Nghiên cứu tối ưu điều kiện thu nhận enzyme protease từ sò lụa và thử nghiệm thủy phân thịt cá

Đề tài này tiến hành tách chiết protease từ sò lụa và bước đầu thử nghiệm sử dụng enzyme thu được để thủy phân thịt cá. Kết quả nghiên cứu xác định được điều kiện tối ưu tách chiết protease thích hợp từ sò lụa là đệm phosphat pH 7 với tỷ lệ dung môi/mẫu là 1,8/1, nhiệt độ chiết tối ưu là 31oC và thời gian chiết tối ưu là 13 phút. Thu được CPE protease bằng phương pháp kết tủa với aceton 96%, tỷ lệ enzyme/dung môi là 1/2, thời gian tủa là 15 phút. Mời các bạn cùng tham khảo!

Kỷ yếu Hội nghị khoa học NGHIÊN CỨU TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ SÒ LỤA VÀ THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN THỊT CÁ Trần Quốc Đảm*, Đào Thị Tuyết Mai Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Tác giả liên lạc: damtq@cntp.edu.vn TĨM TẮT Protease có khả thủy phân protein thành peptid acid amin hay gọi dịch đạm thủy phân ứng dụng nhiều ngành công nghiệp Động vật thủy sản có chứa hệ enzyme protease có hoạt tính cao nên việc nghiên cứu thu nhận protease từ động vật thủy sản nhiều nhà khoa học quan tâm Trong nghiên cứu này, tiến hành tách chiết protease từ sò lụa bước đầu thử nghiệm sử dụng enzyme thu để thủy phân thịt cá Kết nghiên cứu xác định điều kiện tối ưu tách chiết protease thích hợp từ sị lụa đệm phosphat pH với tỷ lệ dung môi/mẫu 1,8/1, nhiệt độ chiết tối ưu 31oC thời gian chiết tối ưu 13 phút Thu CPE protease phương pháp kết tủa với aceton 96%, tỷ lệ enzyme/dung môi 1/2, thời gian tủa 15 phút Thử nghiệm thủy phân thịt cá CPE protease nhiệt độ 55 oC, pH 6,0 hiệu thủy phân thịt cá đạt 33,38% sau thời gian thủy phân Từ khóa: Protease, nhuyễn thể mảnh vỏ, sò lụa STUDY ON OPTIMAL CONDITIONS FOR PRODUCTION OF PROTEASE ENZYME FROM PAPHIA UNDULATA AND EXPERIMENT ON FISH MEAT HYDROLYSIS Tran Quoc Dam*, Dao Thi Tuyet Mai Ho Chi Minh city University of Food Industry *Corresponding Author: damtq@cntp.edu.vn ABSTRACT Protease, known as a proteolytic enzyme which is used in many industries, is capable of hydrolyzing proteins into peptides or amino acids Aquatic animals contain highly active proteolytic enzyme system, therefore the research on protease collection from aquatic species attracts much attention of various scientists In this study, we extracted protease from undulated surf clam (Paphia undulata) and initially made experiments using enzyme to hydrolyze fish meat The study result showed the optimal conditions for protease extraction rom Paphia undulate, including: phosphate buffer (pH 7) with a 1,8/1 ratio solvent/sample, the optimal extraction temperature and time was at 31oC and 13 minutes, respectively Obtained protease by precipitation with acetone 96%, enzyme/solvent ratio of 1/2, the precipitation duration of 15 minutes Hydrolysis of fish meat with protease at 55 oC, pH 6.0 and efficiency of fish meat hydrolysis achieved 33,38% after hours of hydrolysis Keywords: Protease, shellfish, paphia undulata Có nhiều CPE thương mại hóa mang lại giá trị kinh tế lớn nhiều quốc gia Ngày nay, nghiên cứu thu nhận enzyme từ nguyên liệu thủy sản nhiều nhà nghiên cứu quan tâm [8] Nội tạng động vật thủy sản có chứa nhiều loại enzyme khác protease loại có hoạt tính cao Phần lớn nghiên cứu tập trung thu nhận protease từ hai đối tượng cá, tôm mực Trong thực tế, nhuyễn thể mảnh vỏ ĐẶT VẤN ĐỀ Protease enzyme ứng dụng nhiều Trong cơng nghiệp thực phẩm, protesase có vai trị quan trọng trình sản xuất nước nắm, sản xuất dịch đạm acid amin, sữa, phomai [2, 8] Việc sử dụng chế phẩm enzyme (CPE) góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm giảm thiểu tác động gây ô nhiễm môi trường nhiều so với việc sử dụng chất hóa học Chính thế, CPE ngày sử dụng phổ biến 96 Kỷ yếu Hội nghị khoa học nước cất đưa nghiền nhuyễn Hỗn hợp nội tạng sò đưa ủ 35oC thời gian khoảng 30 phút trước tách chiết enzyme [5, 8] Phương pháp thu nhận dịch protease thơ từ sị lụa Nội tạng sị chiết với dung môi theo tỷ lệ mẫu/dung môi 1/2, nhiệt độ phòng thời gian 15 phút Sau chiết đủ thời gian tiến hành đưa mẫu chiết ly tâm lạnh với tốc độ 6000 vòng/phút, 4oC 15 phút Sau ly tâm, thu phần dịch lỏng có chứa protease bên loại bỏ phần kết tủa bên Phần dịch lỏng gọi dịch protease thô [5, 8] Phương pháp tối ưu hóa Tối ưu hóa điều kiện tách chiết protease từ sị theo quy hoạch thực nghiệm Bố trí thí nghiệm xử lý số liệu tối ưu phần mềm Design-Expert 10 (DX10) Phương pháp xác định hoạt độ protease Hoạt độ protease xác định theo phương pháp Anson cải tiến Hoạt độ protease xác định dựa vào lượng µg tyrosin hình thành q trình thủy phân casein Một đơn vị hoạt độ protease lượng enzyme thủy phân casein tạo thành µg tyrosin phút điều kiện thí nghiệm [2] Định lượng nitơ amin, nitơ amoniac nitơ tổng số Hàm lượng nitơ amin xác định dựa vào hàm lượng nitơ amin-amoniac (Xf) hàm lượng nitơ amoniac (X NH3) Đạm nitơ amin (Xaa) tính sau: Xaa= Xf – XNH3 - Hàm lượng nitơ amin-amoniac xác định phương pháp formol (TCVN 370790) - Hàm lượng nitơ amoniac xác định phương pháp chưng cất (TCVN 2626-98) - Hàm lượng nitơ tổng số xác định phương pháp kjeldah (TCVN 3705-90) có chứa hệ enzyme protease có hoạt tính cao [4, 10] Hệ enzyme protease phân bố phần lớn nội tạng động vật thủy sản Do việc tận dụng nguồn phế liệu thủy sản để thu nhận enzyme protease mang ý nghĩa to lớn [8] Nhuyễn thể mảnh vỏ sử dụng thức ăn theo chế lọc nên khả tích lũy cát sạn, tạp chất độc tố thể nói chung nội tạng nhuyễn thể nói riêng lớn Như vậy, việc loại bỏ nội tạng nhuyễn thể cần thiết để đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng sử dụng sản phẩm từ đối tượng [7] Tổng sản lượng nhuyễn thể mảnh vỏ năm khoảng 400.000 tấn, sị 54.280 (Tổng Cục thủy sản, 2016) Bên cạnh việc khai thác từ tự nhiên, số nhuyễn thể mảnh vỏ nuôi nhiều tỉnh ven biển nên sản lượng thu hàng năm ổn định Để thu nhận enzyme protease có hoạt tính cao việc lựa chọn nhuyễn thể mảnh vỏ nghiên cứu điều kiện tách chiết cần thiết Ngồi ra, hoạt động enzyme phụ thuộc vào điều kiện mơi trường mà xúc tác [2, 11] Do đó, việc xác định điều kiện hoạt động thích hợp enzyme sở cho việc ứng dụng enzyme đạt hiệu Mục tiêu nghiên cứu lựa chọn loại nhuyễn thể mảnh vỏ chứa protease có hoạt tính cao để thu nhận thử nghiệm ứng dụng enzyme vào thủy phân thịt cá VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Sò lụa Sò lụa nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu mua dạng sống đưa phịng thí nghiệm Sị xử thu nội tạng bảo quản nhiệt độ -20oC Thời gian bảo quản nội tạng sò ngắn tốt để tránh tượng enzyme bị biến tính Dung mơi chiết enzyme Đệm phosphat pH 7, đệm tris – HCl pH 7, nước muối sinh lý nước cất sử dụng làm dung mơi chiết enzyme Các hóa chất sử dụng sản xuất từ Trung Quốc Phương pháp nghiên cứu Phương pháp xử lý mẫu sò lụa Sò lụa tách bỏ phần vỏ thu phần thịt Sau tiếp tục tách lấy phần nội tạng từ phần thịt sò Phần nội tạng sị bổ sung KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Kết xác định ảnh hưởng điều kiện tách chiết đến hoạt độ protease từ sò lụa Hoạt độ protease thu phụ thuộc nhiều vào điều kiện tách chiết enzyme [5, 6, 8] Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định số điều kiện phù hợp để tách chiêt protease từ 97 Kỷ yếu Hội nghị khoa học nhiệt độ phù hợp để chiết enzyme protease từ sò lụa, tiến hành chiết mẫu sò lụa nhiệt độ khác từ 30oC÷50oC Kết nghiên cứucho thấy nhiệt độ chiết khác hoạt độ protease dịch chiết thu khác Hình Nhiệt độ chiết protease từ sị lụa có hoạt tính cao khoảng 35oC với hoạt độ thu 0,5654 UI/ml Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ chiết lên từ 40÷50oC hoạt độ protease thu giảm Điều nhiệt độ chiết lúc tác đơng bất lợi lên enzyme nên enzyme bị giảm hoạt tính Như vậy, nhiệt độ phù hợp để chiết protease từ sò lụa 50oC sò lụa như: loại tỷ lệ dung môi, nhiệt độ chiết thời gian chiết Ảnh hưởng loại tỷ lệ dung môi chiết Loại tỷ lệ dung môi chiết ảnh hưởng lớn đến hoạt độ enzyme thu Dung môi chiết ảnh hưởng đến trạng thái ion enzyme từ ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme Để xác định loại tỷ lệ dung mơi thích hợp chiết protease từ sò lụa, tiến hành chiết mẫu sò với dung môi nước cất, nước muối sinh lý, đệm phosphat pH đệm tris-HCl pH tỷ lệ mẫu chiết/dung môi 1/1, 1/2, 1/3, 1/4 1/5 0.600 Hoạt độ protease (UI/ml) 0.500 0.5654 Hoạt độ protease (UI/ml) 0.6 0.400 0.5 0.300 0.4696 0.415 0.4026 0.4 0.200 0.100 0.3465 0.3 0.000 nước cất Tỷ lệ 1/1 Tỷ lệ 1/4 Dung môi nước Đệm đệm tris muối sinh phosphat HCl lý Tỷ lệ 1/2 Tỷ lệ 1/3 Tỷ lệ 1/5 0.2 0.1 30 ͦ C Hình Ảnh hưởng loại tỷ lệ dung môi đến hoạt độ dịch chiết protease thu từ sò lụa Kết nghiên cứu cho thấy, loại tỷ lệ dung mơi chiết khác hoạt độ protease dịch chiết thu từ sò lụa khác Hình Tách chiết protease từ sị lụa đệm phosphat có hoạt độ cao so với chiết đệm Tris-HCl, nước muối sinh lý nước cất Hoạt độ cao enzyme protease từ sò lụa chiết đệm phosphat 0,499 UI/ml, chiết trisHCl 0,449 UI/ml, nước cất 0,207 UI/ml nước muối sinh lý 0,181UI/ml Điều mơi trường đệm phosphat enzyme protease từ sị lụa đạt trạng thái ion hóa tốt đệm tris-HCl, nước muối sinh lý nước cất nên enzyme thu có hoạt tính cao Như vậy, loại tỷ lệ dung môi phù hợp để tách chiết enzyme protease từ sò lụa đệm phosphat pH với tỷ lệ mẫu/dung môi 1/2 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết Nhiệt độ chiết enzyme ảnh hưởng đến trình chiết rút enzyme từ mẫu Để khảo sát 35ͦ C 40 ͦ C 45 ͦ C 50 ͦ C Nhiệt độ Hình Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt độ dịch chiết protease thu từ sò lụa Ảnh hưởng thời gian chiết Thời gian chiết ảnh hưởng đến lượng enzyme khuếch tán khỏi mẫu chiết từ ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme thu Tiến hành khảo sát thời gian chiết protease từ sò lụa khoảng thời gian khác từ 5÷25 phút Kết nghiên cứu cho thấy thời gian chiết khác hoạt độ protease dịch chiết thu khác Hình Thời gian chiết protease từ sị lụa có hoạt độ cao 10 phút hoạt độ thu 0,418 UI/ml Tuy nhiên, tiếp tục kéo dài thời gian chiết từ 15÷25 phút hoạt độ protease dịch chiết thu giảm Điều khoảng thời gian 10 phút lượng protease khuếch tán hết vào dịch chiết kéo dài thêm thời gian chiết lúc yếu tố bên tác động bất lợi đến protease nên làm giảm hoạt tính protease theo thời gian, từ hoạt độ protease dịch chiết thu giảm Như vậy, thời gian thích hợp để chiết protease từ sò lụa khoảng 10 phút 98 Kỷ yếu Hội nghị khoa học 0.418 0.45 Hoạt độ protease (UI/ml) 0.4 (X3) biến tương tác nhiệt độ chiết tỷ lệ dung môi chiết (X1X2) Ngược lại, hoạt độ protease thu tỷ lệ nghịch với nhiệt độ chiết (X1), biến tương tác nhiệt độ thời gian chiết (X1X3), biến tương nhiệt độ chiết bình phương (X12) biến tương tác thời gian chiết bình phương (X32) Trong số biến, ảnh hưởng biến nhiệt độ chiết với hệ số tương ứng 0,14 lớn nhất; ảnh hưởng biến bình phương nhiệt độ bình phương thời gian chiết với hệ số tương ứng 0,11 0,077 Bảng Kết thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện thu nhận protease từ sị lụa Nhiệt Tỷ lệ Thời Hoạt độ STT độ (Photphat/ gian protease (0C) mẫu) (phút) (UI/ml) 30 1.5 10 0702 0.392 0.355 0.325 0.35 0.287 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 Thời gian (phút) 10 15 20 25 Hình Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt độ dịch chiết protease thu từ sò lụa Kết tối ưu hóa điều kiện chiết enzyme protease từ sị lụa Từ kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết protease từ sị lụa đưa miền giá trị cho thí nghiệm tối ưu hóa yếu tố trình bày Bảng Bảng Miền nghiên cứu tối ưu hóa yếu tố chiết enzyme protease protease từ sị lụa Mã hóa Biến mức Biến nghiên cứu mã -1 Nhiệt độ (oC) X1 30 35 40 Tỷ lệ dung X2 1,5 2,0 2,5 môi/mẫu Thời gian (phút) X3 10 15 Kết thí nghiệm tối ưu điều kiện tách chiết protease từ sị lụa trình bày Bảng phân tích phần mềm DX10 Kết phân tích xác định phương trình hồi quy biểu diễn mối quan hệ hoạt độ protease từ sị lụa yếu tố tách chiết có dạng bậc Kết phân tích cho thấy mơ hình thu có ý nghĩa có tính phù hợp cao Các yếu tố gồm A, B, C, biến tương tác AB, AC, A2 C2 có ý nghĩa mơ hình tối ưu Phương trình hồi quy thể mối quan hệ hoạt độ protease từ sò lụa yếu tố tách chiết sau : Y^ = 0,67 - 0,14X1 + 0,02X2 + 0.073X3 + 0,038X1X2 – 0,057X1X3 – 0,11X12 – 0,077X32 (1) Trong Y^ hoạt độ protease dự đốn A, B, C, X1,X2,X3 giá trị thực giá trị mã hóa nhiệt độ chiết, tỷ lệ dung môi chiết thời gian chiết Dựa vào hệ số từ phương trình cho thấy hoạt độ protease thu từ sò lụa tỷ lệ thuận với tỷ lệ dung môi chiết (X2), thời gian chiết 99 40 1.5 10 0,356 30 2.5 10 0,648 40 2.5 10 0,454 30 0,486 40 0,324 30 15 0,756 40 15 0,368 35 1.5 0,454 10 35 2.5 0,562 11 35 1.5 15 0,638 12 35 2.5 15 0,648 13 35 10 0,67 14 35 10 0,648 15 35 10 0,702 Kỷ yếu Hội nghị khoa học nhân kết tủa 1/1 1/2 , 1/3 1/4 Hoạt độ protease (UI/ml) 0.500 0.404 0.300 0.290 0.294 0.251 0.240 0.341 0.254 0.279 0.171 0.200 0.124 0.100 0.053 0.000 Aceton 1/2 1/1 Ethanol Amonium sulfat Tác nhân tủa Hình Ảnh hưởng tác nhân kết tủa nồng độ tác nhân kết tủa đến hoạt độ CPE gelatinase thu Kết khảo sát cho thấy loại dung môi kết tủa với nồng độ kết tủa khác CPE protease thu từ sị lụa khác Hình Khi kết tủa protease aceton thu CPE có hoạt độ cao tủa ethanol amonium sulfat Hoạt độ CPE protease thu cao tủa aceton 0,404 UI/ml tỷ lệ 1/2 giữ hoạt độ tương đối so với trước kết tủa 75% Trong sử dụng ethanol amonium sulfat hoạt độ cao CPE protease thu chiết tỷ lệ 1/3 0,364 UI/ml, 0,341 UI/ml hoạt độ tương đối lại 67,41% 63,15% Khi kết tủa dịch enzyme amonium sulfat emzyme có hoạt độ thấp muối cịn lẫn nhiều CPE từ ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme thu Đối với ethanol khó bay aceton nên có thời gian tiếp xúc với CPE dài aceton nên làm giảm hoạt độ enzyme nhiều Như vậy, aceton tác nhân phù hợp để kết tủa protease với tỉ lệ enzyme/dung môi 1/2 để thu CPE protease 0.500 hoạt độ protease (UI/ml) Hình Biểu đồ 3D mô tả tương tác của yếu tố đến hoạt độ protase từ sò lụa Ảnh hưởng độc lập yếu tố tách chiết đến hoạt độ protease thu từ sò lụa thể qua đồ thị không ba chiều Hình Vùng giá trị hoạt độ dự đốn tối ưu xác định bề mặt giới hạn hình elip nhỏ sơ đồ đường đồng mức Chế độ chiết tối ưu protease từ sò lụa đề xuất từ phần mềm DX10 nhiệt độ chiết 31°C, tỷ dung môi chiết/mẫu 1,8 thời gian chiết 13 phút với hoạt độ protease thu 0.76 UI/ml Kết xác định ảnh hưởng điều kiện thu nhận chế phẩm protease kỹ thuật từ sò lụa phương pháp kết tủa Điều kiện kết tủa enzyme ảnh hưởng hoạt tính CPE thu Theo nhiều nghiên cứu tác nhân kết tủa, nồng độ kết tủa thời gian kết tủa yếu tố có ảnh hưởng lớn đến CPE thu [1, 9, 12] Kết xác định ảnh hưởng tác nhân nồng độ kết tủa đến hoạt tính chế phẩm protease từ sị lụa Mỗi enzyme có loại tác nhân kết tủa thích hợp nồng độ định, CPE thu có hoạt tính cao Tiến hành kết tủa dịch protease thô với tác nhân là: aceton 96%, Amonium sulfat bảo hòa ethanol tuyệt đối Mỗi tác nhân thực tủa enzyme với tỷ lệ dịch enzyme/tác 0.364 0.400 0.431 0.379 0.400 0.300 0.311 0.303 0.219 0.200 0.100 0.000 10 Thời gian kết tủa (h) 15 20 25 Hình Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hoạt độ CPE protease thu Kết xác định ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hoạt tính chế phẩm protease 100 Kỷ yếu Hội nghị khoa học Hoạt độ protease (UI/ml) hợp để thủy phân thịt cá CPE protease từ sò lùa 55oC 0.450 0.3890.404 0.400 0.340 0.350 0.302 0.283 0.268 0.300 0.250 0.182 0.200 0.141 0.121 0.150 0.100 0.050 Nhiệt độ (oC) 0.000 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính protease từ sò lụa Kết xác định pH ban đầu thủy phân thịt cá thích hợp chế phẩm protease từ sị lụa Độ pH mơi trường có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng enzyme, enzyme hoạt động tốt trị số pH xác định gọi pH hoạt động tối thích enzyme Tùy thuộc vào chất enzyme mà pH enzyme hoạt động thích hợp để enzyme hoạt động trung tính, kiềm acid [2] Để xác định pH thích hợp để thủy phân thịt cá CPE protease từ sò lụa, thực phản ứng CPE protease với thịt cá điều kiện pH ban đầu khác từ 4÷9 Hoạt độ protease (UI/ml) từ sị lụa Thời gian kết tủa dài hay ngắn ảnh hưởng đến hoạt tính lượng CPE thu Do đó, trình kết tủa enzyme cần nghiên cứu thời gian kết tủa để thu CPE protease có hoạt độ cao Tiến hành kết tủa dịch protease thơ từ sị lụa khoảng thời gian khác từ 5÷20 phút Kết thí nghiệm cho thấy, thời gian kết tủa có ảnh hưởng đến hoạt tính CPE protease thu từ sị lụa Hình Thời gian kết tủa thu CPE protease có hoạt độ cao 15 phút với hoạt độ thu 0,431 UI/ml Như vậy, sau 15 phút lượng enzyme protease kết tủa nhiều nên hoạt tính CPE thu đạt cực đại Do đó, tiếp tục kéo dài thời gian kết tủa 20, 25 phút hoạt độ CPE protease thu giảm Điều thời gian tiếp xúc enzyme với tác nhân tủa kéo dài nên làm biến tính dần CPE nên giảm hoạt tính Như vậy, thời gian kết tủa protease từ sị lụa aceton thích hợp 15 phút Kết xác định điều kiện thủy phân thịt cá chế phẩm protease thu từ sị lụa Hoạt động xúc tác enzyme phụ thuộc vào điều kiện phản ứng nhiệt độ, pH mơi trường, đặc tính chất, … [2, 5, 13] Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định số điều kiện hoạt động thích hợp CPE protease từ sò lụa như: nhiệt độ, pH, nồng độ chất… để thủy phân thịt cá Kết xác định nhiệt độ thủy phân thịt cá thích hợp chế phẩm protease từ sò lụa Nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính xúc tác enzyme, enzyme có nhiệt độ phản ứng thích hợp Để xác định nhiệt độ thủy phân thịt cá thích hợp, thực phản ứng thủy phân thịt cá CPE protease nhiệt độ khác từ 30÷70oC Kết thí nghiệm cho thấy, nhiệt độ thủy phân khác khả thủy phân thịt cá CPE protease từ sò lụa khác Hình Trong dãy nhiệt độ khảo sát thủy phân thịt cá 55oC CPE protease đạt khả thủy phân lớn Khi tiếp tục tăng nhiệt độ thủy phân lên từ 60÷70oC hoạt tính protease giảm xuống Điều nhiệt độ từ 60÷70oC protease dần bị biến tính biến tính mạnh 70oC, từ làm giảm hoạt tính protease Như vậy, nhiệt độ thích 0.5 0.365 0.4 0.3 0.202 0.387 0.3228 0.242 0.211 0.2 0.178 0.084 0.1 4,0 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 0.047 pH ban đầu 8,0 9,0 Hình Ảnh hưởng pH phản ứng đến hoạt tính protease từ sị lụa Kết thí nghiệm cho thấy, pH thủy phân khác khả thủy phân thịt cá CPE protease từ sị lụa khác Hình Trong dãy pH khảo sát thủy phân thịt cá pH 6,0 CPE protease đạt khả thủy phân cao Điều này, pH 6,0 enzyme chất trạng thái ion hóa thích hợp cho kết hợp với enzyme đạt hoạt độ xúc tác lớn Khi tiếp tục tăng pH thủy phân thịt cá lên khả thủy phân CPE protease từ sò lụa giảm Ở giá trị pH vùng pH tối ưu, hoạt độ protease giảm 101 Kỷ yếu Hội nghị khoa học 2.5172.5822.5042.558 Hàm lượng tyrosin (µM/ml) 2.5 2.033 1.593 1.5 0.861 0.536 0.5 0 0.5 1.5 Nồng độ enzyme/thịt cá (UI/g) Hình Ảnh hưởng nồng độ CPE protease đến khả thủy phân thịt cá Kết đánh giá mức độ thủy phân thịt cá chế phẩm enzyme protease thu từ sò lụa Việc nghiên cứu thử nghiệm khả thủy phân enzyme cần thiết cho việc ứng dụng hiệu sau Mức độ thủy phân thông số đánh giá hiệu thủy phân chất enzyme Mức độ thủy phân xác định tỷ lệ đạm acid amin hàm lượng đạm tổng số Để xác định mức độ thủy phân thịt cá CPE protease từ sò lụa, tiến hành thủy phân hỗn hợp thịt cá CPE điều kiện thích hợp theo thời gian Kết nghiên cứu trình bày Hình 10 Bảng Kết cho thấy, khoảng thời gian từ 0-4 thủy phân, hàm lượng acid amin tạo thành nhanh từ 0÷2,225 mg/ml tương đương mức độ thủy phân 30,77% Khi tiếp tục kéo dài thêm thời gian thủy phân lên 5÷6giờ hàm lượng acid amin tăng chậm từ 2,414-2,438 mg/ml tương ứng với mức độ thủy phân 33,38% ÷ 33,71% Có thể thấy gia tăng hàm lượng acid amin lúc khơng đáng kể kết thúc phản ứng thủy phân thời điểm 4÷5 Hàm lượng đạm acid amin khơng tăng enzyme lúc hoạt tính xúc tác Như vậy, mức độ thủy phân thịt cá CPE protease từ sò lụa đạt khoảng 33% thời khoảng 4÷5 Bước đầu ứng dụng enzyme kết hợp với tác nhân thủy phân khác để đạt hiệu thủy phân cao 3.000 hàm lượng đạm amin (mg/ml) nguyên nhân sau: trạng thái ion hóa enzyme chất thấp, mức độ kết hợp enzyme chất thấp; pH cao hay thấp làm biến tính enzyme nên giảm hoạt độ xúc tác enzyme Như vậy, pH thủy phân thịt cá thích hợp CPE protease 6,0 Kết xác định nồng độ chế phẩm enzyme protease thích hợp để thủy phân thịt cá Việc nghiên cứu nồng độ enzyme/cơ chất giúp thực phản ứng thủy phân enzyme cách nhanh với lượng enzyme phù hợp không thừa hay thiếu Để xác định nồng độ CPE protease thủy phân thịt cá thích hợp, tiến hành thủy phân hỗn hợp thịt cá chế phẩm protease với tỷ lệ hoạt độ CPE protease/thịt cá (UI/g) tăng dần từ 0,2 UI/g ÷1,6 UI/g với bước nhay 0,2 UI Kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ CPE protease ảnh hưởng đến hiệu thủy phân thịt cá dựa vào lượng tyrosin hình thành Hình Trong dãy nồng độ khảo sát nồng độ CPE protease 1UI/g thịt cá phù hợp lúc kết hợp enzyme chất cực đại Khi tiếp tục tăng nồng độ CPE protease hiệu thủy phân khơng tăng Điều lượng chất kết hợp hết với lượng enzyme cho vào nên tăng nồng độ enzyme khơng tăng lượng tyrosin hình thành Do đó, chọn nồng độ enzyme protease để thủy phân mẫu thịt cá 1,0 UI/g thịt cá 2.225 2.500 2.414 2.438 2.000 1.373 1.500 1.000 0.994 0.663 0.500 0.000 Thời gian thủy phân (h) Hình 10 Sự thay đổi hàm lượng đạm acid amin theo thời gian thủy phân hỗn hợp thịt cá CPE protease từ sò lụa Bảng Sự thay đổi hàm lượng đạm acid amin theo thời gian hiệu thủy phân hỗn hợp thịt cá CPE protease từ sò lụa Hàm Hàm Thời lượng Mức độ gian lượng đạm thủy thủy đạm acid phân phân tổng số (%) amin (mg/ml) (h) (mg/ml) 0,663 9,16 5,231 0,994 13,75 1,373 18,98 2,225 30,77 2,414 33,38 2,438 33,71 102 Kỷ yếu Hội nghị khoa học KẾT LUẬN Kết nghiên cứu cho phép đến số kết luận sau: So với sị lơng sị điệp sị lụa có chứa hệ protease có hoạt tính cao - Điều kiện tối ưu để chiết protease từ sò lụa là: dung môi chiết đệm phosphat pH = với tỷ lệ dung môi/mẫu 1,8; nhiệt độ chiết 31oC thời gian chiết 13 phút - Điều kiện kết tủa thích hợp để thu hồi CPE protease aceton 96% với tỷ lệ dịch enzyme/dịch aceton 1/2 thời gian 15 phút - Điều kiện hoạt động xúc tác phản ứng thủy phân thịt cá thích hợp CPE protease từ sị lụa là: nhiệt độ thích hợp 55oC, pH thích hợp 6,0 thời gian thủy phân thích hợp 5h - Mức độ thủy phân thịt cá CPE protease thu từ sò lụa là 33,4% TÀI LIỆU THAM KHẢO Adinarayana K, Ellaiah P, Prasad D S - Purification and partial characterization of thermostable serine alkaline protease from a newly isolated Bacillus subtilis PE-11, AAPS Pharm Sci Tech 2003, Article 56 (2003) 9p Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến - Công nghệ enzyme, NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh, 1998 Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng - Nguyên liệu chế biến thủy sản, tập 1, NXB Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh, 2006 Nguyễn Lệ Hà - Một số enzyme từ động vật thủy sản, Tạp chí khoa học – Cơng nghệ thủy sản, Số 3/2013, Trang 183-189 Lâm Tuyết Hận – Nghiên cứu thu chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá chẽm (Lates calcarifer) ứng dụng sản xuất bột cá thực phẩm, Luận văn thạc sĩ kỹ thuật, trường Đại học Nha Trang , 2009 Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn - Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá basa (pangasius bocourti), Tạp chí phát triển Khoa học Công nghệ, tập 9, số11/2006, trang 59-67 Nguyễn Quang Hùng - Đa dạng sinh học nguồn lợi động vật thâm mềm hai mảnh vỏ (Bivalvia) vùng biển Cát Bà Cô Tô, Viện nghiên cứu hải sản - Tuyển tập cơng trình nghiên cứu nghề cá Biển (tập III), NXB Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh, 2005 Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Lệ Hà - Sản xuất chế phẩm kỹ thuật y dược từ phế liệu thủy sản, NXB Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh, 2016 Roe S - Protein purification techniques, Oxford University press (2001) 262p Sriket, C - Proteases in fish and shellfish: Role on muscle softening and prevention, International Food Research Journal 21 (2014), 433-445 Lê Ngọc Tú, La Văn Chư, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thắng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Dững, Lê Đồn Diên - Hóa sinh học cơng nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Thangam E B and Rajkumar G S - Purification and characterization of alkaline protease from Alcaligenes faecalis, Biochem 35 (2002), pp149-154 Wisuthiphaet, N, Klinchan, Kongruang, S - Fish protein hydrolysate production by acid and enzymatic hydrolysis, KMUTNB Int J Appl technol, vol 9, no (2016), pp 261-270 103 ... Ảnh hưởng nồng độ CPE protease đến khả thủy phân thịt cá Kết đánh giá mức độ thủy phân thịt cá chế phẩm enzyme protease thu từ sò lụa Việc nghiên cứu thử nghiệm khả thủy phân enzyme cần thiết cho... chiết protease thu từ sò lụa Kết tối ưu hóa điều kiện chiết enzyme protease từ sò lụa Từ kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết protease từ sị lụa đưa miền giá trị cho thí nghiệm tối ưu hóa... protease từ sị lụa Kết thí nghiệm cho thấy, pH thủy phân khác khả thủy phân thịt cá CPE protease từ sị lụa khác Hình Trong dãy pH khảo sát thủy phân thịt cá pH 6,0 CPE protease đạt khả thủy phân