Nghiên cứu tối ưu qui trình tách AND hệ gen từ xương lâu năm ứng dụng trong nhận dạng cá thể người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUI TRÌNH TÁCH ADN HỆ GEN TỪ XƯƠNG LÂU NĂM ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƯỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUI TRÌNH TÁCH ADN HỆ GEN TỪ XƯƠNG LÂU NĂM ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƯỜI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội - 2017 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan kết thể luận văn công trình nghiên cứu thực tế Toàn số liệu, kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, khách quan, chưa công bố công khai khác LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân –Chủ nhiệm Bộ môn Di truyền học trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình suốt thời gian thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học Tài liệu nghiệp vụ - Tổng cục IV – Bộ công an ủng hộ tạo điều kiện thuận lợi cho trình hoàn thành luận vặn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học lãnh đạo Khoa giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn tới toàn cán phòng Kỹ thuật Sinh học nghiệp vụ - Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học Tài liệu nghiệp vụ - Tổng cục IV – Bộ công an, gia đình, người thân bạn bè bên tôi, quan tâm động viên tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 06 tháng 01 năm 2017 Học viên Trần Thị Hạnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………………………… CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN …………………………………………………… 1.1 Các phương pháp nhận dạng cá thể người 1.1.1 Phương pháp hình thái học……………………………………………… 1.1.2 Phương pháp phân tích thị phân tử……………………………… 1.1.3 Một số thị ADN ứng dụng nhận dạng cá thể………………… 1.1.3.1 Các locus STR…………………………………………………………… 1.1.3.2 Mini-STRs………………………………………………………………… 1.1.3.3 Vùng siêu biến HV1 HV2 ADN ti thể………………………… 10 1.1.3.4 Đa hình đơn nucleotide (SNPs)………………………………………… 11 1.2 Các nguồn ADN sử dụng phân tích mẫu hài cốt 12 1.2.1 Xương…………………………………………………………………… 12 1.2.1.1 Cấu trúc xương………………………………………………………… 12 1.2.1.2 Sự tồn ADN xương ……………………………………… 14 1.2.2 Răng 14 1.2.2.1 Cấu trúc 14 1.2.2.2 Vị trí ADN 15 1.2.3 Sự tồn khả thu ADN phận khác mẫu hài cốt……………………………………………………………… 17 1.3 Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm giới… 19 1.4 Tình hình nghiên cứu Việt Nam………………………………… 23 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 25 2.1 Nguyên liệu………………………………………………………… 25 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………… 25 2.1.2 Hóa chất………………………………………………………………… 25 2.1.3 Thiết bị dụng cụ…………………………………………………………… 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu………………………………………………… 27 2.2.1 Phương pháp lựa chọn mẫu ……………………………………………… 27 2.2.2 Phương pháp thu mẫu, bảo quản mẫu bố trí khu vực thí nghiệm sau thu mẫu 28 2.2.3 Xử lý mẫu – Loại canxi…………………………………………………… 29 2.2.4 Tách chiết ADN từ xương phương pháp hữu (Phenol/ Chloroform/ Isoamyl alcohol: PCI) 30 2.2.5 Tách chiết ADN từ xương KIT QIAmp DNA Investigator (QiAgen) 2.2.6 Tách chiết ADN từ xương KIT DNA 31 IQTM System (Promega) 32 2.2.7 Định lượng ADN 33 2.2.8 PCR nhân bội sản phẩm 33 2.2.9 Điện di đọc kết máy điện di mao quản……………………… 34 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN….………………………………… 36 3.1 Kết nghiên cứu tối ưu bước xử lý mẫu ban đầu loại canxi……… 36 3.2 Kết thử nghiệm, lựa chọn phương pháp tách chiết tối ưu điều kiện phòng thí nghiệm ……………………………………… 38 3.2.1 Kết phân tích, xác định kiểu gen…………………………………………… 38 3.3.2 Kết đánh giá, lựa chọn phương pháp tách chiết………………………… 39 3.3 Kết tối ưu quy trình tách chiết, phân tích ADN nhân từ xương lâu năm……………………………………………………………………………… 40 3.4 Kết phân tích ADN nhân mẫu xương theo quy trình xây dựng……………………………………………………………………………… 46 3.5 Thảo luận chung ………………………………………………………… 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………… 53 Kết luận…………………………………………………………………………… 53 Kiến nghị………………………………………………………………………… 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………… 54 PHỤ LỤC……………………………………………………………………… DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT -ADN :Deoxyribonucleic Acid -ATP :Adenosine Triphosphate -Bp :Base pair -CODIS :Combined ADN Index System (Hệ thống số ADN kết hợp (Mỹ) -CSDL :Cơ sở liệu -dNTP :Deoxyribonucleotide triphosphate -EDTA :Ethylendiamin Disodium Tetraacetic Acid -FBI: :Federal Bureau of Investigation (Cục điều tra Liên Bang Mỹ) -HA :Hydroxyl Apatite (Tinh thể hydroxyapatít) -INV :QiAmp DNA Investigator -IQS :DNA IQTM System -NST :Chromosome (Nhiễm sắc thể) -mtADN :Mitochondrial DNA (ADN ti thể) -nADN :Nuclear DNA (ADN nhân) -qADN :DNA Quantification (Định lượng ADN) -OD :Optical Density (Mật độ quang học) -PCR :Polymerase Chain Reaction -PD :Power of discrimination (Khả phân biệt) -PCI :Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol -PTN :Phòng thí nghiệm -RFLP :Restriction fragment length polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) -SDS :Sodium Dodecyl Sulfate -STR :Short Tandem Repeat (Đoạn lặp đa hình ngắn) -SNP :Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide) -Taq :Thermus aquaticus -TBE :Tris Boric EDTA -TE :Tris EDTA -Tm :Temperature melting (Nhiệt độ nóng chảy) -UV :Ultra Violet (Tia cực tím) -VNTR :Variable Number of Tandem Repeat (Đoạn lặp có độ dài trung bình) DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ minh hoạ khả di truyền số alen thuộc locus STR từ bố, mẹ cho theo định luật Mendel Hình 1.2 Hình minh họa vị trí thiết kế mồi Mini-STR mồi multiplex Mini-STR Hình 1.3 Hình ảnh chụp hiển vi 03 loại tế bào xương 13 Hình 1.4 Cấu trúc điển hình người 15 Hình 1.6 Lớp tế bào odontoblast xếp thành lớp bề mặt khoang tủy ống tủy, nơi có trình biệt hóa hình thành lớp phức hợp ngà-tủy Hình 1.6 16 Sơ đồ khu vực mẫu xương mức độ thành công phân tích ADN tương ứng 21 Hình 2.1 Sơ đồ bước nghiên cứu đề tài luận văn 35 Hình 2.2 Sơ đồ bước nghiên cứu đề tài luận văn 37 Hình 3.1 Kết so sánh số mẫu tách theo kit IQS nhà sản xuất theo quy trình cải tiến Hình 3.1 44 Sơ đồ mô tả qui trình tổng quát tách chiết, phân tích ADN từ xương lâu năm 45 Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus FGA, TPOX, D8S1179, vWA Amelogenin mẫu ĐT-12-X03 (Màu huỳnh quang TMR) ĐT-12-X04 Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 D3S1358 mẫu ĐT-12-X04 (Màu huỳnh quang Florescent) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 D5S818 mẫu ĐT-12-X04 (Màu huỳnh quang JOE) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus FGA, TPOX, D8S1179, vWA Amelogenin mẫu ĐT-12-X04 (Màu huỳnh quang TMR) ĐT-12-X05 Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 D3S1358 mẫu ĐT-12-X05 (Màu huỳnh quang Florescent) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 D5S818 mẫu ĐT-12-X05 (Màu huỳnh quang JOE) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus FGA, TPOX, D8S1179, vWA Amelogenin mẫu ĐT-12-X05 (Màu huỳnh quang TMR) ĐT-12-X10 Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 D3S1358 mẫu ĐT-12-X10 (Màu huỳnh quang Florescent) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 D5S818 mẫu ĐT-12-X10 (Màu huỳnh quang JOE) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus FGA, TPOX, D8S1179, vWA Amelogenin mẫu ĐT-12-X10 (Màu huỳnh quang TMR) ĐT-12-X11 Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 D3S1358 mẫu ĐT-12-X11 (Màu huỳnh quang Florescent) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 D5S818 mẫu ĐT-12-X11 (Màu huỳnh quang JOE) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus FGA, TPOX, D8S1179, vWA Amelogenin mẫu ĐT-12-X11 (Màu huỳnh quang TMR) ĐT-12-X16 Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 D3S1358 mẫu ĐT-12-X16 (Màu huỳnh quang Florescent) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 D5S818 mẫu ĐT-12-X16 (Màu huỳnh quang JOE) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus FGA, TPOX, D8S1179, vWA Amelogenin mẫu ĐT-12-X16 (Màu huỳnh quang TMR) ĐT-12-X22 Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 D3S1358 mẫu ĐT-12-X22 (Màu huỳnh quang Florescent) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 D5S818 mẫu ĐT-12-X22 (Màu huỳnh quang JOE) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus FGA, TPOX, D8S1179, vWA Amelogenin mẫu ĐT-12-X22 (Màu huỳnh quang TMR) ĐT-12-X26 Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 D3S1358 mẫu ĐT-12-X26 (Màu huỳnh quang Florescent) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 D5S818 mẫu ĐT-12-X26 (Màu huỳnh quang JOE) Phương pháp tách chiết PCI INV IQS ĐC (+) ĐC (-) Điện di đồ kiểu gene locus FGA, TPOX, D8S1179, vWA Amelogenin mẫu ĐT-12-X26 (Màu huỳnh quang TMR) ... Nghiên cứu tối ưu qui trình tách ADN hệ gen từ xương lâu năm ứng dụng nhận dạng cá thể người với mục tiêu xây dựng qui trình tối ưu để tách chiết phân tích ADN nhân từ mẫu xương lâu năm phù... TRẦN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUI TRÌNH TÁCH ADN HỆ GEN TỪ XƯƠNG LÂU NĂM ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƯỜI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG... sử dụng khả hấp thụ thuận nghịch silica hạt lõi từ phân tử ADN dựa nồng độ muối Từ lâu, tách chiết ADN từ xương lâu năm nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu Bảng 1.1 trình bày tổng hợp qui trình tách