Nghiên cứu một số locut đa hình STR ở người việt nam nhằm sử dụng trong khoa học hình sự, nhận dạng cá thể và xác định huyết thống

DANH MỤC CÁC HÌNH 1.1 Sơ đồ minh hoạ các khả năng di truyền một số alen thuộc locut STR từ bố, mẹ cho con theo định luật Mendel 31 2.1 Hình minh họa sự phối hợp các alen khác nhau trong

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIấN

Lê thị bích trâm

Nghiên cứu một số locut đa hình str ở người

việt nam nhằm sử dụng trong khoa học hình sự, nhận

dạng cá thể và xác định huyết thống

Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 62 42 70 01

Luận án tiến sĩ sinh học

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Đinh đoàn long

2 pgs.Ts trịnh đình đạt

HÀ NỘI - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan tất cả các kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác Nếu sai tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn

Tác giả

Lê Thị Bích Trâm

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Phòng Kỹ thuật Sinh học nghiệp vụ thuộc Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học và Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục Hậu cần - Kỹ thuật, Bộ Công an

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn : PGS.TS Đinh Đoàn Long, Chủ nhiệm Bộ môn Y dược học cơ sở, Phó chủ nhiệm khoa Y- Dược, ĐH Quốc Gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận án

PGS.TS Trịnh Đình Đạt, Bộ môn Di truyền học - Khoa Sinh học - ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc Gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận án

TS Nghiêm Xuân Dũng, Thạc sĩ Trần Minh Đôn, Thạc sĩ Lương Thị Yến - Tổng cục Hậu cần - Kỹ thuật - Bộ Công an đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong quá trình hoàn thành luận án

Khoa Sinh học cùng các phòng chức năng, phòng Đào tạo sau ĐH - Trường ĐH Khoa học tự nhiên - ĐH Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân cùng tập thể cán bộ, giáo viên Bộ môn Di truyền học - Khoa Sinh học - Trường ĐH Khoa học tự nhiên - ĐH Quốc Gia Hà Nội và Lãnh đạo Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học và Tài liệu nghiệp vụ đã ủng hộ và luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình hoàn thành luận án

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ Phòng Kỹ thuật Sinh học nghiệp vụ - Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học và Tài liệu nghiệp vụ cùng gia đình, bạn bè luôn bên tôi, quan tâm, động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành bản luận án này

Tác giả

17

1.1.3 Nhận dạng cá thể người qua phân tích ADN nhân 19 1.1.4 Phương pháp phân tích ADN ty thể 20 1.2 ADN và các phương pháp phân tích đa hình ADN ứng

1.3.2 Cơ sở khoa học của phân tích STR trong nhận dạng cá thể và xác định huyết thống

30

1.3.3 Cấu trúc của STR và danh pháp quốc tế 31 1.3.4 Vai trò của các STR trong phân tích hình sự 32 1.3.5 Vai trò của việc lựa chọn, phối hợp các locut

STR khác nhau trong xác định huyết thống

34

1.4 Tình hình nghiên cứu nhận dạng cá thể người bằng

phương pháp phân tích ADN trên thế giới và tại Việt Nam

35

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 35 1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 41 1.5 Các locut sử dụng trong nghiên cứu luận án 43

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46

2.3.6 Phương pháp xác định trình tự các nucletotide 57 2.3.7 Khảo sát tần suất alen và xử lý số liệu bằng các

chỉ số thống kê

57

3.1 Thiết kế mồi và lựa chọn điều kiện PCR thích hợp cho

phức 4 locut F13A01, D8S1179, Amelogenin, HPRTB

60

3.1.1 Thiết kế mồi cho locut F13A01 60 3.1.2 Thiết kế mồi cho locut D8S1179 61 3.1.3 Thiết kế mồi cho locut HPRTB 61 3.1.4 Thiết kế mồi cho locut Amelogenin 62

3.1.6 Lựa chọn điều kiện PCR thích hợp cho phức 4 locut F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin

64

3.2 Khảo sát tần suất alen và đánh giá mức độ đa hình

của 15 locut STR ở quần thể người Việt (Kinh) bằng các

3.4 Đề xuất hướng ứng dụng các locut STR trong nhận

dạng cá thể và xác định huyết thống ở Việt Nam

109

3.5 Chế tạo bộ KIT và thử nghiệm phân tích 110

3.5.1 Chế tạo bộ kit nhân bội ADN phức 4 locut F13A01, D8S1179, HPRTB, Amelogenin

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

121

PHỤ LỤC

CÁC CHỮ VÀ TỪ VIẾT TẮT

Chữ/từ

viết tắt

ADN Deoxyribonucleic acid Axít Deoxyribonucleic

APS Amonium persulphate

CPI Combined Parternity Index Chỉ số quan hệ huyết

thống kết hợp dNTP Deoxynucleoside triphosphate

EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid

PBS Phosphate buffered saline

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng

hợp

PD Power of Discrimination Khả năng phân biệt

thống

PM Matching Probability Xác suất trùng lặp FDAH F13A01, D8S1179, Amelogenin,

HPRTB RFLP Restriction fragment length

polymorphism

Đa hình chiều dài đoạn được cắt bằng enzym giới hạn

STR Short tandem repeat Đoạn ngắn lặp lại liên

tiếp TBE Tris Borat EDTA

TEMED N,N,N’,N’ tetramethylethylene

-diamine

VNTR Variable number of tandem repeats Đoạn lặp lại liên tiếp

với số lượng thay đổi CODIS Combined DNA Index System Hệ thống chỉ số ADN

kết hợp

3.4 Tần suất phân bố alen của 15 locut đa hình STR trên 250 cá thể

người Việt (Kinh)

76

3.5 Số lượng alen khảo sát được của 15 locut STR ở 250 cá thể

người Việt (Kinh)

94

3.6 Kết quả lựa chọn alen cho locut F13A01 99 3.7 Kết quả lựa chọn alen cho locut D8S1179 102 3.8 Kết quả lựa chọn alen cho locut HPRTB 106 3.9 Kết quả phân tích kiểu gen 16 locut cho 10 phạm nhân 115 3.10 Kết quả phân tích kiểu gen 16 locut mẫu (B) và (C) 117

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Sơ đồ minh hoạ các khả năng di truyền một số alen thuộc

locut STR từ bố, mẹ cho con theo định luật Mendel

31

2.1 Hình minh họa sự phối hợp các alen khác nhau trong phương

pháp chế tạo thang alen

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ mồi tới hiệu suất PCR và khả năng

phát hiện băng đặc hiệu tại phức 4 locut FDAH

67

3.4 Ảnh hưởng của nông độ MgCl2 tới hiệu suất PCR và khả

năng phát hiện băng đặc hiệu tại phức 4 locut FDAH

68

3.5 Ảnh hưởng của nồng độ dNTP tới hiệu suất PCR và khả

năng phát hiện băng đặc hiệu tại phức 4 locut FDAH

69

3.6 Ảnh hưởng của nồng độ Taq - ADN polymerase tới hiệu suất

PCR và khả năng phát hiện băng đặc hiệu tại phức 4 locut

FDAH

70

3.7 Ảnh hưởng của nồng độ ADN khuôn tới hiệu suất PCR và

khả năng phát hiện băng đặc hiệu tại phức 4 locut FDAH

71

3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi tới hiệu suất PCR và khả

năng phát hiện băng đặc hiệu tại phức 4 locut FDAH

73

3.9 Đồ thị tần suất alen locut D5S818 ở các quần thể người Việt

(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

77

3.10 Đồ thị tần suất alen locut D7S820 ở các quần thể người Việt

(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

79

3.11 Đồ thị tần suất alen locut D13S317 ở các quần thể người

Việt (Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

81

3.12 Đồ thị tần suất alen locut CSF1PO ở các quần thể người Việt

(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

82

3.13 Đồ thị tần suất alen locut TPOX ở các quần thể người Việt

(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

83

3.14 Đồ thị tần suất alen locut TH01 ở các quần thể người Việt

(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

84

3.15 Đồ thị tần suất alen locut D16S539 ở các quần thể người

Việt (Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

85

3.16 Đồ thị tần suất alen locut D3S1358 ở các quần thể người

Việt (Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

86

3.17 Đồ thị tần suất alen locut vWA ở các quần thể người Việt

(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

87

3.18 Đồ thị tần suất alen locut FES/FPS ở các quần thể người Việt

(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

88

3.19 Đồ thị tần suất alen locut F13B ở các quần thể người Việt

(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

89

3.20 Đồ thị tần suất alen locut LPL ở các quần thể người Việt

(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

90

3.21 Đồ thị tần suất alen locut F13A01 ở các quần thể người Việt

(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

91

3.22 Đồ thị tần suất alen locut D8S1179 ở các quần thể người

Việt (Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

92

3.23 Đồ thị tần suất alen locut HPRTB ở các quần thể người Việt

(Kinh), người Ba Lan, người Trung Quốc và người Mỹ

93

3.24 Kết quả giải trình tự một số alen locut F13A01 100 3.25 Kết quả chế tạo thang alen cho locut F13A01 102 3.26 Kết quả giải trình tự một số alen locut D8S1179 103 3.27 Kết quả chế tạo thang alen cho locut D8S1179 104 3.28 Kết quả lựa chọn mẫu chế tạo thang alen locut Amelogenin 105 3.29 Kết quả chế tạo thang alen cho locut Amelogenin 106 3.30 Kết quả giải trình tự một số alen locut HPRTB 107 3.31 Kết quả chế tạo thang alen cho locut HPRTB 108

3.32 Bộ kit nhân bội ADN phức 4 locut F13A01 - D8S1179 -

HPRTB và Amelogenin (FDAH)

111

3.33 Hình ảnh điện di phân tích kiểu gen cá thể một số mẫu ADN

sử dụng bộ kit nhân bội ADN 3 locut D5S818 - D7S820 -

D13S317 (3D)

112

3.34 Hình ảnh điện di phân tích kiểu gen cá thể một số mẫu ADN

sử dụng bộ kit nhân bội ADN 3 locut CSF- TPOX-TH01

(CTT)

112

3.35 Hình ảnh điện di phân tích kiểu gen cá thể một số mẫu ADN

sử dụng bộ kit nhân bội ADN 3 locut D16S539 - D3S1358 -

vWA (DDW)

113

3.36 Hình ảnh điện di phân tích kiểu gen cá thể một số mẫu ADN

sử dụng bộ kit nhân bội ADN 3 locut D16S539 - D3S1358 -

vWA (FFL)

113

3.37 Hình ảnh điện di phân tích kiểu gen cá thể một số mẫu ADN

sử dụng bộ kit nhân bội ADN 3 locut F13A01 - D8S1179 -

Amelogenin và HPRTB (FDAH)

114

3.38 Hình ảnh điện di phân tích kiểu gen 16 locut xác định quan

hệ huyết thống cha con

116

MỞ ĐẦU

Lịch sử phát triển của khoa học hình sự chuyển biến sang một bước ngoặt mới kể từ sau phát hiện của Jeffreys – năm 1985 về khả năng ứng dụng của các đoạn ADN đa hình trong nhận dạng cá thể người và đặc biệt là sau phát minh của Kary Mullis - nhà Hóa học người Mỹ về phản ứng PCR vào năm 1985 Đến nay, sau gần 30 năm phát triển, giám định ADN hay giám định gen đã thực sự trở thành công cụ đắc lực trong điều tra hình sự với sự phát hiện và ứng dụng rộng rãi của hàng loạt các locut đa hình có số lượng các đoạn lặp khác nhau trên thế giới

Các locut được sử dụng chủ yếu hiện nay là các đoạn ADN có trình tự lặp lại từ 4 đến 5 nucleotit được gọi là các trình tự lặp lại ngắn liên tiếp (Short Tandem Repeat - STR) [23, 25] Các STR có thể dễ dàng được nhân bội bằng phương pháp PCR, đồng thời số lượng đoạn lặp trong STR rất đa dạng ở các

cá thể nên tạo ra nhiều tổ hợp khác nhau Hiện nay, nhiều phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu khảo sát hàng loạt các locut STR nhằm lựa chọn những locut thích hợp đặc trưng cho mỗi quần thể đồng thời cũng lựa chọn công nghệ phân tích phù hợp đối với điều kiện cụ thể của nước mình Năm 1994, Sở KHHS Anh đã nghiên cứu phát triển bộ phức thế

hệ thứ nhất (bao gồm 4 locut) và bộ phức thế hệ thứ hai (bao gồm 6 locut đa hình và 01 locut giới tính) với khả năng trùng lặp khoảng 1/50 triệu [23, 26] Năm 1996, Cục điều tra liên bang Mỹ (FBI) đã tài trợ cho việc lựa chọn thành lập các locut “chủ đạo” STR (gọi tắt là CODIS) nhằm sử dụng cho CSDL nhận dạng ADN quốc gia Bộ này bao gồm 13 locut STR với khả năng trùng lặp khoảng 1/1012 [23, 24] Nhiều quốc gia khác trên thế giới cũng đã nghiên cứu, phát triển ứng dụng các locut dựa trên công nghệ phân tích phù hợp với điều kiện của nước mình [36, 41, 44, 49, 57, 59, 60, 66, 77, 87]

Tại Việt Nam từ năm 1998 đã có sự phát triển mạnh mẽ và nhanh chóng về trình độ cũng như khả năng ứng dụng kỹ thuật phân tích ADN trong

nhận dạng cá thể, giám định huyết thống nói chung và trong giám định hình

sự nói riêng Từ những nghiên cứu về các locut đơn lẻ ban đầu mang tính chất thăm dò như nghiên cứu của Nguyễn Văn Lợi [9], Lê Đình Lương [11], Phạm Hải Sáng [13], Trần Thị Quỳnh Trang [15] … đến nay đã có một số phòng thí nghiệm đã ứng dụng thành công công nghệ phân tích ADN trong hình sự và nhận dạng cá thể người, giám định huyết thống sử dụng các hệ thống thiết bị phân tích hiện đại với các bộ kit của nước ngoài [6, 8, 14, 92] Việc sử dụng các bộ kit cho kết quả phân tích chính xác Tuy nhiên không phải cơ sở nào cũng có thể thực hiện được vì đòi hỏi trang bị máy móc công nghệ hiện đại với chi phí cao đồng thời phụ thuộc nhiều vào các bộ kit sẵn có

Trước thực tế đó, từ năm 2001 đến nay, Viện Kỹ thuật Hoá học, Sinh học và Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục Hậu Cần - Kỹ thuật - Bộ Công an đã nghiên cứu chế tạo thành công một số bộ thang alen chỉ thị và các bộ kit phân tích đơn gen, 3 gen ứng dụng trong phân tích 12 locut đa hình STR sử dụng công nghệ điện di nhuộm bạc [2-5, 9] Việc xây dựng các bộ thang alen chỉ thị có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong xác định một cách chính xác tần suất alen quần thể người Việt đối với mỗi locut STR Tần suất alen các locut khảo sát đặc trưng cho quần thể người Việt là công cụ hỗ trợ đắc lực trong tính toán

độ tin cậy của mỗi ca giám định Các kết quả nghiên cứu đã giúp chủ động về công nghệ và hiện nay đã và đang được ứng dụng tốt trong trong phân tích gen hình sự tại một số cơ sở giám định các đơn vị công an địa phương như Hà Nội, Hải Phòng, Thanh Hóa, Cần Thơ, Khánh Hòa

Tuy nhiên, nếu chỉ dừng ở phân tích 12 locut thì thực tế cho thấy trong nhiều trường hợp cụ thể, đặc biệt là với những ca giám định phức tạp (như giám định xác định tội phạm có nhiều nghi can mà những người này lại có quan hệ huyết thống, họ hàng ) khó cho kết quả tin cậy Trong những trường hợp này, số locut được sử dụng để giám định thường từ 16 đến 24 locut [30,

35, 79]

Từ thực tế nêu trên, chúng tôi nhận thấy việc mở rộng nghiên cứu để tăng số lượng locut đang sử dụng là yêu cầu cần thiết Hơn nữa cần có sự đánh giá tổng thể về tính đa hình và khả năng ứng dụng của các locut STR đối với quần thể người Việt (Kinh) Mỗi quần thể có đặc trưng phân bố tần suất alen riêng đối với mỗi locut, có những locut thể hiện tính đa hình rất cao ở quần thể này nhưng lại thấp đối với quần thể khác Từ việc đánh giá đó, có thể đưa ra được hướng ứng dụng của các locut này trong nhận dạng cá thể phù hợp với quần thể người Việt Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài luận án “Nghiên cứu một số locut đa hình STR ở người Việt Nam nhằm sử dụng trong khoa học hình sự, nhận dạng cá thể và xác định huyết thống” với

các mục tiêu sau :

1 Thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu để nhân bội và phân tích được tính đa hình 03 locut STR (F13A01, D8S1179 và HPRTB) nhằm bổ sung vào bộ các locut sử dụng trong nhận dạng cá thể ở người Việt (Kinh)

2 Khảo sát, xác định được tần suất phân bố các alen thuộc 15 locut STR ở người Việt (Kinh), gồm D5S818, D7S820, D13S317, CSF1PO, TH01, TPOX, D16S539, D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01, D8S1179 và HPRTB

3 Xây dựng được thang alen chuẩn cho 03 locut F13A01, D8S1179, HPRTB

và locut giới tính Amelogenin

4 Đánh giá được mức độ đa hình và đề xuất được hướng ứng dụng của 15 locut STR trong truy nguyên cá thể và xác định huyết thống tại Việt Nam

* NỘI DUNG CHÍNH CỦA LUẬN ÁN

Các nội dung nghiên cứu chính của luận án gồm có:

1 Thiết kế và thử nghiệm các cặp mồi PCR đặc hiệu cho từng locut STR chọn lọc (F13A01, D8S1179, HPRTB) để phối hợp được với locut xác định giới tính Amelogenin trong cùng phản ứng

2 Nghiên cứu lựa chọn thành phần và điều kiện phản ứng PCR thích hợp áp dụng cho phức 4 cặp mồi F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin và điện di phân tích phức 4 locut trên gel polyacrylamide biến tính

3 Khảo sát tần suất phân bố alen và đánh giá tính đa hình thuộc 15 locut STR ở người Việt (Kinh), gồm D5S818, D7S820, D13S317, CSF1PO, TH01, TPOX, D16S539, D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01, D8S1179 và HPRTB

5 Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị cho 4 locut F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin

6 Đề xuất hướng ứng dụng 15 locut STR trong nhận dạng cá thể và xác định huyết thống tại Việt Nam

* Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIẾN

1 Nghiên cứu bổ sung bốn locut F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin kết hợp với các locut đã được nghiên cứu có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc:

- Tăng độ chính xác trong phân tích nhận dạng cá thể và xác định huyết thống

- Chủ động về công nghệ phân tích ADN phù hợp với điều kiện Việt Nam, đáp ứng kịp thời nhu cầu giám định của các địa phương trong cả nước

2 Số liệu khảo sát tần suất alen của các 15 locut đa hình STR cho quần thể người Việt (Kinh) có ý nghĩa quan trọng, được sử dụng để tính toán độ tin cậy của các ca giám định nhận dạng cá thể và huyết thống ở Việt Nam

3 Nghiên cứu chế tạo thành công thang alen chỉ thị cho 3 locut F13A01, D8S1179 và HPRTB đảm bảo độ chính xác cao trong giám định cá thể và xác định huyết thống

* ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1 Nghiên cứu xây dựng được điều kiện thích hợp để phân tích tổ hợp 4 locut đa hình mới F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin có thể nhân bội đồng thời trong cùng một phản ứng Bổ sung cho các tổ hợp locut đã nghiên cứu, góp phần làm tăng độ chính xác trong phân tích nhận dạng cá thể người và giám định huyết thống phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam

2 Bổ sung số liệu khảo sát tần suất alen 15 locut đa hình người Việt (Kinh), trong đó đã khảo sát mới 07 alen của locut F13A01, 06 alen của locut HPRTB, 06 alen cuả locut F13B, 08 alen của locut FES/FPS và

05 alen của locut LPL; phát hiện thêm được 02 alen mới ở quần thể người Việt (Kinh) là alen số 8 của locut CSF1PO, alen số 13 của locut vWA

3 Xây dựng được 04 bộ thang alen chỉ thị cho các locut F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin sử dụng trong phân tích kiểu gen cá thể đảm bảo độ chính xác cao

4 Đánh giá được khả năng ứng dụng của 15 locut STR đối với quần thể người Việt (Kinh) trong nhận dạng cá thể và xác định huyết thống tại Việt Nam

* BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN

Luận án gồm 134 trang (chưa gồm 41 trang phụ lục), được bố cục gồm

5 phần: mở đầu 5 trang; tổng quan 31 trang; vật liệu và phương pháp nghiên cứu 14 trang; kết quả và thảo luận 58 trang; kết luận, kiến nghị 03 trang Ngoài ra có 01 trang liệt kê danh mục các công trình khoa học đã công bố

* NƠI THỰC HIỆN LUẬN ÁN

Luận án được thực hiện tại Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học và Tài liệu nghiệp vụ - Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật - Bộ Công an

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƯỜI

Công tác nhận dạng diễn ra thường xuyên trong các ngành khoa học và thực tiễn cuộc sống Quá trình nhận dạng thực chất là cách sắp xếp thành hệ thống hay còn gọi là phân loại, trong đó các nhóm được phân chia theo các đặc tính chung và các nhóm có những đặc tính chung này sẽ được gọi một tên chung Bằng cách phân loại các nhà thực vật học phân loại cây, nhà động vật học phân loại động vật và giám định viên pháp y phân loại và nhận dạng cá thể người Thông qua các đặc điểm đặc trưng mang tính cá thể của con người

về hình thái khuôn mặt, về đặc điểm của răng, đặc điểm vân da, nhóm máu, ADN, của các cá thể khác nhau thì khác nhau để các giám định viên tiến hành công tác nhận dạng người

Có nhiều phương pháp để giám định nhận dạng cá thể người Các phương pháp nhận dạng thường mang tính bổ trợ cho nhau Để đạt được mục đích cuối cùng của công tác nhận dạng cần tiến hành qua các bước như: phân loại, sàng lọc và cuối cùng là xác định cá thể thì cần phối hợp nhiều phương pháp với nhau hoặc nhiều phần trong một phương pháp Ví dụ, phương pháp vân da cần phân tích nhiều đặc điểm đường vân, phương pháp ADN cần phân tích nhiều locut Việc sử dụng các phương pháp trong nhận dạng cá thể tuỳ thuộc vào:

- Loại mẫu, số lượng và chất lượng mẫu (bao gồm cả mẫu giám định nhận dạng và mẫu so sánh)

- Số lượng cá thể cần nhận dạng

- Trang thiết bị của cơ sở giám định

- Trình độ chuyên môn của giám định viên

Về nguyên lý, công tác nhận dạng chính là việc so sánh các thuộc tính, các đặc điểm của mẫu sinh phẩm thu được với những tiêu chuẩn, những chỉ tiêu đã biết để xác định cá thể Ví dụ xác định độ tuổi, giới tính, chủng tộc

trên xương sọ, .) hoặc so sánh giữa những thuộc tính, những đặc điểm của mẫu nghi ngờ với mẫu đối chứng để xem mức độ phù hợp hay không phù hợp hoặc chúng có cùng một nguồn gốc hay không Nếu các đặc tính giữa mẫu cần giám định và mẫu so sánh giống nhau thì điều đó có nghĩa là hai mẫu này

có chung một nguồn gốc Nếu các đặc tính khác nhau thì có nghĩa là mẫu giám định và mẫu so sánh không cùng một nguồn gốc, có nghĩa là có nguồn gốc khác nhau Thông qua việc phân tích các đặc tính chúng ta sẽ phân nhóm được các mẫu giám định hoặc loại trừ được mẫu nghi ngờ trong nhóm đối tượng cần giám định đôi khi chỉ bằng các phương pháp đơn giản hoặc một vài đặc điểm nhận dạng Như vậy, chúng ta sẽ giới hạn và khu trú dần số mẫu (đối tượng) cần giám định Khi số mẫu được khu trú càng ít thì khả năng xác định cá thể càng cao, rút ngắn được thời gian và tiết kiệm được kinh phí cho công tác giám định

Một số phương pháp sử dụng trong nhận dạng cá thể người:

1.1.1 Phương pháp hình thái học

Phương pháp này dựa trên các đặc điểm hình thái học mang tính đặc trưng của cơ thể con người để nhận dạng Các đặc điểm hình thái bao gồm các đặc điểm mô tả về loại hình khuôn mặt, loại hình mắt, mũi, miệng, tai , các kích thước cơ thể, các chỉ số trên xương (xương sọ, răng…) để xác định các đặc tính nhận dạng hay đặc điểm về vân da, vây tay…

Đây là các phương pháp rất thông dụng, cho đến nay vẫn được ứng dụng rộng rãi ở hầu hết các nước trên thế giới trong lĩnh vực pháp y hình sự [21, 65, 78, 90] Tuy nhiên độ chính xác của phương pháp này phụ thuộc nhiều vào yếu tố mẫu thu được và yếu tố so sánh Ví dụ khi nhận dạng bằng phương pháp tái tạo khuôn mặt từ hộp sọ thì mẫu thu được phải là xương sọ tương đối nguyên vẹn; nhận dạng dựa trên đặc điểm về răng thì mẫu thu được phải là răng hài cốt và đồng thời phải có hồ sơ răng của đối tượng cần xác định

* Nhận dạng bằng phương pháp xác định vân da:

Từ cuối thế kỷ thứ 19, giá trị nhận dạng bằng vân da đã được khẳng định qua những nghiên cứu của Galton trong hai cuốn sách “Về các dấu tay”,

“Cách sắp xếp và sử dụng dấu tay” Từ đó đến nay phương pháp nhận dạng bằng vân da đã không ngừng được hoàn thiện

Ngày nay mọi người đã quen thuộc với khái niệm nhận dạng cá thể bằng vân da và thừa nhận khả năng nhận dạng của chúng Vân da được mô tả một cách có hệ thống và được xem là một trong những đặc tính không biến đổi của mỗi cá thể Thông qua nghiên cứu và lập tàng thư các nhà khoa học

đã đi đến một kết luận rằng không có hai vân da giống nhau trong hàng triệu

Tuy nhiên, nhận dạng bằng dấu vân da còn gặp phải những trở ngại như chỉ thu được một vài dấu vân da, dấu vân da bị mờ nhạt, bị tẩy xoá, bị che dấu một phần hay toàn bộ do điều kiện khách quan, do mưu mô của kẻ phạm tội (đeo găng tay, bọc đầu ngón tay, làm mất vân da trên đầu ngón tay, phẫu thuật thay vân ngón tay hoặc sử dụng vân tay giả) làm cho việc nhận dạng nhiều khi không thực hiện được hoặc nếu có thực hiện được thì rất khó khăn, mất rất nhiều thời gian và công sức

1.1.2 Nhận dạng cá thể bằng các yếu tố có bản chất protein

1.1.2.1 Xác định nhóm máu

Khi phát hiện ra hệ thống nhóm máu ABO, các nhà khoa học thấy có

sự khác nhau về nhóm máu của những cá thể trong quần thể

Kháng nguyên nhóm máu A, B hay H (kháng nguyên H là của những

người mang nhóm máu O) là những hợp chất glycoprotein đặc hiệu trên màng hồng cầu Gen quy định nhóm máu di truyền không bị ảnh hưởng bởi môi trường và được truyền từ cha mẹ sang con ngay từ khi hình thành hợp tử Yếu

tố nhóm máu bền vững trong suốt cả cuộc đời Ngày nay người ta đã xác định được trình tự gen mã hoá những kháng nguyên nhóm máu [80]

Hiện nay, phân tích kháng nguyên nhóm máu hệ ABO trong nhận dạng pháp y hình sự vẫn được các nước trên thế giới sử dụng với các tính ưu việt,

thứ nhất là quá trình phân tích không đòi hỏi tốn nhiều thời gian, công sức và vật chất; thứ hai là kháng nguyên nhóm máu khá bền vững với môi trường và thứ ba là kháng nguyên nhóm máu còn tồn tại ở một số sinh phẩm khác như

lông, tóc, tinh dịch, nước bọt, mồ hôi…

Tiếp sau hệ nhóm máu ABO, các nhà khoa học còn tìm được nhiều hệ nhóm máu khác như Rh, MN, Lewis, P… Các yếu tố nhóm này được sử dụng trong nhận dạng cá thể và xác định quan hệ huyết thống nhằm làm tăng thêm khả năng xác định chính xác cá thể và chẩn đoán loại trừ

1.1.2.2 Xác định một số nhóm protein và nhóm enzym

Vào những năm 1970, các nhà khoa học đã tìm ra các yếu tố nhóm protein trong huyết thanh người như hệ thống haptoglobin, hệ thống transferin, hệ thống 2 globulin, hệ thống Group Specific (GS) và các hệ enzym như phosphatase acid, adenilatkinase, lactatdehydrogenase, 6-phosphoglucomutase (PGM) Các hệ thống nhóm này ở các cá thể khác nhau thì khác nhau, do đó chúng cũng là một công cụ hữu hiệu để nhận dạng cá thể người trong pháp y hình sự [80]

Tuy nhiên việc sử dụng các yếu tố di truyền có bản chất protein trong nhận dạng cá thể gặp một số khó khăn như cần nhiều loại kháng huyết thanh đặc hiệu Mẫu xét nghiệm phải còn tươi, mới do các yếu tố nhóm có bản chất protein kém bền vững dưới tác động của các tác nhân như nhiệt độ, độ ẩm, độ

pH, ánh nắng, vi sinh vật Với các mẫu đã cũ hoặc bị phân huỷ thường

không có kết quả hoặc độ chính xác không cao

1.1.3 Nhận dạng cá thể người qua phân tích ADN nhân

Năm 1985 Alec Jeffreys và cộng sự [48] khi nghiên cứu gen mã hóa protein đảm nhiệm chức năng liên kết với oxygen trong cơ đã phát hiện đoạn gen này có một trình tự gồm 33 nucleotit được lặp lại một số lần Jeffreys và cộng sự đã tinh sạch đoạn ADN – “tiểu vệ tinh” này, đưa vào plasmid PUC và giải trình tự một số đoạn của một số người Họ đã chọn, so sánh trình tự của nhiều người và phát hiện ra rằng chiều dài của đoạn ADN nhận được từ mỗi

cá thể khác nhau phụ thuộc vào số lượng của các đoạn lặp Đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể Các “tiểu vệ tinh” này (minisatellite), do có số lượng nucleotit trong đoạn lặp tương đối lớn (từ 7 đến hàng chục nucleotit) được gọi chung là các đoạn đa hình trình tự lặp lại liên tiếp có số lượng thay đổi (Variable Number of Tandem Repeat)

Đó là thời điểm giám định gen chính thức ra đời, khi đó người ta gọi kết quả phân tích ADN theo phương pháp này là ADN Fingerprint (dấu vân ADN), sau này được đề nghị bằng tên khác là “hồ sơ ADN” (ADN profile)

“ADN profile ” hay “ADN fingerprint” là tổ hợp các kiểu gen của một cá thể cần được phân tích trong giám định (hình sự, huyết thống…)

Sau nghiên cứu của Jeffreys, các nghiên cứu về hồ sơ ADN của mỗi người dựa trên tính đa hình của các minisatellite khác nhau đã được thực hiện

ở nhiều phòng thí nghiệm khác nhau Hàng ngàn minisatellite chứa các đoạn lặp liên tiếp từ 2 đến 6 bp được gọi chung là các trình tự lặp lại ngắn liên tiếp (Short Tandem Repeat – STR) nằm rải rác trong các vùng intron đã được công

bố Chúng được sử dụng như những chỉ thị liên kết để tìm các gen gây bệnh Tuy nhiên, một locut STR chỉ có thể sử dụng được cho mục đích nhận dạng cá thể khi thỏa mãn những điều kiện nhất định Thứ nhất, STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao Điều này giúp các nhà phân tích chỉ cần sử dụng ít nhất số lượng STR mà vẫn đáp ứng được yêu cầu và độ tin cậy Thứ

hai, các locut STR phải ít bị biến đổi dưới tác động của môi trường xung quanh như nhiệt độ, độ ẩm, vi sinh vật để đảm bảo sự nguyên vẹn của phân đoạn ADN trong quá trình phân tích Thứ ba, các STR phải di truyền độc lập

do vậy chúng phải nằm trên các NST khác nhau để tránh hiện tượng hoán vị gen trên một NST trong quá trình phân chia tế bào [23]

Mặc dù về lý thuyết, các locut chứa các đoạn lặp 2 – 3 nucleotit ví dụ (CA)n- hoặc - (ATC)n- sẽ có tính đa hình cao hơn so với các locut chứa số đoạn lặp từ 4 hay 5 nucleotit, ví dụ -(ATTA)n- hoặc -(ACTAG)n- nếu chúng

-có cùng độ dài, song vì lý do kỹ thuật và thực tiễn, các locut -có các trình tự 4 nucleotit lặp lại được sử dụng nhiều nhất [22, 23, 80] Các bộ sinh phẩm phân tích STR nhận dạng cá thể hiện nay phần lớn chứa các đoạn lặp 4 nucleotit Những nghiên cứu về VNTR và STR cho thấy, đây là những locut mang tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cho cá thể

Giá trị nhận dạng của phương pháp phân tích ADN phụ thuộc vào số lượng các locut ADN được sử dụng và tần suất phân bố alen của các locut trong quần thể Với một vài locut thì giá trị xác định cá thể ở mức thấp nhưng chúng lại có giá trị loại trừ và sàng lọc Đặc biệt trong nhận dạng với số lượng mẫu xét nghiệm nhiều thì vai trò sàng lọc và loại trừ là rất quan trọng nhằm làm giảm thiểu số mẫu cần xét nghiệm xuống con số nhỏ nhất trước khi đi đến bước cuối cùng trong nhận dạng là xác định cá thể

1.1.4 Phương pháp phân tích ADN ty thể

1.1.4.1 Tính đa hình trình tự ADN ty thể

ADN nằm trong ty thể của tế bào gọi là ADN ty thể ADN ty thể có cấu trúc mạch vòng Sự khác nhau về trình tự hệ gen ty thể của hai cá thể người khác nhau trung bình khoảng 9 đến 66 nucleotit Tỷ lệ đột biến trên ADN ty thể lớn hơn nhiều lần so với ADN nhân Tỷ lệ đột biến cao là kết quả của sự tích luỹ nhiều đột biến thay thế bazơ nitơ trung tính và đặc hiệu cho mỗi quần thể trong ADN ty thể Các đột biến này được tích luỹ liên tục theo thời gian,

truyền theo dòng mẹ và được chia nhánh xấp xỉ với khoảng thời gian các quần thể định cư ở các vùng khác nhau trên thế giới Sự khác nhau của ADN ty thể liên quan tới chủng tộc, dân tộc và nguồn gốc địa lý của các cá thể thể hiện rõ nét hơn rất nhiều so với ADN nhân [22]

1.1.4.2 Phân tích ADN ty thể trong nhận dạng cá thể

Nhận dạng cá thể thông qua phân tích ADN ty thể thường dựa trên sự khác nhau về trình tự vùng D-loop (Displacement loop) hay còn gọi là vùng

HV (Hypervariable) Vùng D - loop có kích thước khoảng 1121 bp, chiếm khoảng 7% hệ gen ty thể, nằm hai bên vị trí "O" Vùng HV gồm 2 vùng HV1

và HV2 Vùng HV1 và HV2 đều có kích thước trên dưới 400bp Nhóm nghiên cứu ADN thuộc các phòng thí nghiệm khoa học hình sự ở Mỹ (TWGDAM) đưa ra tiêu chuẩn phân tích ADN ty thể là trình tự tối thiểu được thừa nhận đối với vùng HV1 từ vị trí nucleotit 16024 đến vị trí 16365 và đối với HV2 từ vị trí 00073 đến 000340 (theo trình tự Anderson và cs đã công bố năm 1981) Gần đây đã có nhiều phòng thí nghiệm phân tích mở rộng tới vùng HV3 hoặc giải trình tự toàn bộ genom ty thể [34, 40, 56]

Tế bào động vật có vú thường chứa từ vài trăm đến 10.000 bản sao của ADN ty thể Vì vậy, mặc dù ADN ty thể chỉ chiếm dưới 1% ADN tổng số của

tế bào nhưng chúng lại có số lượng bản sao lớn

Cùng với số lượng bản sao lớn, một đặc tính khác rất hữu ích để ứng dụng ADN ty thể trong nhận dạng pháp y đó là đặc tính di truyền theo dòng

mẹ Trong quá trình thụ tinh, gần 99,9% ty thể của hợp tử nhận được từ tế bào trứng Vì vậy, những cá thể cùng mẹ và tất cả cá thể liên quan theo dòng mẹ chứa các bản sao ADN ty thể giống nhau Đặc tính đặc biệt nữa của ADN ty thể là tốc độ tiến hoá cao thể hiện ở đột biến nucleotit Mức độ đột biến của

nó cao gấp 5 - 10 lần so với ADN hệ gen nhân [25]

Tuy nhiên, việc sử dụng phương pháp phân tích ADN ty thể trong nhận dạng cá thể người chỉ tiến hành khi không thể thực hiện được phương pháp

phân tích ADN nhân, hay nói cách khác phân tích ADN ty thể là biện pháp cuối cùng được áp dụng [25]

Các đặc tính của ADN ty thể đã giúp nó trở thành công cụ hữu ích cho việc nhận dạng người Mặc dù, các chỉ thị của ADN nhân rất chính xác đối với việc nhận dạng cá thể người, nhưng có một số trường hợp nhất định không thể sử dụng ADN nhân mà phải sử dụng tới ADN ty thể [46, 50, 53,

54, 106], đó là :

- Các mẫu chứa lượng ADN nhân rất hạn chế, chẳng hạn như thân tóc Bởi

vì, trong thân tóc có chứa ADN ty thể và có nhiều bản sao, đó là cơ hội tốt

để thực hiện phản ứng PCR thành công

- Các mẫu xương răng lâu năm là những mẫu bị phân huỷ mạnh ADN ty thể ở dạng mạch vòng, nó ít chịu tác động của enzym phân huỷ hơn so với ADN nhân

- Các mẫu xương răng lâu năm cần xét nghiệm mà mẫu so sánh chỉ còn các

cá thể liên quan họ hàng xa Do ADN ty thể di truyền theo dòng mẹ, chỉ cần cá thể có chung nguồn gốc dòng mẹ thì có thể lấy mẫu để thực hiện việc xét nghiệm

1.2 ADN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH ADN ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƯỜI

1.2.1 Cấu trúc đa dạng trong trình tự ADN có ý nghĩa trong nhận dạng cá thể:

Phân tử ADN có hai loại đa hình [23], gồm:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

SNP (single nucleotide polymorphism) là một chỉ thị ADN có cấu trúc

đa hình theo trình tự gần đây được nhiều nhà khoa học hình sự quan tâm chú

ý Hầu hết các SNP xuất hiện trong quần thể đều có hai alen (bi-allelic) và khác nhau chỉ 1 nucleotit SNP phổ biến nhất trong quần thể là dạng đa hình C/T Ngoài ra cũng xuất hiện dạng đa hình A/G, C/G

Các chỉ thị SNP chiếm 90% trong số các đa hình di truyền ở người và

cứ 500-1000 bazơ thì lại xuất hiện một SNP Có hơn 3.000.000 SNP đã được biết đến thậm chí có ở toàn bộ bộ gen (genome) và tổng số các SNP trên genome người ước tính lên tới trên 10.000.000 Các SNP trên genome người

có tỷ lệ đột biến rất thấp đồng thời cho các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ chỉ từ khoảng 50 đến 150 bp Điều này rất thuận lợi cho các ứng dụng để xác định huyết thống và nhận dạng nạn nhân trong các vụ thảm họa (khi mẫu ADN đã bị biến tính nghiêm trọng)

Tuy nhiên phần lớn các SNP chỉ có hai alen Do vậy để đạt được khả năng phân biệt tới cá thể, cần thiết phải sử dụng số lượng lớn từ 50-80 locut Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về SNP và tần suất alen của chúng ở các quần thể khác nhau nhằm ứng dụng trong nhận dạng cá thể [42, 43, 51, 52,

69, 84, 95, 105] Tuy nhiên cần thiết phải có những nghiên cứu thêm về công nghệ để có thể sử dụng các SNP trong nhận dạng cá thể với chi phí thấp và thời gian phân tích ngắn

- Đa hình theo chiều dài

Đa hình theo chiều dài do một số gốc nucleotit được lặp đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn ADN Ví dụ:

Cá thể thứ nhất: - ATAT ATAT ATAT-  3 đoạn lặp ATAT

Cá thể thứ hai- ATAT ATAT ATAT ATAT -  4 đoạn lặp ATAT Các locut hệ VNTR và STR là những locut chứa các gốc nucleotit lặp lại nhiều lần, thể hiện tính đa hình chiều dài đoạn Ví dụ locut D5S818 là một locut thuộc hệ STR, gồm 4 nucleotit (AGAT) lặp đi lặp lại từ 6 đến 18 lần ở

cỏc cỏ thể khỏc nhau [23] Theo định luật di truyền từ locut cú số lượng 13 alen này cú thể tạo ra (13 x 14)/2 = 91 tổ hợp kiểu gen khỏc nhau Tổ hợp nhiều locut khỏc nhau sẽ cho khả năng phõn biệt cỏ thể càng cao

1.2.2 Kỹ thuật phõn tớch đa hình chiều dài đoạn ADN bằng enzym giới hạn

Kỹ thuật phõn tớch đa hỡnh chiều dài đoạn bằng enzym giới hạn (hay cũn gọi là kỹ thuật RFLP - Restriction Fragment Lengh Polymorphism) được Jeffreys phỏt triển từ năm 1985 [48] nhằm phõn tớch tớnh đa hỡnh của cỏc locut VNTR hay cỏc đoạn minisattelite Kỹ thuật này đũi hỏi phải cắt ADN genome bằng một enzym giới hạn (là enzym cú khả năng nhận biết và cắt phõn tử ADN ở một vị trớ xỏc định) Sau đú người ta cú thể phõn tỏch cỏc đoạn cắt khỏc nhau này theo kớch thước của chỳng nhờ kỹ thuật điện di trờn gel agarose hoặc trờn gel polyacrylamide, tiếp theo chuyển cỏc đoạn ADN từ bản gel lờn màng thẩm tớch (Southern Blot) để thực hiện lai với cỏc mẫu dũ là cỏc đoạn ADN đó đỏnh dấu phúng xạ hoặc đỏnh dấu bằng cỏc chất huỳnh quang khỏc nhau Vị trớ nào cú sự bắt cặp bổ sung với ADN mẫu dũ sẽ được hiển thị bằng cỏc băng tương ứng trờn bản gel Mỗi băng này tương ứng với một alen nờn cú thể được sử dụng để phõn tớch xỏc định cỏ thể

Kỹ thuật này đó trở thành một công cụ hữu hiệu trong xỏc định cỏ thể thời đú Tuy nhiờn, kỹ thuật này cũng bộc lộ một số hạn chế vỡ nú đũi hỏi ADN mẫu phải cũn nguyờn vẹn với một lượng tương đối lớn (≥50ng), đồng thời việc sử dụng cỏc mẫu dũ phúng xạ ảnh hưởng đến sức khỏe của kỹ thuật viờn và gõy ụ nhiễm mụi trường Kỹ thuật này cũng đũi hỏi người thực hiện phải cú tay nghề cao và quỏ trỡnh thao tỏc khú tự động húa

1.2.3 Phương pháp nhân bội ADN (PCR)

PCR là một phương phỏp tổng hợp cỏc trỡnh tự ADN đặc hiệu trong ống nghiệm nhờ enzym được phỏt triển từ năm 1985 bởi Kary Mullis, ngày nay PCR là một kỹ thuật thụng dụng khụng thể thiếu được trong cỏc phũng thớ

nghiệm nghiên cứu y dược và sinh học Nó có rất nhiều ứng dụng: nhân bội số lượng ADN cho giải trình tự, nghiên cứu sự phát sinh loài, phân tích chức năng của gen, chẩn đoán bệnh di truyền, nhận dạng cá thể trong khoa học hình

sự và các kiểm tra huyết thống Bằng công trình này, năm 1993 Kary Mullis nhận được giải Nobel hóa học

Trong quá trình PCR, phân tử ADN mới được tạo ra lại trở thành khuôn cho quá trình tái bản mới Điều này khiến số lượng các phân tử ADN mới tạo thành tăng theo hàm mũ Với kỹ thuật này, người ta có thể nhân bội một hay một vài bản sao của phân tử ADN thành hàng triệu bản sao trong một thời gian ngắn chỉ khoảng vài giờ

Kỹ thuật PCR đã khắc phục được những nhược điểm của kỹ thuật RFLP bởi :

- Độ nhạy và tính đặc hiệu cao

- Không đòi hỏi số lượng lớn ADN và thậm chí có thể sử dụng ADN

đã bị biến tính một phần mà vẫn không ảnh hưởng tới độ chính xác của phân tích

- Dễ tự động hóa trong các máy PCR chuyên dụng, cùng một lúc có thể kiểm tra nhiều locut

1.2.4 Kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR)

PCR đa locut là một dạng khác của kỹ thuật PCR mà trong đó đoạn ADN đích được nhân bội cùng lúc bởi nhiều cặp mồi đặc hiệu cho nhiều locut khác nhau Kỹ thuật này được áp dụng lần đầu vào năm 1988 [23] Trong nhiều trường hợp khi một xét nghiệm ADN cần có kết quả phân tích của 2 hay nhiều locut khác nhau thì kỹ thuật PCR đa mồi giúp giảm chi phí về hóa chất, tiết kiệm đáng kể về thời gian và thao tác thí nghiệm Bởi vậy, trong phân tích hình sự đối với các đoạn ADN đa hình, ngày nay hầu hết các phòng thí nghiệm ở các nước đều thực hiện tối ưu phản ứng PCR đa mồi cho các locut được lựa chọn Năm 1994 bộ phức PCR đa mồi đầu tiên được phát triển

bởi Sở KHHS Anh bao gồm 4 locut TH01, FES/FPS, vWA, và F13A1 Cùng thời gian này, tập đoàn Promega cũng cho ra đời bộ kit thương mại đầu tiên

có khả năng nhân bội đồng thời 3 locut CSF1PO, TPOX, và TH01 thường được gọi là bộ ba CTT (‘CTT’ triplex) [23]

Mục tiêu chính của PCR đa mồi là tối ưu được điều kiện cho tất cả các cặp mồi trong một phản ứng sao cho các sản phẩm PCR đều được nhân bội với số lượng nhiều nhất và dễ dàng nhận biết chúng bằng các phương pháp điện di Bởi vậy, tỷ lệ các thành phần trong phản ứng PCR có ảnh hưởng rất lớn đến sản phẩm Tuy nhiên, không phải lúc nào các sản phẩm PCR cũng hiện diện như mong muốn Trong rất nhiều trường hợp, khi PCR đơn mồi thành công nhưng khi phối hợp đa mồi, một số locut không có sản phẩm PCR

Vì vậy, để xây dựng được quy trình PCR đa mồi phù hợp, một số tác giả đã đưa ra những hướng dẫn cụ thể [25, 72-74]

1.2.5 Kỹ thuật điện di

Cơ sở của kỹ thuật này là hiện tượng di chuyển của các phần tử tích điện như các phân đoạn ADN, ARN, hay các phân tử protein trong điện trường Sự chuyển động của các phần tử phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó

có khối lượng và kích thước của phần tử Trong trường hợp của những đoạn ADN có kích thước khác nhau sẽ có tốc độ chuyển động khác nhau trong điện trường, tạo nên những băng khác nhau trên gel điện di Kỹ thuật này thường được sử dụng cho mục đích phân tích, song ở một số trường hợp nó được sử dụng như một kỹ thuật tiền đề để tiến hành các kỹ thuật khác như đo phổ khối, RFLP, PCR, giải trình tự ADN, hay kỹ thuật Southern blot để tìm hiểu các đặc tính chi tiết hơn của phân tử

Trên thực tế, hai kỹ thuật điện di được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm hiện nay là điện di trên gel agarose và điện di trên gel polyacrylamide

Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có những điểm nổi bật hơn so với gel agarose do:

- Khả năng phân tách tốt hơn, có khả năng phân biệt các đoạn có kích thước chênh lệch nhỏ thậm chí tới 1 base nitơ đối với các đoạn ADN

- ADN tách chiết từ bản gel polyacrylamide rất tinh khiết và có thể được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau

Sau khi quá trình điện di hoàn tất, các phân tử trên bản gel phải được nhuộm để có thể dễ dàng quan sát được Có nhiều phương pháp nhuộm khác nhau, trong đó một số phương pháp cơ bản bao gồm:

- Nhuộm ethidium bromide (với phương pháp điện di trên gel agarose)

Nhuộm ethidium bromide có thể phát hiện băng ADN trên cả gel agarose và gel polyacrylamide Trên cơ sở chất này có khả năng xen vào sợi kép ADN và hiện lên trên ảnh chụp khi chiếu tia UV Ưu điểm của phương pháp này là nhanh chóng, ít tốn kém nên được sử dụng phổ biến Song ethidium bromide là hóa chất có khả năng gây ung thư do vậy cần thận trọng khi sử dụng

- Nhuộm bạc (điện di trên gel polyacrylamide)

Quá trình nhuộm bạc bao gồm nhiều công đoạn, trong đó cả bản gel sẽ được nhuộm bằng nhiều hóa chất khác nhau Những vị trí có ADN sẽ bắt cặp với bạc và được hiện trên bản gel Tuy nhược điểm của phương pháp là phải thực hiện qua nhiều công đoạn khác nhau, song ưu điểm của nó là sử dụng các hóa chất ít độc hại hơn đồng thời độ nhạy với các trình tự ADN có kích thước nhỏ cũng cao hơn, có thể phát hiện được 15 pg/băng ADN nghĩa là gấp 60-70 lần so với phương pháp nhuộm ethidium bromide [96] Bản gel sau khi được

cố định có thể giữ được trong một thời gian dài, thậm chí có thể tách ADN từ các băng trên bản gel này để tiến hành tinh sạch và làm khuôn cho PCR [26]

- Sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh quang

Phương pháp này thường được sử dụng trong nhân bội các đoạn ADN đặc hiệu, trong đó các cặp mồi sử dụng trong PCR được gắn với chất phát quang [96] Sản phẩm sau khi nhân bội được điện di trực tiếp trên máy đọc huỳnh quang tự động Trên cơ sở đó, máy sẽ phát hiện được các băng ADN

Ưu điểm của phương pháp này là có khả năng phát hiện băng ADN với độ nhạy cao Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là đòi hỏi thiết bị và hóa chất đồng bộ, giá trị của các máy đọc huỳnh quang tương đối cao

- Sử dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ

Phương pháp này sử dụng các mồi hay các dNTP có gắn đồng vị phóng

xạ P32 hay S35 Sau khi điện di, các băng được hiện bằng cách áp lên phim X quang dưới tác dụng của tia phóng xạ Ưu điểm của phương pháp này có độ nhạy rất cao, nhưng nhược điểm của nó là cần nhiều trang thiết bị, hóa chất đồng thời có thể gây độc hại cho kỹ thuật viên [96]

1.2.6 Kỹ thuật giải trình tự

Để nghiên cứu các trình tự nucleotit trong một đoạn ADN chưa biết, người ta cần thực hiện giải trình tự Giải trình tự là phương pháp đánh giá trực tiếp trình tự, số lượng nucleotit của một đoạn ADN, như vậy phương pháp này cho thông tin đầy đủ nhất về đoạn ADN cần đánh giá Trong nghiên cứu hình

sự, giải trình tự được thường thực hiện khi cần xác định kiểu gen (haplotype) trên ADN ty thể hay khi xác định đột biến có liên quan tới các alen đa hình STR, SNP hoặc xác định cấu trúc của một alen mới…[ 23, 32, 50, 64, 91, 94]

Hiện nay, giải trình tự được thực hiện chủ yếu dựa trên các thiết bị điện

di mao quản do một số hãng sản xuất như ABI (Mỹ), Becman Counter (Đức) trên nguyên lý đọc huỳnh quang Mỗi loại dideoxynucleotit được đánh dấu bằng một loại chất phát huỳnh quang màu khác nhau (xanh, lục, đỏ, vàng) Các đoạn ADN mang các nucleotit đánh dấu huỳnh quang khi chạy qua mao quản sẽ được quét bởi ánh sáng kích thích của tia lazer có trong thiết bị và tín

hiệu phát quang của mỗi loại nucleotit sẽ được thu nhận và phân tích bởi phần mềm riêng biệt

Gần đây, song song với giải trình tự bằng kỹ thuật điện di mao quản, đã

có những nghiên cứu mới về công nghệ giải trình tự để có thể nâng cao độ chính xác và hiệu suất phân tích Nhiều tác giả đã và đang thử nghiệm ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (NGS, next generation sequencing) trong các lĩnh vực khác nhau như xác định đột biến, xác định bệnh, nghiên cứu giải trình tự bộ gen vi rut, vi khuẩn, phân tích ADN đa hình cho nhận dạng cá thể… [37, 58, 63, 82, 99, 105] Công nghệ mới cho phép phân tích đồng thời hàng trăm locut STR trên cả nhiễm sắc thể thường và nhiễm sắc thể giới tính [28, 82, 83, 93, 106, 107] Công nghệ NGS được thực hiện dựa trên nguyên lý tổng hợp trực tiếp đồng thời với việc thu thập dữ liệu hình ảnh

Hiện nay một số thiết bị giải trình tự đang bước đầu được ứng dụng thử nghiệm ở các nước khác nhau ở Việt Nam, có thể kể đến như hệ thống giải trình tự Ion Torrent của ABI, MySeq, HiSeq … của Illumina (Mỹ)

1.3 CÁC LOCUT STR TRONG HỆ GEN NGƯỜI VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ

1.3.1 Khái niệm các đoạn lặp và STR

Khi nghiên cứu về cấu trúc ADN của sinh vật nhân chuẩn và một số sinh vật nhân sơ người ta thấy các đoạn mã hóa và các đoạn không mã hóa Trong các đoạn không mã hoá chứa các trình tự lặp lại Các đoạn ADN chứa trình tự lặp lại này khác nhau về kích thước Chúng mang tính đặc trưng về chiều dài các đơn vị lặp lại và số lượng những đơn vị lặp lại liên tục trên toàn

bộ chiều dài đoạn ADN Người ta chia các trình tự này làm 3 loại [23]

- Các trình tự lặp lại nhiều lần chiếm 10 - 15% bộ gen người Đó là những trình tự lặp lại có kích thước khoảng 10 - 20kb, thường tập trung ở vùng tâm động hoặc ở đầu nhiễm sắc thể

- Các trình tự có số lần lặp lại trung bình chiếm khoảng 25 - 40% bộ

gen người Chúng có kích thước lớn hơn (100 - 1000bp) và đa dạng hơn những trình tự lặp lại nhiều lần, các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ hệ gen

- Các trình tự đơn: đó là các trình tự mã hóa cho các protein, có trình tự đặc trưng cho từng gen

Các đoạn ADN có các trình tự lặp từ 10 - 100 nucleotit gọi là VNTR,

ví dụ locut D1S80 có đoạn lặp là bội số của 16 nucleotit, locut này chứa các alen từ số đơn vị lặp lại 14 lần đến 41 lần Trình tự lặp lại là GAGGA CCACCAGGAAG

Các đoạn ADN có cấu trúc lặp lại từ 2 - 6bp được gọi là các đoạn lặp lại ngắn (STR) Các cấu trúc VNTR hay STR mang tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và tính đặc trưng cá thể Các VNTR và STR có thể được nhân bội bằng phản ứng PCR

1.3.2 Cơ sở khoa học của phân tích STR trong nhận dạng cá thể và xác định huyết thống

Năm 1956, Joe Hin Tjio và Albert Levan đã xác định chính xác ở người, trong nhân tế bào (thể lưỡng bội) có 46 cặp nhiễm sắc thể được xếp thành 23 cặp tương đồng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể giới tính Riêng tế bào trứng và tinh trùng chỉ có 23 nhiễm sắc thể (tế bào đơn bội) Sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào thường là 46 Bộ nhiễm sắc thể được bảo tồn và di truyền

từ thế hệ này sang thế hệ khác Thế hệ con cái bao giờ cũng thừa hưởng các đặc tính di truyền thông qua gen của cả bố và mẹ với xác suất ngang nhau Điều đó có nghĩa là 23 nhiễm sắc thể từ bố được truyền cho con thông qua tinh trùng, 23 nhiễm sắc thể từ mẹ truyền cho con thông qua trứng Các locut STR nằm trên nhiễm sắc thể cũng theo đó mà được di truyền qua các thế hệ (hình 1.1)

Hình 1.1 Sơ đồ minh hoạ các khả năng di truyền một số alen thuộc locut STR từ bố, mẹ cho con theo định luật Mendel

(8 - 12: một số alen thuộc locut STR [23]) 1.3.3 Cấu trúc của STR và danh pháp quốc tế

Tên các locut chỉ thị ADN được đặt theo tên của gen nếu locut này

nằm ở một phần hoặc nằm toàn bộ trong gen [23]; ví dụ locut TH01 ở gen tyrosine hydroxylase của người nằm trên nhiễm sắc thể số 11 Chữ "TH" xuất phát từ chữ cái đầu Tyrosine hydroxylase Phần "01" của ký hiệu "TH01" xuất phát từ vùng intron 1 (vùng không mã hóa protein) của gen Tyrosine hydroxylase Đôi khi tiếp đầu ngữ HUM được thêm vào đầu danh pháp của locut này để xác định đó là từ bộ gen người (human) Vì vậy locut STR này sẽ được gọi chính là HUM TH01 hay TH01

Các chỉ thị ADN mà nằm ngoài vùng gen thì được xác định bởi vị trí của chúng trên nhiễm sắc thể Ví dụ, STR locut D5S818 và DYS19 đó là những locut không nằm trong vùng gen Trong trường hợp này chữ "D" có nghĩa là ADN Con số tiếp theo là số thứ tự của nhiễm sắc thể Chữ "S" thực chất là trình tự đơn lẻ của ADN Con số cuối cùng là vị trí locut nằm trên mỗi nhiễm sắc thể riêng biệt Con số này là duy nhất đối với mỗi locut ADN sử dụng trong nhận dạng cá thể Ví dụ, locut D16S539 có nghĩa là D: ADN; 16: Nhiễm sắc thể số 16; S: single copy sequence; 539: vị trí thứ 539 được xác định trên nhiễm sắc thể 16

Các trình tự STR được đặt tên dựa trên độ dài của đơn vị lặp Trình tự lặp lại 2 nucleotit có các nucleotit lặp lại liên tục gần nhau Trình tự lặp lại 3 nucleotit có 3 nucleotit trong một đơn vị lặp Tương tự đối với các trình tự lặp lại 4, 5, 6 cũng có 4, 5, 6 nucleotit trong một đơn vị lặp tương ứng

Về mặt lý thuyết, có 4, 16, 64, 256, 1024, 4096 khả năng hình thành các kiểu cấu trúc (motif) đối với các trình tự lặp 1, 2, 3, 4, 5 và 6 nucleotit tương ứng Tuy nhiên do các microsatellite có tính chất lặp lại ngẫu nhiên nên một số dạng cấu trúc được coi là giống nhau Hiện nay trình tự lặp lại 4 nucleotit (tetranucleotide) được sử dụng phổ biến trong nhận dạng cá thể

người

Các trình tự STR rất đa dạng về chiều dài đoạn lặp và số lượng đoạn lặp Chúng được chia thành nhiều kiểu khác nhau dựa trên kiểu cấu trúc lặp [23, 25]

- Kiểu lặp lại đơn giản (simple repeats) có đơn vị lặp giống nhau về

chiều dài và trình tự

- Kiểu lặp phức (compound repeats) bao gồm hai hoặc nhiều hơn các

đơn vị lặp lại đơn giản liền kề nhau

- Kiểu lặp lại phức tạp (complex repeats) có thể bao gồm các khối lặp lại

có chiều dài và trình tự đơn vị lặp khác nhau và các trình tự không lặp lại xen kẽ

- Kiểu lặp lại siêu biến (complex hypervariable repeats) mang vô số các

alen không đồng nhất, các alen này khác nhau về cả kích thước và trình tự do đó rất khó xác định kiểu gen Loại này không được sử dụng phổ biến trong phân tích hình sự do khó khăn trong việc đặt tên cho các alen và thống nhất giữa các phòng thí nghiệm, mặc dù đã có 2 bộ kit

thương mại có chứa locut này là SE33, còn gọi là ACTBP2 [23]

Không phải tất cả các alen của locut STR đều mang đơn vị lặp lại hoàn

hảo Thậm chí cả kiểu đơn vị lặp lại đơn giản (simple repeats) cũng mang

những alen không đồng nhất, các alen này nằm xen giữa các alen có đơn vị

lặp lại đầy đủ Những alen này được gọi là các biến thể (microvariants) Allen

9,3 của locut TH01 là một ví dụ Alen này bao gồm 9 đơn vị lặp lại 4 nucleotit và 1 đơn vị lặp lại không hoàn toàn chứa 3 nucleotit do đơn vị lặp lại

số 7 bị mất 1 nucleotit andenin, khác với các đơn vị lặp bình thường AATG 1.3.4 Vai trò của các STR trong phân tích hình sự

Các locut STR trở thành các chỉ thị ADN phổ biến bởi đặc tính dễ dàng nhân bội đồng thời qua phản ứng PCR, không phải thực hiện nhân bội riêng

rẽ như đối với các locut VNTR Đặc điểm này là do các alen của locut STR nằm trong một khoảng kích thước tương đương, khoảng vài trăm bp, các đơn

vị lặp lại có kích thước nhỏ Hơn nữa, số đơn vị lặp của các chỉ thị STR rất khác nhau giữa các cá thể, điều này làm cho chúng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhận dạng cá thể

Với mục đích sử dụng cho nhận dạng cá thể, điểm quan trọng đối với

các chỉ thị ADN là có tính đa hình càng cao càng tốt hoặc một số chỉ thị có tính đa hình thấp hơn có thể kết hợp với các chỉ thị khác để đạt được đủ độ tin cậy phân biệt giữa các cá thể

Một hạn chế đối với các mẫu hình sự là việc nhân bội gặp khó khăn do ADN trong mẫu có thể bị phân huỷ mạnh (tạo thành các đoạn nhỏ) Những hỗn hợp gồm nhiều mẫu (mẫu lẫn) thường có mặt nhiều trong các vụ án như mẫu thu từ các vụ xâm hại tình dục mang các vật liệu sinh học từ cả thủ phạm

và nạn nhân Kích thước alen nhỏ của các locut STR (khoảng 100-400bp) so với các alen của VNTR (khoảng 400-1000bp) khiến các STR dễ dàng được lựa chọn hơn cho mục đích ứng dụng trong hình sự phù hợp với các mẫu ADN biến tính

Hơn nữa, việc phân tách các bazơ nitơ của các đoạn ADN có thể thực hiện dễ dàng với các đoạn có kích thước dưới 500bp khi sử dụng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide biến tính Vì vậy, về mặt sinh học và công nghệ, các chỉ thị STR với kích thước nhỏ hơn có ưu điểm hơn so với các chỉ thị VNTR có kích thước lớn

Trong số các dạng lặp khác nhau của hệ STR, các đoạn lặp 4 nucleotit được sử dụng phổ biến hơn các đoạn lặp hai hoặc ba nucleotit Dạng lặp 5 và

6 nucleotit ít phổ biến hơn trong genome người

Sử dụng các STR có đơn vị lặp 4 nucleotit (tetranucleotide STR) trong hình sự có những thuận lợi so với các VNTR hoặc các STR 2 và 3 nucleotit vì:

- Khoảng kích thước giữa các alen nhỏ vừa phải phù hợp cho phản ứng PCR phức

- Khoảng kích thước giữa các alen nhỏ vừa phải làm giảm khả năng mất alen đối với các alen có kích thước nhỏ hơn

- Khả năng tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ thuận lợi cho việc phân tích các mẫu ADN đã biến tính

- Việc giảm các sản phẩm “stutter” (băng giả) so với các dinucleotit thuận lợi cho việc đọc kiểu gen đối với các mẫu lẫn

Các tiêu chí để lựa chọn locut STR ứng dụng cho nhận dạng cá thể như

- Có thể phối hợp tốt với các chỉ thị khác trong phản ứng multiplex

- Xác định các mối quan hệ huyết thống trực hệ (cha - mẹ - con): Sử dụng các locut STR trên nhiễm sắc thể thường

- Xác định các mối quan hệ huyết thống không trực hệ :

+ Xác định huyết thống theo dòng cha: Sử dụng các locut STR trên nhiễm sắc thể Y (Y-STR)

+ Xác định huyết thống sử dụng các locut STR trên nhiễm sắc thể X (xác định huyết thống bà – cháu hay anh, chị em trong các trường hợp đặc biệt: không còn cha, mẹ …)

Trong xác định huyết thống, việc lựa chọn và sử dụng locut STR nào

và số lượng locut STR cần sử dụng là bao nhiêu sẽ quyết định độ chính xác đối với kết quả giám định Để xác định độ chính xác của một trường hợp xác

định huyết thống (bố - mẹ - con), người ta thường dựa trên chỉ số PI (paternity index) Chỉ số PI được xác định dựa trên tần suất alen của locut STR khảo sát được trong quần thể [23] PI sẽ được xác định đối với từng locut, sau đó cần tính toán để xác định chỉ số tiếp theo là CPI (combined paternity index) Chỉ

số CPI được tính như sau [97]:

CPI = PI(1) x PI (2) x ….PI (n), trong đó:

PI: Chỉ số quan hệ huyết thống

CPI: Chỉ số quan hệ huyết thống kết hợp

PI (1), PI (2), PI (n): Chỉ số PI của locut thứ nhất, locut thứ hai và locut thứ n

Đây là chỉ số để xác định mối quan hệ huyết thống khi phối hợp PI của tất cả các locut STR đã phân tích Chỉ số CPI thể hiện mối quan hệ huyết thống giữa hai cá thể được xác định CPI càng cao, độ tin cậy càng lớn Điều này có nghĩa muốn đạt được chỉ số CPI cao, cần có sự lựa chọn phối hợp đủ

số lượng các locut STR với nhau, hơn nữa, các locut STR được lựa chọn cũng phải là các locut có tính đa hình tương đối cao trong quần thể

Từ kết quả của chỉ số CPI, có thể xác định độ chính xác của trường hợp giám định huyết thống Chỉ số CPI của ca xét nghiệm được công nhận là khác nhau đối với từng quốc gia Tuy nhiên, thông thường để kết luận không loại trừ một trường hợp xác định huyết thống, chỉ số PI tối thiểu cần đạt là 100 [23, 97]

Hiện nay, tại Việt Nam cũng như ở các nước trên thế giới, số lượng các locut được sử dụng để xác định huyết thống thông thường là từ 16 đến 24 locut [30, 35, 79]

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các locut STR đang sử dụng phổ biến ngày nay được nghiên cứu phân loại và phát triển tại phòng thí nghiệm của TS Thomas Caskey – trường ĐH

Y và tại Sở KHHS Anh Tập đoàn Promega (Madison, Wisconsin) đã thương

mại hoá các locut do Caskey nghiên cứu, còn tập đoàn Applied Biosystems (Foster City, California) lại lựa chọn những locut STR của Sở KHHS Anh (FSS) đồng thời phát triển một số locut mới [23]

Một trong những bộ PCR phức được phát triển đầu tiên đó là phức 4 locut do Sở KHHS Anh nghiên cứu, bao gồm 4 locut TH01, FES/FPS, vWA,

và F13A1 Bộ kit này được gọi là “phức thế hệ 1” (first-generation multiplex),

có khả năng trùng lặp 1/10.000 Tiếp đó là bộ phức thế hệ thứ 2 generation multiplex - SGM) bao gồm 6 locut STR đa hình và 01 locut giới tính [23] 6 locut STR bao gồm TH01, vWA, FGA, D8S1179, D18S51, và D21S11cho khả năng trùng lặp khoảng 1/50 triệu

(second-* Hệ thống các locut STR chủ đạo của Mỹ

Vào đầu năm 1996, Phòng thí nghiệm FBI – Mỹ đã tài trợ cho việc nỗ lực thành lập các locut “chủ đạo” STR (core STR loci) để sử dụng cho CSDL nhận dạng ADN, được gọi là CODIS (Combined DNA Index System) Dự án bắt đầu từ tháng 4/1996 và kết thúc vào tháng 11/1997, có liên quan tới 22 phòng thí nghiệm phân tích ADN với 17 locut STR được đánh giá Sau dự án này, 13 locut STR đã được chọn làm các locut chính cho việc thành lập CSDL ADN quốc gia CODIS [23] 13 locut bao gồm CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, and D21S11 Khả năng trùng lặp trung bình được tính toán khi sử dụng 13 locut là 1/1000 tỷ trong số các cá thể không có quan hệ họ hàng huyết thống [73]

Hiện nay, để đạt được độ tin cậy cao hơn cho nhận dạng cá thể đồng thời thuận tiện hơn cho việc trao đổi thông tin với tổ chức hình sự các nước,

Mỹ đã nghiên cứu bổ sung và dự kiến sau 1/1/2017 sẽ mở rộng hệ thống các locut STR chủ đạo từ 13 đến 20 locut 7 locut được nghiên cứu bổ sung gồm D1S1656, D2S441, D2S1338, D10S1248, D12S391, D19S433 và D22S1045 [38, 39] Bên cạnh đó, tổ chức Interpol, châu Âu và các nước như Anh, Đức, Hàn Quốc … cũng chọn cho mình hệ locut chủ đạo riêng với số locut STR trong tổ hợp từ 7 đến 16 locut [24, 101]