40 1,32

20 21 27 15 13 28 16 4 32

A-số gram amino acid trong 100g pepsin

B-số gốc amino acid trong một phân tử pepsin

d)Thành phần và cấu tạo:

Do đặc điểm về thành phần amino acid, pepsin tinh khiết mang điện tích âm ngay

cả trong môi trường HCL 0,1 N( theo Herriot, 1940)

Pepsin đựơc tạo thành từ màng nhầy và ở các phần khác của dạ dày thì tạo các dạng pepsin khác nhau: pepsin A,B, C, D và các pepsinogen tương ứng Trọng lượng phân tử của pepsin là 34,500 Dalton Pepsin của heo lớn hơn một chút khoảng 35000 Dalton

3) Đặc tính enzyme pepsin:

Chế phẩm enzyme tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi chua, nếu thêm lactose, glucose hay saccharose thì có vị ngọt ( dược điển Việt Nam)

Pepsin dễ hút ẩm, tan trong nước cho một dung dịch đục lờ, không tan trong cồn

950, ester, chloroform Pepsin ở cả 2 dạng: kết tinh và thô Điểm đẳng đĩện của pepsin ở gần pH=1

Pepsin thuỷ phân protein trong vùng acid khá rộng từ 1-4 pH hoạt động tối ưu của pepin thay đổi tuỳ theo bản chất và trạng thái của cơ chất thường pH trong khoảng từ 1,8-2,2 Pepsin bền nhất ở pH trong khoảng từ 4-5, nhưng trong vùng pH này hoạt lực của enzyme có phần thay đổi giảm đi Từ pH =5,5 trở lên, pepsin không hoạt động Khả năng hoà tan của pepsin tuỳ thuộc vào độ tinh khiết

Quá trình dự trữ pepsin:

- Pepsinogen ổn định 12-18 tháng ở 2-80C

-Pepsin ổn định 1-2 năm ở 2-80C

- Dự trữ ở 2-80C

Chế phẩm enzyme thô có thể dữ hoạt tính trong nhiều năm ở nhiệt độ 0-40C Pepsin ở dạng dung dịch ở pH=6 Pepsin ở trạng thái khô khá bền, ngay cả trong môi trường nhiệt độ thường, dung dịch pepsin kém bền nhất ở pH quá thấp Khi đó ta thấy xảy ra hiện tượng tự tiêu của enzyme, kèm theo sự tạo thành các phân tử nhỏ Bởi vì pepsin là một protease hoạt động mạnh trong môi trường khá acid

4) Sự hoạt hóa pepsinogen thành pepsin.

Pepsinogen: được khám phá do Langley Ở phần màng nhầy dạ dày của động

vật, có các tế bào chứa zymogen hay pepsinogen (dạng tiền pepsin không họat động) Phần môn vị heo của bao tử gồm những tế bào đỉnh vách, nó có thể tiết ra acid HCL Chính acid này dẫn đến sự tiết của pepsinogen và chuyển hoá nó bằng khả năng tự hoạt hoá để thành pepsin với nồng độ acid tự nhiên của môi trường trong dạ dày Quá trình này xảy ra ở pH<6 Khi trong môi trường có pH cao hơn, có thể xảy ra sự tái hợp ngược lại

Pepsinogen -Ở pH =4,7 không có hoạt động đông tụ, ở giá trị pH <6 pepsinogen có tính acid kém hơn pepsin Pepsinogen ổn định được trong môi trường trung tính và kiềm yếu pH= 7-9, nhưng sẽ bị phá huỷ cấu trúc nếu pH>9 và bị huỷ nếu ngâm trong dung dịch etanol 50% trong 24 giờ, pepsinogen chỉ ổn định trong một thời gian ngắn với pH<6

Sự hoạt hoá pepsinogen: enzyme phải được hình thành bên trong tế bào, nhưng

được kiểm soát bên ngoài vì nếu không nó sẽ xử lý tức thì chính protein của tế bào Để giải quyết vấn đề này, pepsin và nhiều enzyme phân cắt khác nhau được tạo ra ở dạng bất

hoạt “proenzyme” mà nó có thể được hoạt động an toàn bên ngoài tế bào

Sơ đồ sự họat hóa pepsinogen thành pepsin -Pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin, tức là pepsinogen bất hoạt Khi tiếp xúc với môi trường acid tự nhiên của bao tử hoặc chính pepsin Quá trình hoạt hóa

pepsinogen là quá trình thuỷ phân liên kết peptide giữa acid glutamic 41 và izoleucin 42, giải phóng peptide kìm hãm, thành phần amino acid của peptide kìm hãm này tương ứng với 41 amino acid của pepsinogen và phản ứng bởi ion H+ và cũng chính bởi pepsin

-Pepsin được tạo thành lại tiếp tục xúc tác qúa trình giải phóng peptide kìm hãm, chuyển pepsinogen thành pepsin hoạt động Vì vậy quá trình này mang tính chất của một quá trình tự xúc tác Sự hoạt hóa pepsinogen chỉ xảy ra trong môi trường acid có pH<5,6, Khi pH>5,6, peptide kìm hãm lại có thể kết hợp thuận nghịch với pepsin tạo thành phức hợp không hoạt động

Toàn bộ quá trình tạo thành pepsin từ pepsinogen có thể biểu diễn như sau:

pepsin

Pepsinogen phức hợp -> pepsin- chất ức chế+ 5 peptide

pH=4,5

Phức hợp pepsin- chất ức chế < -> pepsin + chất ức chế

pH=5,4

Chất ức chế - > 4 peptide

5)Những yếu tố ảnh hưởng đến họat tính của pepsin:

 Ảnh hưởng của pH:

-Pepsin là một protease acid điển hình, họat động ở vùng pH acid từ 1-4, pH thích hợp của pepsin khỏang 1,5-2,4 Đối với mỗi cơ chất thì pH thích hợp có thể thay đổi

-Pepsin bền vững ở vùng pH rất acid, nó có độ bền tối đa ở pH=4-5 nhưng trong vùng pH này thì họat lực của enzyme rất thấp Từ pH >5,5 pepsin không họat động vì liên kết Hydro trong protein enzyme bị phá vỡ gây nên sự biến tính protein Ở pH quá thấp thì pepsin xảy ra hiện tựơng tự phân Pepsin có điểm đẳng điện pI khỏang 1-1,4

 Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Pepsin là một enzyme họat động ở nhiệt độ khá cao Pepsin họat động ở nhiệt độ thích hợp tối ưu khỏang từ 40-500C Ở 700C, pepsin mất khả năng tiêu đạm Tốc độ xúc tác phản ứng thủy nhiệt của pepsin không cao bằng các protease khác nhưng độ bền nhiệt của pepsin cao hơn, nhất là khi cơ chất có mặt một số ion kim loại đặc biệt như Ca2+

 Ảnh hưởng cuả các lọai muối và các dung môi hữu cơ:

Tùy theo bản chất hóa học của muối mà ảnh hưởng ít nhiều đến họat động xúc tác của pepsin Vd:

-Các muối trung tính như NaCl, KBr, MgSO4 ít tác động trên pepsin, chúng chỉ ức chế pepsin ở liều cao

-Các chất hữu cơ kiềm hay dung dịch muối kiềm như NaHCO3 làm chậm sự pepton hóa của pepsin

Các muối kim lọai nặng như Pb, Hg, Pt ở nồng độ rất thấp vẫn có thể gây kết tủa

và làm biến tính enzyme

-Các dung môi hữu cơ ít phân cực, cũng như các chất họat động bề mặt làm giảm họat tính cuả pepsin

 Ảnh hưởng cuả chất sát khuẩn:

Các chất sát khuẩn như HCN, Salisilic acid, Cloroform… với lượng nhỏ thì không ảnh hưởng đáng kể đến pepsin Nhưng khi với liều cao, chúng sẽ làm giảm họat tính của pepsin

 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm:

Tất cả các chất gây biến tính protein đều là những chất kìm hãm không đặc hiệu của enzyme nói chung và pepsin nói riêng Ngoài ra, có nhiều chất không làm biến tính

protein enzyme nhưng vẫn làm giảm họat độ xúc tác do cơ chế kìm hãm cạnh tranh và kìm hãm không cạnh tranh…

II ) CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME PEPSIN:

Bản chất của quá trình chiết tách pepsin từ màng nhày dạ dày là sự phối hợp của

ba quá trình: phá vỡ tế bào, họat hóa và chiết tách enzyme

Qui trình công nghệ sản xuất enzyme pepsin:

Dạ dày

Xử lý sơ bộ

Lọc

Ly tâm

10-15 phút

Tinh sạch

Bảo quản Sấy khô

Pepsi n

B ã

Kết tủa

Trích ly

Dịch enzym NaCl 25%

Giải thích qui trình:

1) Nguyên liệu: dạ dày heo vừa mới giết mổ để thu được pepsin có họat tính

cao, bảo quản ở nhiệt độ lạnh đông (dưới -180C) trong một thời gian ngắn trước khi thực hiện

2) Xử lý sơ bộ:

+Tách màng nhày: rửa sạch bên ngòai trước khi lộn ngược dạ dày, rửa thật nhẹ tay màng nhày bằng nước lạnh chỉ để lọai bỏ thức ăn thừa không làm tổn thất lớp màng nhày chứa pepsin và tiến hành bóc màng nhày

+Xay nhuyễn: Màng nhày dạ dày sau khi tách, cắt nhỏ và xay nhuyễn đồng nhất

3) Trích ly: có 2 phương pháp

xay nhỏ sẽ được trộn với HCl 0,5% với tỷ lệ 1:2 theo khối lượng, nhiệt

độ 40-500C, thời gian 24-28 giờ

dịch muối có pH cao không thuận lợi cho trích ly enzyme nên sau khi cho dung dịch muối vào sẽ dùng acid HCl 6M chỉnh về pH 4, rồi bổ sung Natri benzooat 1% để dung dịch không bị hư hỏng trong suốt thời gian trích ly, nhiệt độ 40-500C, thời gian 24-28 giờ

Để vớt bỏ lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua lớp vải mùn thu dung dịch enzym.

5) Kết tủa enzyme:

Có 2 phương pháp:

Sử dụng NaCl có nồng độ bão hoà 25% để làm tủa pepsin Cho muối từ từ, khuấy nhẹ cho đến khi dung dịch bão hòa, để yên dịch thủy phân 30 phút

Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra một nhiệt lượng lớn, có thể làm mất họat tính của enzym Do đó dung dịch sau tự phân đã lọc cùng dung môi được làm lạnh trước khi sử dụng và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp Thời gian 5-10 phút, trong lúc đó nhiệt độ không quá 50C

6) Ly tâm:

Hỗn hợp dung dịch sau khi để yên đem ly tâm 10-15 phút với tốc độ 5000-6000 vòng/phút

7) Tinh sạch:

Phương pháp qua lọc gel sephadex: ta dùng gel sephadex G-100

Nguyên tắc:

Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhau chạy qua cột chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trình tách những phân tử có kích thước và trọng lượng khác nhau Những chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ gel do đó sẽ di chuyển chậm qua cột Các chất có phân tử lượng lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài hạt gel nên sẽ chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột trước Sau đó, chất có phân

tử lượng nhỏ sẽ lần lượt đi ra theo mức độ phân tử lượng của chúng Kết quả là tách được các chất có phân tử lượng khác nhau thành các phân đoạn theo trình tự: các phân đoạn có trọng lượng phân tử lớn ra trước, các phân đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ ra sau.

8) Sấy đông khô:

Nguyên tắc cuả phương pháp sấy đông khô là nước ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển từ trạng thái đá (rắn) vào trạng thái khí mà không qua giai đọan lỏng (nước) Nhờ vậy nước được đưa ra khỏi nguyên liệu mà không làm hỏng nguyên liệu Quá trình sấy đông khô gồm 3 giai đọan:

-GĐ 1- làm lạnh: đây là giai đọan quan trọng làm lạnh nguyên liệu xuống điểm eutecti- điểm có nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha lỏng và pha rắn cùng tồn tại-đảm bảo cho quá trình thăng hoa xảy ra ở giai đọan kế tiếp

-GĐ 2- sấy bậc 1: tạo áp suất chân không và hạ nhiệt độ xuống -400C để nước trong nguyên liệu thăng hoa ở trạng thái lạnh

-GĐ 3- sấy bậc 2: giai đọan này có nhiệt độ sấy cao hơn giai đọan sấy bậc một để giúp cho các nguyên liệu giữ nguyên các tính chất hóa lý Giai đọan này áp suất chân không tiếp tục thúc đẩy quá trình thăng hoa

*Phương pháp này giúp enzym giữ nguyên được tính chất hóa lý và có thể bảo quản trong thời gian dài Nếu sấy ở nhiệt độ thường dễ làm enzym hư hỏng mất đi tính chất ban đầu

9) Bảo quản:

Chế phẩm pepsin thô cần được bảo quản ở điều kiện khô, kín, lạnh, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng và các tác nhân lý, hóa học có ảnh hưởng đến họat tính của enzym

:

m

m H

ngandaday

ay enzymesaus

H: hiệu suất thu hồi enzyme (%)

menzymesausấy: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)

mngăndạdày: khối lượng ngăn dạ dày chứa enzyme đang khảo sát (g)

III.ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM ENZYME

1 Khảo sát hàm lượng protein theo phương pháp Bradford:

Phương pháp này dựa vào sự đổi màu khi cho Coomassie Brilliant Blue-G250 liên kết với protein trong môi trường acid Thuốc nhuộm này sẽ tạo với protein, tương tác với các nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện dương trên phân tử protein thành một phức chất màu xanh, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 595nm Cường độ màu này tỉ lệ thuận với hàm lượng protein, nên bằng phương pháp so màu có thể xác định được lượng protein

Ưu điểm: đây là phương pháp có độ nhạy cao, chình xác vài μg, hoá chất đơn giản, ít tốn kém

Xác định hàm lượng protein có trong mẫu:

10− 3

×

×

−

∆

=

V

F a

b OD P

PU

Xác định hàm lượng prtein tổng trong mẫu enzyme:

10− 3

×

×

×

= V m m

mau

mau

P: hàm lượng protein của mẫu enzyme đem xác định hàm lượng protein (mg/mL)

∆OD: hiệu suất mật độ quang của mẫu enzyme đo được ở λ = 605 nm (A)

F: độ pha loãng mẫu enzyme

Vpu: thể tích mẫu enzyme đem xác định hàm lượng protein

Vmau: thể tích mẫu đich enzyme (mL)

mmau: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg)

menzyme: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)

Pt: hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme (mg protein)

2 Khảo sát hoạt lực đông tụ sữa của enzyme:

Protease ngoài khả năng thuỷ phân protein đều có khả năng đông tụ sữa tuỳ mức

độ khác nhau, mạnh nhất là rennin, sau đó là pepsin và các protease khác Quá trình đông

tụ sữa được ứng dụng trong sản xuất phomai

Xác định hoạt độ đông tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm đông tụ một thể tích dung dịch sữa có nồng độ xác định

Hoạt lực đông tụ sữa của enzyme trong 1mL

F E

V

T V E

=

Tổng hoạt lực đông tụ sữa

10− 3

×

×

×

= V m m

mau

mau

Hoạt lực đông tụ riêng của enzyme

P

E E

t

t

E: hoạt lực đông tụ sữa (ĐV/mL)

Vs: thể tích dung dịch sữa (mL)

VE: thể tích dịch enzyme sử dụng (mL)

T: thời gian đông tụ sữa (phút)

F: độ pha loãng dịch enzyme

Et: tổng hoạt lực đông tụ sữa (UI)

Vmau: thể tích mẫu dịch enzyme (mL)

mmau: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg)

menzyme: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)

Pt: hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme (mg protein)

3 Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến

Mục đích: khảo sát hoạt lực proteolytic để biết được khả năng thủy phân liên kết peptide