tóm tắt Nghiên cứu tối ưu qui trình tách AND hệ gen từ xương lâu năm ứng dụng trong nhận dạng cá thể người

Tài liệu là bản tóm tắt

Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUI TRÌNH TÁCH ADN HỆ GEN TỪ XƯƠNG LÂU NĂM ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƯỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUI TRÌNH TÁCH ADN HỆ GEN TỪ XƯƠNG LÂU NĂM ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƯỜI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội - 2017 Footer Page of 126 Header Page of 126 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan kết thể luận văn công trình nghiên cứu thực tế Toàn số liệu, kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, khách quan, chưa công bố công khai khác Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân –Chủ nhiệm Bộ môn Di truyền học trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình suốt thời gian thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học Tài liệu nghiệp vụ - Tổng cục IV – Bộ công an ủng hộ tạo điều kiện thuận lợi cho trình hoàn thành luận vặn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học lãnh đạo Khoa giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn tới toàn cán phòng Kỹ thuật Sinh học nghiệp vụ - Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học Tài liệu nghiệp vụ - Tổng cục IV – Bộ công an, gia đình, người thân bạn bè bên tôi, quan tâm động viên tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 06 tháng 01 năm 2017 Học viên Trần Thị Hạnh Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………………………… CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN …………………………………………………… 1.1 Các phương pháp nhận dạng cá thể người 1.1.1 Phương pháp hình thái học……………………………………………… 1.1.2 Phương pháp phân tích thị phân tử……………………………… 1.1.3 Một số thị ADN ứng dụng nhận dạng cá thể………………… 1.1.3.1 Các locus STR…………………………………………………………… 1.1.3.2 Mini-STRs………………………………………………………………… 1.1.3.3 Vùng siêu biến HV1 HV2 ADN ti thể………………………… 10 1.1.3.4 Đa hình đơn nucleotide (SNPs)………………………………………… 11 1.2 Các nguồn ADN sử dụng phân tích mẫu hài cốt 12 1.2.1 Xương…………………………………………………………………… 12 1.2.1.1 Cấu trúc xương………………………………………………………… 12 1.2.1.2 Sự tồn ADN xương ……………………………………… 14 1.2.2 Răng 14 1.2.2.1 Cấu trúc 14 1.2.2.2 Vị trí ADN 15 1.2.3 Sự tồn khả thu ADN phận khác mẫu hài cốt……………………………………………………………… 17 1.3 Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm giới… 19 1.4 Tình hình nghiên cứu Việt Nam………………………………… 23 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 25 2.1 Nguyên liệu………………………………………………………… 25 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………… 25 Footer Page of 126 Header Page of 126 2.1.2 Hóa chất………………………………………………………………… 25 2.1.3 Thiết bị dụng cụ…………………………………………………………… 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu………………………………………………… 27 2.2.1 Phương pháp lựa chọn mẫu ……………………………………………… 27 2.2.2 Phương pháp thu mẫu, bảo quản mẫu bố trí khu vực thí nghiệm sau thu mẫu 28 2.2.3 Xử lý mẫu – Loại canxi…………………………………………………… 29 2.2.4 Tách chiết ADN từ xương phương pháp hữu (Phenol/ Chloroform/ Isoamyl alcohol: PCI) 30 2.2.5 Tách chiết ADN từ xương KIT QIAmp DNA Investigator (QiAgen) 2.2.6 Tách chiết ADN từ xương KIT DNA 31 IQTM System (Promega) 32 2.2.7 Định lượng ADN 33 2.2.8 PCR nhân bội sản phẩm 33 2.2.9 Điện di đọc kết máy điện di mao quản……………………… 34 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN….………………………………… 36 3.1 Kết nghiên cứu tối ưu bước xử lý mẫu ban đầu loại canxi……… 36 3.2 Kết thử nghiệm, lựa chọn phương pháp tách chiết tối ưu điều kiện phòng thí nghiệm ……………………………………… 38 3.2.1 Kết phân tích, xác định kiểu gen…………………………………………… 38 3.3.2 Kết đánh giá, lựa chọn phương pháp tách chiết………………………… 39 3.3 Kết tối ưu quy trình tách chiết, phân tích ADN nhân từ xương lâu năm……………………………………………………………………………… 40 3.4 Kết phân tích ADN nhân mẫu xương theo quy trình xây dựng……………………………………………………………………………… 46 3.5 Thảo luận chung ………………………………………………………… 50 Footer Page of 126 Header Page of 126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………… 53 Kết luận…………………………………………………………………………… 53 Kiến nghị………………………………………………………………………… 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………… 54 PHỤ LỤC……………………………………………………………………… Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT -ADN :Deoxyribonucleic Acid -ATP :Adenosine Triphosphate -Bp :Base pair -CODIS :Combined ADN Index System (Hệ thống số ADN kết hợp (Mỹ) -CSDL :Cơ sở liệu -dNTP :Deoxyribonucleotide triphosphate -EDTA :Ethylendiamin Disodium Tetraacetic Acid -FBI: :Federal Bureau of Investigation (Cục điều tra Liên Bang Mỹ) -HA :Hydroxyl Apatite (Tinh thể hydroxyapatít) -INV :QiAmp DNA Investigator -IQS :DNA IQTM System -NST :Chromosome (Nhiễm sắc thể) -mtADN :Mitochondrial DNA (ADN ti thể) -nADN :Nuclear DNA (ADN nhân) -qADN :DNA Quantification (Định lượng ADN) -OD :Optical Density (Mật độ quang học) -PCR :Polymerase Chain Reaction -PD :Power of discrimination (Khả phân biệt) -PCI :Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol -PTN :Phòng thí nghiệm -RFLP :Restriction fragment length polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) -SDS :Sodium Dodecyl Sulfate -STR :Short Tandem Repeat (Đoạn lặp đa hình ngắn) -SNP :Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide) Footer Page of 126 Header Page of 126 -Taq :Thermus aquaticus -TBE :Tris Boric EDTA -TE :Tris EDTA -Tm :Temperature melting (Nhiệt độ nóng chảy) -UV :Ultra Violet (Tia cực tím) -VNTR :Variable Number of Tandem Repeat (Đoạn lặp có độ dài trung bình) Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ minh hoạ khả di truyền số alen thuộc locus STR từ bố, mẹ cho theo định luật Mendel Hình 1.2 Hình minh họa vị trí thiết kế mồi Mini-STR mồi multiplex Mini-STR Hình 1.3 Hình ảnh chụp hiển vi 03 loại tế bào xương 13 Hình 1.4 Cấu trúc điển hình người 15 Hình 1.6 Lớp tế bào odontoblast xếp thành lớp bề mặt khoang tủy ống tủy, nơi có trình biệt hóa hình thành lớp phức hợp ngà-tủy Hình 1.6 16 Sơ đồ khu vực mẫu xương mức độ thành công phân tích ADN tương ứng 21 Hình 2.1 Sơ đồ bước nghiên cứu đề tài luận văn 35 Hình 2.2 Sơ đồ bước nghiên cứu đề tài luận văn 37 Hình 3.1 Kết so sánh số mẫu tách theo kit IQS nhà sản xuất theo quy trình cải tiến Hình 3.1 Sơ đồ mô tả qui trình tổng quát tách chiết, phân tích ADN từ xương lâu năm Footer Page 10 of 126 44 45 Chuyên ngành Di truyền học Header Page 27 of 126 Luận văn Thạc sĩ [13] Ở lớp cementum nguồn cung cấp nADN nằm tế bào cementoblast cementocytes Chúng có cấu trúc chức tương tự các tế bào tạo cốt bào cốt bào mô xương Cũng tương tự trình tạo xương, tạo thành lớp cementum trình canxi hóa cementocytes, phân tử ADN cementocytes bảo quản lâu dài tinh thể khoáng Sự tồn mtADN phần chân lại giải thích trình biệt hóa tế bào odontoblast (tế bào thần kinh mào gốc phân bố bề mặt tủy răng) trình hình thành ngà (dentinogenesis) lớp men cementum xảy chân (hình 1.6) Ngà bao gồm ống liên kết chặt chẽ, phần chân nơi diễn biệt hóa mạnh mẽ ống có chứa tế bào ondotoblast ti thể sợi thần kinh phong phú Sau chết, trình phân hủy mtADN ty thể có khả bị mắc kẹt lại ống ngà bảo vệ ma trận khoáng cementum [13] Odontoblast Men Buồng tủy Ngà Phức hợp Ngà - Tủy Cementum Hình 1.5: Lớp tế bào odontoblast (mũi tên) xếp thành lớp bề mặt khoang tủy ống tủy, nơi có trình biệt hóa hình thành lớp phức hợp ngà-tủy Điều cho thấy mtADN nADN rõ ràng không phân bố khắp mô Các phương pháp tách chiết ADN từ thường nghiền toàn thành bột để tiếp cận phần tủy ngà răng, có phương pháp ngâm đệm phân hủy qua đêm để loại bỏ lớp men bao Thực tế thí nghiệm với lâu năm cho thấy lượng ADN thu tốt từ mẫu bột nghiền, nhiên phương pháp đồng thời gia tăng đáng kể lượng chất ức chế PCR khuôn ADN sau tách chiết Vấn đề khắc phục Footer Page 27 of 126 Trần Thị Hạnh 16 Khóa học 2014-2016 Chuyên ngành Di truyền học Header Page 28 of 126 Luận văn Thạc sĩ cách lấy mẫu phần mà cung cấp ADN phong phú, đủ chất lượng cho mục đích phân tích di truyền 1.2.3 Sự tồn khả thu ADN phận khác mẫu hài cốt Các liệu thực nghiệm cho thấy, trường hợp có thể, việc lựa chọn mẫu thí nghiệm cẩn thận giảm bớt số lần lặp lại thí nghiệm, tiết kiệm thời gian công sức Từ năm 1994 đến 2004, phòng thí nghiệm AFDIL (Armed Forces DNA Identification Laboratory - USA) xử lý 2000 mẫu xương cổ có nguồn gốc từ chiến II, chiến tranh Triều Tiên chiến tranh Việt Nam Nghiên cứu cho thấy xương chịu lực (có cấu trúc xương đặc) xương đùi, xương chày loại mẫu cung cấp lượng ADN tốt Xương bàn chân, xương chịu lực cấu tạo từ xương nhỏ, dễ bị phân mảnh khó thu đủ mảnh xương có khối lượng mẫu cần thiết, với mẫu xương tỉ lệ thành công lớn, khoảng 80% thí nghiệm cho kết phân tích tốt Xương sườn cho kết phân tích thành công, khó để thu mẫu hoàn chỉnh Các mẫu xương sọ, xương đốt sống mẫu cho kết (do cấu trúc xốp, dễ bị tác động xấu yếu tố môi trường) Hình 1.6 mô tả khu vực mẫu xương kết phân tích di truyền thành công tương ứng Footer Page 28 of 126 Trần Thị Hạnh 17 Khóa học 2014-2016 Chuyên ngành Di truyền học Header Page 29 of 126 Luận văn Thạc sĩ Hình 1.6: Sơ đồ khu vực mẫu xương mức độ thành công phân tích ADN tương ứng [15] Nhìn chung, xương có phần vỏ xương dày đặc (xương dài) nên mẫu ưu tiên thu mẫu, có lẽ phần xương có lớp ma trận khoáng protein dày đặc nên phần ADN bảo quản tốt so với phần xương xốp Ngoài mẫu xương dài, mẫu nhờ cấu trúc cứng, đặc biệt mẫu tốt cho phân tích ADN Mặc dù mẫu hàm dễ thu mẫu xương dài có số đối tượng mà sử dụng cho xét nghiệm ADN, ví dụ trường hợp đối tượng cần giám định thuộc độ tuổi nhi đồng thiếu niên Đã có Footer Page 29 of 126 Trần Thị Hạnh 18 Khóa học 2014-2016 Chuyên ngành Di truyền học Header Page 30 of 126 Luận văn Thạc sĩ nghiên cứu cho thấy tuổi chết hài cốt lâu năm có ảnh hưởng đến lượng nADN thu từ răng, nguyên nhân trưởng thành có nhiều khoáng, xốp đồng thời lỗ tủy chân hẹp người trẻ tuổi [13], người trưởng thành có khả chống lại xâm nhập độ ẩm, vi khuẩn qua bề mặt lỗ chân răng, giảm ảnh hưởng tiêu cực môi trường lên suy thoái ADN bên 1.3 Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm giới Mọi nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử bắt đầu việc thu nhận lượng nucleic acid đủ lớn đủ tinh để tiến hành thí nghiệm Thu nhận hồ sơ ADN (cả mtADN nADN) từ xương thường gặp nhiều khó khăn nguồn ADN tách chiết thường bị thoái hóa mạnh, số lượng diện nhiều chất ức chế PCR Một phương pháp tách chiết ADN từ xương tối ưu đồng thời phục hồi lượng ADN lớn loại bỏ tốt yếu tố ức chế PCR Các qui trình tách chiết ADN lại từ xương khác nhau, có hai phương pháp thông thường thường sử dụng gồm có: tách hữu (sử dụng phenol/chloroform) tách vô (silica hạt từ) Phương pháp hữu có hiệu việc loại bỏ protein chất béo từ dịch chiết ADN, nhiên lại không hiệu việc loại bỏ chất ức chế PCR acid humic đồng thời tốn thời gian, thao tác phức tạp dung môi sử dụng độc hại Vì vậy, nhiều nhóm nghiên cứu hãng thương mại nỗ lực phát triển phương pháp khai thác vô Đa số phương pháp sử dụng khả hấp thụ thuận nghịch silica hạt lõi từ phân tử ADN dựa nồng độ muối Từ lâu, tách chiết ADN từ xương lâu năm nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu Bảng 1.1 trình bày tổng hợp qui trình tách chiết ADN từ xương lâu năm xương cổ đại công bố Footer Page 30 of 126 Trần Thị Hạnh 19 Khóa học 2014-2016 Chuyên ngành Di truyền học Header Page 31 of 126 Luận văn Thạc sĩ Bảng 1.1: Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm công bố giới Tác giả Mẫu hài cốt Các mẫu hài cốt Kurosaki người cộng lấy Nhật (1993) Bản, từ [28] kỉ đến kỉ Cattaneo cộng (1995) [11] Xương người Hài cốt người chết từ 3-9 tháng Yang cộng (1998) [52] Hài cốt người chết từ 155000 năm Kalmár cộng (2000) [22] Các mẫu hài cốt nghĩa trang Hungary, từ kỷ 7thế kỷ 15 Loreille cộng (2007) [30] Các mẫu hài cốt người chết từ 14- Footer Page 31 of 126 Trần Thị Hạnh Phương pháp tách chiết ADN Chỉ thị phân tử Kết Thu kiểu gen ShortVNTR cá thể Trình tự Khi nhân bội ADN từ lặp lại xương thất bại kiểu ngắn gen xác định (Shortbằng cách lấy từ VNTR) lấy thêm xương Không nhân bội đuợc số xương dùng Kết tủa protein muối phenol/chloroform để sodium acetate, tủa ADN tách chiết tủa ADN Nhân bội isopropanol ethanol nADN Dùng Phenol/chloroform để tách Nhân bội thành công chiết, tủa ADN ethanol tủa protein muối sodium acetate tủa ADN isopropanol Nhân bội tách Dùng EDTA để loại khoáng có chiết xương, tách chiết phenol/chloroform, cột phenol/chloroform, sử dụng cột cô mẫu, cột silica để tinh để cô mẫu Sử dụng EDTA loại khoáng PCR bị ức chế không xương, tách chiết Nhân bội sử dụng cột silica cho phenol/chloroform, cột cô mẫu, nADN việc tách chiết xương cột silica để tinh phenol/chloroform Loại khoáng xương Nhân bội dung EDTA, dung dịch phân giải dịch phân giải proteinase proteinase K cho trực tiếp K thêm vào cột cô vào cột cô mẫu và/ cột silica mẫu và/ cột silica Thu trình tự hoàn Dùng sodium acetate ethanol thiện ADN ty thể để tủa ADN từ dịch dịch sử dụng sodium phân giải bột xương Giải trình acetate/ethanol để tủa Dùng EDTA loại khoáng tự ADN xương, tách chiết mtADN Không nhân bội phenol/chloroform, tủa ADN tách chiết isopropanol phenol/chloroform tủa isopropanol Tách chiết Chạy Từ mẫu hài cốt bị phenol/chloroform, cột cô mẫu qPCR đối mủn, chất lượng EDTA dùng để hòa tan hoàn toàn với ADN hòa tan hoàn toàn bột bột xương, ty thể xương giúp cho ADN Sử dụng EDTA để loại khoáng có xương Tách chiết phenol/chloroform/isoamyl alcohol, ethanol dùng để tủa ADN Tinh cột silica 20 Khóa học 2014-2016 Chuyên ngành Di truyền học Header Page 32 of 126 100 năm Nelson Melton 2007 [33] Các mẫu hài cốt (các trường hợp xác định danh tính pháp y trường hợp lịch sử) Các mẫu hài cốt Rohland hang gấu, kỉ Hofreiter Pleistocene (2007) ( cách [42] 20.000 năm) Kim cộng (2008) [25] Mẫu hài cốt người mà trước nhân bội ADN bị thất bại, mẫu có tuổi từ 5003300 năm Coticone cộng (2010) [12] Các mẫu xương lợn Các mẫu xương người Footer Page 32 of 126 Trần Thị Hạnh Luận văn Thạc sĩ phenol/chloroform/isoamyl alcohol dùng cho tách chiết, cột cô mẫu Tách chiết silica Dùng EDTA loại khoáng xương, tách chiết phenol/chloroform, cột cô mẫu Tách chiết Kit silica Tách chiết dựa vào Kit hạt từ silica Dùng EDTA loại khoáng xương, tách chiết silica; tối ưu hóa phương pháp Loại khoáng EDTA, silica dùng để tách chiết Loại khoáng EDTA, silica dùng để tách chiết, cột trao đổi ion, cột cô mẫu Xử lý mẫu siêu âm, sodium chloride để tủa protein, ethanol tủa ADN, tinh hạt silica 21 Nhân bội STR thu hồi tăng lên đáng kể số lượng allen thu STR tăng lên 83% trường hợp thu phần trình tự ADN ty thể Thất bại tách chiết Giải trình ADN từ xương bị tự ADN cháy ty thể Những trường hợp lịch sử có khả cho trình tự ADN ty thể đầy đủ Không có khác biệt đáng kể lượng ADN thu phương pháp có khả thu hồi ADN cao (kit dựa hạt silica có từ tính) phương pháp khác Chạy Tối ưu hóa loại khoáng/ qPCR đối tách chiết silica làm với ADN tăng chất lượng ADN lên ty thể gấp lần Bổ sung thêm chất tẩy rửa không cải thiện chất lượng ADN Bổ sung EDTA protein K làm tăng chất lượng ADN Đa số xương nhân bội thành công ADN ty Nhân bội thể, xương ADN ty nhân bội locus giới thể tính sử dụng silica Nhân bội tách chiết nADN ( Khi tách chiết với silica locus giới cột trao đổi ion tất tính) xương nhân bội thành công ADN ty thể locus giới tính Nhân bội Tách chiết ADN thành STR công sử dụng song (người) siêu âm để xử lý mẫu Nhân bội Lên đầy đủ NADN locus mẫu xương người Khóa học 2014-2016 Chuyên ngành Di truyền học Header Page 33 of 126 Luận văn Thạc sĩ STR (lợn) Lee cộng (2010) [19] Sylvain Amory cộng (2012) [46] Các hài cốt người từ chiến tranh Hàn Quốc Khai quật hài cốt người chết từ năm 1992 đến 1999 Khôi phục lại hài cốt Dukes người không nhận cộng dạng (2012) năm 2000, [14] 2006 không rõ thời gian Rucinski cộng (2012) [43] Khai quật hài cốt người chôn từ 6-118 tháng Tỉ lệ khôi phục ADN genomic thấp(< 51%) Kit Silica Nhân bội Nồng độ mùn cao làm Sử dụng EDTA để hòa tan hoàn STR ảnh hưởng đến chất toàn bột xương, Kit silica lượng ADN Hòa tan hoàn toàn bột xương làm tăng số lượng allen STR Hòa tan hoàn toàn bột xương cải thiện Dùng EDTA hòa tan hoàn toàn Chạy chất lượng STR bột xương, cột cô mẫu, cột silica qPCR đối số lượng ADN hồi để tinh với phục Dùng Kit silica tách chiết với nADN Protocol bao gồm số thay đổi, cột cô mẫu Nhân bội trình hòa tan tiến STR hành tự động hệ thống QIAcube Tối ưu hóa thể tích phản ứng, dung dịch phân giải,và thời gian ủ mẫu phương pháp Tách chiết tự động sử dụng hạt từ phủ silica Tách chiết Kit silica, cột cô mẫu Sử dụng EDTA để loại khoáng xương, tách chiết phenol/chloroform/isoamyl alcohol, cột cô mẫu Định lượng nADN Nhân bội STR Định lượng nADN Nhân bội STR Với việc tối ưu hóa phương pháp thu đầy đủ hồ sơ STR từ xương tách chiết; phần hồ sơ STR trước sử dụng protocol tác giả công bố Tách chiết với phenol/chloroform giúp ADN phục hồi tốt Tách chiết phenol/chloroform cho đầy đủ hồ sơ STR; sử dụng Kit tách chiết Silica số allen nhân bội Có thể thấy đồng thuận phương pháp tách chiết ADN tối ưu cho xương lâu năm Không bất đồng phương pháp tách chiết, bước qui trình tách chiết khác tùy theo nhóm tác giả Ví dụ bước loại can xi có nhóm tác giả cho cần thiết phải tiến hành thời gian dài có ý kiến cho bước làm lượng lớn ADN, Footer Page 33 of 126 Trần Thị Hạnh 22 Khóa học 2014-2016 Chuyên ngành Di truyền học Header Page 34 of 126 Luận văn Thạc sĩ kéo dài làm tăng khả phân hủy ADN, giảm hiệu suất tách chiết… 1.5 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích ADN để xác định cá thể người bắt đầu vào cuối năm 90 kỷ 20 có bước phát triển định * Năm 2003, Viện Pháp Y quân đội phối hợp với Viện Công nghệ sinh học thực đề tài khoa học cấp nhà nước "Nghiên cứu ứng dụng công nghệ ADN việc xác định hài cốt liệt sĩ" có mã số KC.04.23 Hiện nay, công nghệ giám định gen ADN ti thể ứng dụng thực tiễn Việt Nam, với hàng trăm trường hợp xác định thành công [2] * Mô ̣t số trung tâm, công ty có dich ̣ vu ̣ phân tıć h di truyề n cũng có thể đáp ứng những yêu cầ u phân tı́ch giám định ADN ti thể từ xương lâu năm Như vậy, việc giám định mẫu xương sử dụng hệ gen ti thể tiến hành từ lâu thu nhiều kết Tuy nhiên, đến thời điểm tại, chưa có mô ̣t sở nghiên cứu nào tiế n hành các phân tı́ch ADN hệ gen nhân mẫu xương lâu năm Phương pháp phân tıć h ADN ti thể , mă ̣c dù có nhiề u kế t quả khả quan, chı̉ cho phép xác định quan hệ di truyền theo dòng mẹ mà khả truy nguyên đến cá thể Trong đó, viê ̣c phân tıć h nADN từ xương lâu năm cho phép truy nguyên tới tâ ̣n cá thể với mức độ xác cao có thêm mẫu liên quan mẫu có quan hệ huyết thống trực tiếp, mẫu anh em trai theo dòng cha có sở liệu ADN để đối chiếu so sánh trực tiếp Đây yêu cầu thiết yếu giám định hình Hơn nữa, Việt Nam, nhu cầu giám định hài cốt lớn, số lượng mẫu cần giám định hàng năm lên tới hàng trăm mẫu Tìm hiểu tình hình giám định ADN phục vụ mục đích truy nguyên cá thể từ mẫu bị phân hủy mạnh, đặc biệt hài cốt, nhận thấy có số điểm cần lưu ý sau: Footer Page 34 of 126 Trần Thị Hạnh 23 Khóa học 2014-2016 Chuyên ngành Di truyền học Header Page 35 of 126 Luận văn Thạc sĩ Có nhu cầu lớn phân tích, giám định ADN nhằm định danh, truy nguyên cá thể Đó trường hợp nhận dạng cá nhân đơn lẻ mẫu hình nhu cầu truy tìm nhân thân, có trường hợp cần phân tích số lượng lớn mẫu hài cốt liệt sĩ chiến tranh mẫu nạn nhân từ thảm họa hàng loạt Trong truy nguyên cá thể phân tích STR nằm NST thường phân tích cho kết có giá trị Trong phân tích ADN nhân từ xương bước tách chiết ADN để thu nhận lượng ADN tinh đủ chất lượng cho phân tích thị di truyền Tuy nhiên chưa có phương pháp tách chiết chung cho tách chiết xương lâu năm Ở Việt Nam, phân tích ADN xương lâu năm tiến hành từ lâu chủ yếu sử dụng phân tích mtADN Từ phân tích trên, xác định mục tiêu đặt đề tài luận văn là: Tối ưu qui trình tách ADN tổng số từ xương lâu năm phục vụ nhận dạng cá thể người phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam Nội dung nghiên cứu bao gồm: - Tối ưu bước xử lý mẫu, loại can xi - Thử nghiệm, lựa chọn phương pháp tách chiết tối ưu điều kiện phòng thí nghiệm - Tối ưu qui trình tách chiết, phân tích nADN từ xương lâu năm; thực phân tích với mẫu thu thập theo qui trình xây dựng Footer Page 35 of 126 Trần Thị Hạnh 24 Khóa học 2014-2016 Header Page Chuyên 36 of 126 ngành Di truyền học Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nghiêm Xuân Dũng (2007), “Nghiên cứu ứng dụng phát triển kỹ thuật phân tích ADN phục vụ chẩn đoán hình sự”, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài cấp nhà nước KC 04.31 Nguyễn Trọng Toàn (2003), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ ADN việc xác định hài cốt liệt sĩ, Viện Pháp Y quân đội Lê Thị Bích Trâm, Trần Trọng Hội, Bùi Nguyên Hải, Nguyễn Thị Thu Hoài, (2012), “Nghiên cứu phân tích mẫu dấu vết ADN thử nghiệm số vật mang điều kiện phòng thí nghiệm”, Tạp chí Khoa học công nghệ Môi trường công an, 30, tr 42 - 45 Lương Thị Yến (2013), “Nghiên cứu xây dựng thẻ liệu ADN nhận dạng cá thể người phục vụ công tác an ninh dân sinh”, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tiếng Anh Alonso A, Anđelinović S, Martín P, Sutlović D, Erceg I, Huffine E (2001), “DNA typing from skeletal remains: evaluation of multiplex and megaplex STR systems on DNA isolated from bone and teeth samples”, Croat Med J, 42, pp.260-266 Applied Biosystems (2007), “AmpFlSTR® MiniFiler™ PCR amplification kit”, User guide Blau S., Briggs C.A (2011), “The role of forensic anthropology in Disaster Victim Identification (DVI)”, Forensic Sci Int, 205, pp 29-35 Budowle, Van Daal A (2008), “Forensically relevant SNP classes” Biotechniques, 44(5), pp 603 - 610 Butler, J.M, Hill CR (2012), “Biology and genetics of new autosomal STR loci useful for forensic DNA analysis”, Forensic Sci Rev, 24, pp 15–26 10 Butler, J M (2005), Forensic DNA Typing, Elsevier Academic Press, Second Edition Trần Thị Hạnh Footer Page 36 of 126 54 Khóa học 2014-2016 Header Page Chuyên 37 of 126 ngành Di truyền học Luận văn Thạc sĩ 11 Cattaneo C, Smillie DM, Gelsthorpe K, Piccinini A, Gelsthorpe AR, Sokol RJ (1995), “A simple method for extracting DNA from old skeletal material”, Forensic Sci Int, 74(3), pp.167–174 12 Coticone S, Barna L, Teets M (2010), “Optimization of a DNA extraction method for nonhuman and human bone”,J Forensic Ident, 60(4), pp 430– 438 13 Denice Higgins, Adam B Rohrlach, John Kaidonis, Grant Townsend, Jeremy J Austin, (2015), “ Differential Nuclear and Mitochondrial DNA Preservation in Post-Mortem Teeth with Implications for Forensic and Ancient DNA Studies, PLoS ONE, 10(5), e0126935 14 Dukes MJ, Williams AL, Massey CM, Wojtkiewicz PW (2012), “Technical note: bone DNA extraction and purification using silica-coated paramagnetic beads”, Am J Phys Anthropol, 148(3), pp 473–482 15 Edson S.M, Ross J P, Coble M D, Parsons T J, and Barritt S.M (2004), “Naming the Dead - Confronting the Realities of Rapid Identification of Degraded Skeletal Remains”, Forensic Science Review, (1), pp 63–90 16 Fondevila M, Phillips C, Santos C, Freire Aradas A, Vallone PM, Butler, J.M (2013), “Revision of the SNPforID 34-plex forensic ancestry test: Assay enhancements, standard reference sample genotypes and extended population studies”, Forensic Sci Int Genetics, 7, pp 63–74 17 Foran DR (2006), “Relative degradation of nuclear and mitochondrial DNA: an experimental approach”, J Forensic Sci, 51(4), pp.766–770 18 Haas C, Shved N, Ruhli FJ, Papageorgopoulou C, Purps J, Geppert M (2013), “Y-chromosomal analysis identifies the skeletal remains of Swiss national hero Jorg Jenatsch (1596-1639)”, Forensic Sci Int Genet, 7, pp.610-617 19 Hwan Young Lee, Myung Jin Park, Na Young Kim, Jeong Eun Sim, Woo Ick Yang, Kyoung-Jin Shin (2010), “Simple and highly effective DNA extraction methods from old skeletal remains using silica columns”, Forensic Sci Int Genet, (5), pp 275–280 Trần Thị Hạnh Footer Page 37 of 126 55 Khóa học 2014-2016 Header Page Chuyên 38 of 126 ngành Di truyền học Luận văn Thạc sĩ 20 Ian M Candido; Laryssa S A Bezerra; Mariana F Mota; Neide M O Godinho (2014), “DNA extraction from human bone: comparison of magnetic bead and silica column techniques”, Rev Odontol Bras Central, 23(66), pp 155158 21 Jeffreys, A.J., V Wilson, and S.L Thein (1985), “Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA”, Nature, 314(6006), pp 67-73 22 Kalmár T, Bachrati CZ, Marcsik A, Raskó I (2000), “A simple and efficient method for PCR amplifiable DNA extraction from ancient bones”, Nucleic Acids Res, 28(12), e67 23 Kayser, M P De Knijff (2011), “Improving human forensics through advances in genetics, genomics and molecular biology”, Nat Rev Genet, 12(3), pp 179-192 24 Kemp B.M, Smith D.G (2005), “Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth”, Forensic Sci Int, 154 (1), pp 5361 25 Kim K, Kim K-Y, Jeon E, Togloom A, Cho Y-O, Lee M-S (2008), “Technical note: improved ancient DNA purification for PCR using ion-exchange columns”, Am J Phys Anthropol, 136(1), pp.114–121 26 Kitamura, E., Iwamoto, C., Sakairi, N., Tokura, S., Nishi, N (1997), “Marked effect of DNA on collagen fibrillogenesis in vitro”, Int J Biol Macromol, 20, pp 241–244 27 Krings, M., A Stone, R.W Schmitz, H Krainitzki, M Stoneking, S Pääbo (1997), “Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans”, Cell, 90, pp.19-30 28 Kurosaki K, Matsushita T, Ueda S (1993), “Individual DNA identification from ancient human remains”, Am J Hum Genet, 53(3), pp.638–643 29 Lindahl, T.(1993), “Instability and decay of the primary structure of DNA”, Nature, 362, pp 709–715 Trần Thị Hạnh Footer Page 38 of 126 56 Khóa học 2014-2016 Header Page Chuyên 39 of 126 ngành Di truyền học Luận văn Thạc sĩ 30 Loreille OM, Diegoli TM, Irwin JA, Coble MD, Parsons TJ (2007), “High efficiency DNA extraction from bone by total demineralization”, Forensic Sci Int Genet, 1(2), pp.191–195 31 Marjanovic, D (2007), “DNA identification of skeletal remains from the World War II mass graves uncovered in Slovenia”, Croatian medical journal, 48(4), pp 513-519 32 Mrevlishvili, G., Svintradze, D (2005), “DNA as a matrix of collagen fibrils”, Int J Biol Macromol, 36, pp.324–326 33 Nelson K, Melton T (2007), “Forensic mitochondrial DNA analysis of 116 casework skeletal samples”, J Forensic Sci, 52(3), pp.557–661 34 Nudelman, F., Pieterse, K., George, A., Bomans, P.H.H., Friedrich, H., Brylka, L.J.,Hilbers, P.A.J., de With, G., Sommerdijk, N.A.J.M (2010), “The role of collagen in bone apatite formation in the presence of hydroxyapatite nucleation inhibitors”, Nat Mater, 7, pp 1004–1009 35 Okazaki, M., Yoshida, Y., Yamaguchi, S., Kaneno, M., Elliott, J.C.(2001), “Affinity binding phenomena of DNA onto apatite crystals”, Biomaterials, 22, pp 2459–2464 36 Opel, K.L (2006), “The application of miniplex primer sets in the analysis of degraded DNA from human skeletal remains”, Journal of forensic sciences, 51(2), pp 351-356 37 Orgel, J.P.R.O., Irving, T.C., Miller, A., Wess, T.J (2005), “Microfibrillar structure of type I collagen”, Proc Natl Acad Sci U S A, 103 (24), pp.9001–9005 38 Ortner, D., Turner-Walker, G (2003), “The Biology of Skeletal Tissues, in Identification of Pathological Conditions in Human Skeletal Remains”, Academic Press, pp 11-35 39 Parsons, T.J (2007), “Application of novel "mini-amplicon" STR multiplexes to high volume casework on degraded skeletal remains”, Forensic Science International: Genetics, 1(2), pp 175-179 Trần Thị Hạnh Footer Page 39 of 126 57 Khóa học 2014-2016 Header Page Chuyên 40 of 126 ngành Di truyền học Luận văn Thạc sĩ 40 Paula F Campos, Oliver E Craig, Gordon Turner-Walker, Elizabeth Peacock, Eske Willerslev, M Thomas P Gilbert (2012), “DNA in ancient bone – Where is it located and how should we extract it?”, Annals of Anatomy, 194, pp 7– 16 41 Pesquero, M.D., Ascaso, C., Alcala, L., Fernandez-Jalvo, Y (2010), “A new taphonomic bioerosion in a Miocene lakeshore environment”, Palaeogeogr Palaeoclimatol Palaeoecol, 295, pp 192–198 42 Rohland N, Hofreiter M (2007), “Comparison and optimization of ancient DNA extraction”, Biotechniques, 42, pp 343-352 43 Rucinski C, Malaver AL, Yunis EJ, Yunis JJ (2012), “Comparison of two methods for isolating DNA from human skeletal remains for STR analysis”, J Forensic Sci, 57(3), pp 706–712 44 Scientific Working Group for Forensic Anthropology (SWGANTH) (2010), Personal Identification 45 Sobrino, B., M Brion, and A Carracedo (2005), “SNP in forensic genetics: a review on SNP typing methodologies”, Forensic science international, 154(2-3), pp 181-94 46 Sylvain Amory, Rene´ Huel, Ana Bilic´, Odile Loreille, Thomas J Parsons (2012), “Automatable full demineralization DNA extraction procedure from degraded skeletal remains”, Forensic Science International: Genetics, (3), pp 398–406 47 Taylor J (2009), “Development of the Australian Society of Forensic Odontology disaster victim identification forensic odontology guide”, J Forensic Odontostomatol, 27 (2), pp 56-63 48 Todoh, M., Tadano, S., Giri, B., Nishimoto, M (2009), “Effect of gradual demineralization on the mineral fraction and mechanical properties of cortical bone”, J Biomech Sci Eng, 4, pp 230–238 Trần Thị Hạnh Footer Page 40 of 126 58 Khóa học 2014-2016 Header Page Chuyên 41 of 126 ngành Di truyền học Luận văn Thạc sĩ 49 Tuross, N (2003), “Recent Advances in Bone, Dentin and Enamel Biochemistry, in Identification of Pathological Conditions in Human Skeletal Remains”, Academic Press, 2, pp 65–72 50 Tzaphlidou, M., Berillis, P (2005), “Collagen fibril diameter in relation to bone site A quantitative ultrastructural study”, Micron, 36, pp 703–705 51 Welch L (2011), “A comparison of mini-STR versus standard STR results of a collaborative European (EDNAP) exercise”, Forensic Sci Int Genet, 5(3), pp 257-265 52 Yang DY, Eng B, Waye JS, Dudar JC, Saunders SR (1998), “Technical note: Improved DNA extraction from ancient bones using silica-based spin columns”, Am J Phys Anthropol, 105(4), pp 539–543 Trần Thị Hạnh Footer Page 41 of 126 59 Khóa học 2014-2016 ... Nghiên cứu tối ưu qui trình tách ADN hệ gen từ xương lâu năm ứng dụng nhận dạng cá thể người với mục tiêu xây dựng qui trình tối ưu để tách chiết phân tích ADN nhân từ mẫu xương lâu năm phù... TRẦN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUI TRÌNH TÁCH ADN HỆ GEN TỪ XƯƠNG LÂU NĂM ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƯỜI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG... sử dụng khả hấp thụ thuận nghịch silica hạt lõi từ phân tử ADN dựa nồng độ muối Từ lâu, tách chiết ADN từ xương lâu năm nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu Bảng 1.1 trình bày tổng hợp qui trình tách