Đề tài thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu để có thể nhân bản và phân tích được tính đa hình một số locus STR chọn lọc bổ sung; xây dựng thang alen chuẩn cho các locus F13A01; D8S1179 và HPRTB; điều tra, khảo sát tính đa hình và xác định được tần số phân bố các alen thuộc 15 locus STR của người Việt,... Mời các bạn cùng tham khảo.
MỞ ĐẦU Cơng nghệ phân tích ADN sử dụng locus STR trở thành công cụ đắc lực phân tích nhận dạng cá thể người giám định huyết thống nhiều quốc gia khác giới Tại Việt Nam từ năm 1998 trở lại có phát triển mạnh mẽ nhanh chóng trình độ khả ứng dụng kỹ thuật phân tích ADN sử dụng hệ locus STR Đã có nhiều nghiên cứu hệ locus STR nhiễm sắc thể thường NST giới tính Nhiều KIT chuẩn sử dụng locus STR ứng dụng, KIT sử dụng phù hợp với công nghệ khác tuỳ thuộc vào điều kiện cụ thể PTN Để chủ động cơng nghệ phân tích phù hợp với điều kiện PTN Việt Nam, từ năm 2001 đến nay, Viện Kỹ thuật Hoá-Sinh Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục Hậu cần - Kỹ thuật - Bộ Công an nghiên cứu chế tạo thành cơng KIT phân tích đa gen sử dụng locus đa hình STR Các kết nghiên cứu ứng dụng tốt trong phân tích gen hình số sở giám định công an địa phương như: Hà Nội, Hải Phịng, Thanh Hóa, Cần Thơ, Khánh Hịa Tuy nhiên, dừng lại phân tích gen thực tế cho thấy nhiều trường hợp giám định cụ thể, đặc biệt ca giám định phức tạp (trường hợp giám định huyết thống xác định tội phạm tình dục có nghi can nhiều người mà người lại có quan hệ huyết thống, họ hàng ) chưa cho kết đáng tin cậy Do vậy, xác định việc mở rộng nghiên cứu để tăng số lượng locus yêu cầu cần thiết, đồng thời cần có đánh giá tổng thể tần suất phân bố locus STR quần thể người Việt để đưa hướng ứng dụng phù hợp Đề tài luận án “Nghiên cứu số locus đa hình STR người Việt Nam nhằm sử dụng khoa học hình sự, nhận dạng cá thể xác định huyết thống” tiến hành với mục tiêu sau: Thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân phân tích tính đa hình số locus STR chọn lọc bổ sung (F13A01; D8S1179 HPRTB) Xây dựng thang alen chuẩn cho locus F13A01; D8S1179 HPRTB Điều tra, khảo sát tính đa hình xác định tần số phân bố alen thuộc 15 locus STR người Việt (D5S1358, D7S820, D13S317, CSF1PO, TH01, TPOX, D16S539, D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01; D8S1179 HPRTB) Đánh giá đề xuất locus STR định hướng ứng dụng nhận dạng cá thể xác định huyết thống phù hợp với người Việt Nam Ý NGHĨA THỰC TIỄN VÀ ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Nghiên cứu xây dựng điều kiện tối ưu để phân tích tổ hợp locus đa hình F13A01, D8S1179, HPRTB Amelogenin nhân bội đồng thời phản ứng Bổ sung cho tổ hợp locus nghiên cứu, góp phần làm tăng độ xác phân tích nhận dạng cá thể người giám định huyết thống phù hợp với điều kiện PTN Việt Nam - Bổ sung số liệu khảo sát tần suất alen 15 locus đa hình người Việt, khảo sát 07 alen locus F13A01 07 alen locus HPRTB, phát thêm alen quần thể người Việt alen số locus CSF1PO; alen số 13 locus vWA alen số 15 locus FES/FPS - Đánh giá khả ứng dụng 15 locus STR quần thể người Việt qua tính tốn số thống kê BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 121 trang trang phụ lục, bố cục sau: mở đầu trang; tồng quan 27 trang; vật liệu phương pháp nghiên cứu 13 trang; kết thảo luận 69 trang; kết luận, kiến nghị trang; danh mục cơng trình khoa học cơng bố trang CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 CÁC PHƢƠNG PHÁP NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƢỜI Các phương pháp giám định nhận dạng cá thể người nghiên cứu từ trước tới bao gồm: - Phương pháp hình thái học Nhận dạng cá thể yếu tố có chất protein (Xác định nhóm máu, xác định số nhóm protein nhóm enzym) - Nhận dạng cá thể người qua phân tích ADN nhân ADN ty thể Việc sử dụng phương pháp nhận dạng cá thể tuỳ thuộc vào loại mẫu, số lượng chất lượng mẫu (bao gồm mẫu giám định nhận dạng mẫu so sánh), số lượng cá thể cần nhận dạng, trang thiết bị sở giám định trình độ chun mơn giám định viên Hiện nay, với phát triển không ngừng khoa học kỹ thuật công nghệ, đặc biệt sau phát minh phản ứng PCR đời, việc nhận dạng cá thể người phương pháp phân tích ADN nhân trở thành công cụ đắc lực giám định ưu việt bật nó, đặc biệt phương pháp trở nên hữu dụng hình sự, mà dấu vết thu trường lại bị biến tính, khơng thể tiến hành phương pháp nhận dạng truyền thống 1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH ADN ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƢỜI Việc phân tích ADN nhận dạng tiến hành dựa nguyên lý chung: ADN tách khỏi tế bào (có mẫu sinh học thu được), sau đoạn ADN nhân lên cặp mồi đặc hiệu sản phẩm nhân bội phân tích kỹ thuật điện di hay giải trình tự Kết điện di hiển thị nhờ hệ thống thiết bị phù hợp, cho biết kiểu gen cá thể cần phân tích Các kỹ thuật ứng dụng bao gồm: - Kỹ thuật PCR - Kỹ thuật điện di - Kỹ thuật giải trình tự 1.3 CÁC LOCUS STR TRONG HỆ GEN NGƢỜI VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ Các đoạn ADN có cấu trúc lặp lại từ – bp gọi đoạn lặp lại ngắn (STR) Các cấu trúc STR mang tính bảo thủ cao, di truyền qua hệ mang tính đặc trưng cá thể Các STR khuếch đại phản ứng PCR Trong số dạng lặp khác hệ STR, đoạn lặp nucleotit sử dụng phổ biến đoạn lặp nucleotit vì: - Khoảng kích thước alen nhỏ vừa phải phù hợp cho phản ứng PCR phức - Khoảng kích thước alen nhỏ vừa phải làm giảm khả alen alen có kích thước nhỏ - Khả tạo sản phẩm PCR có kích thước nhỏ thuận lợi cho việc phân tích mẫu ADN biến tính - Việc giảm sản phẩm “stutter” (băng giả) so với dinucleotit thuận lợi cho việc đọc kiểu gen mẫu lẫn CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Mẫu sinh phẩm 250 mẫu máu cá thể người Việt khỏe mạnh, khơng có quan hệ họ hàng (bao gồm 48 nữ 202 nam) thu Hải Phòng bảo quản thẻ bảo quản mẫu có tẩm hóa chất lưu giữ -20oC 2.1.2 Các locus gen đa hình STR Đề tài lựa chọn 15 locus gen đa hình STR bao gồm: locus D5S818, D7S820, D13S317; CSF1PO, TPOX, TH01; D3S1358, D16S539, vWA; F13A01, D8S1179; HPRTB; F13B; FES/FPS; LPL 01 locus xác định giới tính Amelogenin 2.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp thiết kế mồi sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer Premier để thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho locus STR F13A01, D8S1179 HPRTB - Phương pháp tách chiết ADN sử dụng Chelex - Phương pháp PCR - Phương pháp điện di phân tích sản phẩm PCR gel agarose gel PA biến tính có ure - Phương pháp chế tạo thang alen gồm bước sau: + Khảo sát, tìm kiếm alen locus nghiên cứu + Lựa chọn tiến hành phản ứng PCR kiểu gen có chứa alen cần thiết cho việc tạo thang alen locus cần nghiên cứu + Tinh alen + Xác định (định danh) alen theo quy ước quốc tế + Tạo thang alen phương pháp PCR - Phương pháp PCR nhiều cấp (multi-generation amplification) để tạo thang alen: + Đối với locus, sau tinh alen, tiến hành phối trộn alen theo tỷ lệ thể tích thực PCR sử dụng mồi đặc hiệu locus theo chu trình nhiệt tối ưu Đây thang alen hệ I + Sử dụng thang alen hệ I pha loãng thành nồng độ 1/1.000; 1/5.000 1/10.000 Tiếp tục PCR sử dụng l sản phẩm pha lỗng làm khn, thu thang alen hệ II + Sử dụng thang alen hệ II tương ứng với khn pha lỗng 1/10.000 để pha loãng thành nồng độ tương tự thực PCR, thu thang alen hệ III - Phương pháp xác định trình tự nucletotide - Phương pháp khảo sát tần suất alen xử lý số liệu số thống kê CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.THIÕT KÕ MåI Vµ Tèi -u PCR phøc locus F13A01, D8S1179, Amelogenin, HPRTB (FDAH) 3.1.1 Kết thiết kế mồi : Sử dụng phần mềm Primer Premier thiết kế cặp mồi đặc hiệu để sử dụng nhân bội đồng thời locus : F13A01, D8S1179, Amelogenin v HPRTB (bng 3.1) Bảng 3.1 Trình tự thông số cặp mồi locus F13A01, D8S1179, HPRTB vµ Amelogenin Locus Loại mồi F F13A01 D8S1179 Amelogenin HPRTB Trình tự mồi 5’ - AGC CCC AAG GAA GAT GAG T- 3’ Tm (0C) Kích thước sản phẩm PCR (bp) 55.8 279 - 335 (alen 17) R 5’ - GGC ATG CAC CTG TAG TTC CA- 3’ 59.0 F 5’ - GCC AGA AAC CTC TGT AGC CA- 3’ 57.7 227 - 271 58.7 (alen 20) R 5’ - ATC GTA TCC CAT TGC GTG AA- 3’ F 5'- ACC TCA TCC TGG GCA CCC TGG-3' R 5'- AGG CTT GAG GCC AAC CAT CAG -3' F 5’ - TTC CAT CTC TGT CTC CAT CTT TG - 3’ R 5’ - ACA CAT CCC CAT TCC TGC C - 3’ 212- 218 58.6 159 - 203 59.9 (alen 18) Sản phẩm PCR nhân bội cặp mồi kiểm tra kích thước phù hợp tính đặc hiệu qua kết điện di gel agarose (hình 3.1) M50 M50 ĐC (-) M50 M50 ĐC (-) 250bp 200bp (M50: marker 50bp; Giếng 1, 2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi locus F13A01; Giếng 3, 4: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi locus D8S1179; Giếng 5, 6: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi locus Amelogenin; Giếng 7, 8: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi locus HPRTB; ĐC(-):mẫu đối chứng âm) Hình 3.1 Kết PCR kiểm tra cặp mồi locus F13A01, D8S1179, Amelogenin HPRTB 3.1.2 Kết tối ƣu phản ứng PCR phức locus: Các cặp mồi sử dụng để tối ưu phản ứng PCR phức (multiplex PCR) sản phẩm PCR điện di gel polyacrylamide biến tính Kết thu sau: * Kết tối -u thành phần PCR cho phức locus FDAH dNTP: 400 M; MgCl2 : mM; Đệm phản ứng: 2X; ADN khuôn: ng; Taq ADN-polymerase : U; Nång ®é måi F13A01 : D8S1179 : AME : HPRTB 0,8M : 0,8M : 0,4M : 0,8M * Kết tối -u chu trình nhiệt cho ph¶n øng PCR phøc locus FDAH: 95oC - (1 chu kú); 94oC- phót; 60oC - phót; 72oC - (35 chu kú); 72oC - 10 (1 chu kú) 3.2 ChÕ t¹o thang alen locus F13A01, D8S1179, Amelogenin, HPRTB (FDAH) 3.2.1 KÕt qu¶ chế tạo thang alen locus F13A01 Chúng đà lựa chọn đ-ợc alen : alen số 3.2; 4; 5; 6; vµ Kích thước số đoạn lặp alen xác định vào mẫu K562 có kiểu gen dị hợp tử 4-5 kết giải trình tự 03 alen 3.2; v Kết xác định trình tự phù hợp với tài liệu đà công bố alen đà lựa chọn từ locus F13A01 đ-ợc tinh kết hợp nhân bội cùngphản ứng PCR Kết nhân bội (hình 3.2) cho thấy: Thang alen hệ (nhân bội nồng độ pha loÃng khác nhau) có chất l-ợng nhnhau, thể băng phân tách rõ gel ®iƯn di M20 ĐC (-) ĐC (-) ĐC (-) K562 300bp Alen Alen 280bp Hình 3.2 Kết chế tạo thang alen cho locus F13A01 (Giếng 1: Thang alen hệ I; Giếng 2, 3, 4: Thang alen hệ II; Giếng 6, 7: Thang alen hệ III ĐC (-): mẫu đối chứng âm PCR M20: marker 20bp) 3.2.2 Kết chế tạo thang alen locus D8S1179 Chúng đà lựa chọn đ-ợc 10 alen : lµ alen sè 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18 Kích thước số đoạn lặp alen xác định vào mẫu K562 có kiểu gen đồng hợp tử 12-12 kết giải trình tự 02 alen : alen số v alen s 13 Kết xác định trình tự phù hợp với tài liệu đà công bố 10 10 alen đà lựa chọn locus D8S1179 đ-ợc tinh kết hợp nhân bội cùngphản ứng PCR Kết nhân bội (hình 3.3) cho thấy: Thang alen hệ (nhân bội nồng độ pha loÃng khác nhau) có chất l-ợng nhnhau, thể băng phân tách rõ gel điện di M20 C (-) ĐC (-) ĐC K562 (-) 260bp 240bp Alen12 (Giếng 1: Thang alen hệ I; Giếng 2, 3, 4: Thang alen hệ II; Giếng 6, 7: Thang alen hệ III ĐC (-): mẫu đối chứng âm PCR M20: marker 20bp) H×nh 3.3 Kết chế tạo thang alen cho locus D8S1179 3.2.3 Kết chế tạo thang alen locus Amelogenin Amelogenin locus gen nằm nhiễm sắc thể giới tính nam giới locus có 02 alen khác với kích th-ớc 212bp (trên X) 218bp (trên Y) nữ giới có 01 alen kích th-ớc 212bp (trên X) Chúng đà lựa chọn đ-ợc alen để chế tạo thang alen cho locus Amelogein alen đà lựa chọn locus Amelogenin đ-ợc tinh kết hợp nhân bội đồng thời phản ứng PCR Kết nhân bội (hình 3.4) cho thấy: Thang alen hệ (nhân bội nồng độ pha loÃng khác nhau) có chất l-ợng nhnhau, thể băng phân tách rõ gel ®iƯn di 11 M20 ĐC (-) ĐC (-) ĐC K562 (-) 220bp Alen XX (Giếng 1: Thang alen hệ I; Giếng 2, 3, 4: Thang alen hệ II; Giếng 6, 7: Thang alen hệ III ĐC (-): mẫu đối chứng âm PCR M20: marker 20bp) H×nh 3.4 Kết chế tạo thang alen cho locus Amelogenin 3.2.4 Kết chế tạo thang alen locus HPRTB 3.2.4.1 Kết qu¶ lùa chän alencho locus HPRTB Chúng tơi chọn alen, alen số 11, 12, 13,14, 15 16 Kích thước số đoạn lặp alen xác định vào mẫu K562 có kiểu gen đồng hợp tử 13-13 kết giải trình tự 02 alen : alen số 11 v alen s 12 Kết xác định trình tự phù hợp với tài liệu ®· c«ng bè 06 alen ®· lùa chän cđa locus HPRTB đ-ợc tinh kết hợp nhân bội phản ứng PCR để tạo thang alen đa hệ Kết nhân bội (hình 3.5) cho thấy: Thang alen hệ (nhân bội nồng độ pha loÃng khác nhau) có chất l-ợng nh- nhau, thể băng phân tách rõ gel ®iƯn di 12 M20 ĐC (-) ĐC (-) ĐC K562 (-) 200bp Alen 13 180bp (Giếng 1: Thang alen hệ I; Giếng 2, 3, 4: Thang alen hệ II; Giếng 6, 7: Thang alen hệ III ĐC (-): mẫu đối chứng âm PCR M20: marker 20bp) H×nh 3.5 Kết chế tạo thang alen cho locus HPRTB 3.3.1 Kết khảo sát tần suất alen 15 locus STR Sử dụng thang alen chế tạo nghiên cứu nghiên cứu trước, tiến hành khảo sát tần suất alen cho 15 locus đa hình: D5S1358, D7S820, D13S317, CSF1PO, TH01, TPOX, D16S539, D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01; D8S1179 HPRTB 250 cá thể người Việt Chúng sử dụng tiêu chuẩn để kiểm tra phù hợp tần suất phân bố thực tế với tần suất phân bố lý thuyết theo tiêu chuẩn phù hợp 2 Kết khảo sát so sánh với kết khảo sát đại diện số quần thể : Châu Á (Trung Quốc), châu Âu (Ba Lan) châu Mỹ (Mỹ) để đánh giá tính đặc trưng quần thể Kết khảo sát quần thể người Việt thu sau: 13 3.3.1.2 Kết khảo sát tần suất alen locus D5S818 Số alen khảo sát đ-ợc: alen (7; 9; 10; 11; 12; 13; 14), ®ã alen cã tần suất cao alen số 11 (chiếm 27,4%); alen có tần suất thấp alen số (chiÕm 5,6%) 3.3.1.2 Kết khảo sát tần suất alen locus D7S820 Số alen khảo sát đ-ợc: alen (alen sè 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14) Alen có tần suất cao alen số 11 (chiếm 40%); alen có tần suất thấp alen số 14 (chiếm 0,2%) 3.3.1.3 Kết khảo sát tần suất alen locus D13S317 Số alen khảo sát đ-ợc: alen (alen sè 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14) Alen có tần suất cao alen số (chiếm 29,8%); alen có tần suất thấp alen số 14 (chiếm 0,8%) 3.3.1.4 Kết khảo sát tần suất alen locus CSF1PO Số alen khảo sát đ-ợc: alen (alen sè 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14) Alen có tần suất cao alen số 12 (chiếm 39,6%); alen có tần suất thấp alen số (chiếm 0,2%) 3.3.1.5 Kết khảo sát tần suất alen locus TPOX Số alen khảo sát đ-ợc: alen (alen sè 7; 8; 9; 10; 11; 12) §iỊu kh¸c biƯt cđa locus TPOX so víi c¸c locus STR khác có xuất với tần suất cao c¸c c¸ thĨ mang alen sè (chiÕm 57,8%) 3.3.1.6 Kết khảo sát tần suất alen locus TH01 Số alen khảo sát đ-ợc: alen (alen số 6; 7; 8; 9; 10) Alen có tần suất cao alen sè vµ alen sè (chiÕm 34,2% vµ 33,8%); alen có tần suất thấp alen số (chiếm 6,8%) 3.3.1.7 Kết khảo sát tần suất alen locus D16S539 Số alen khảo sát đ-ợc: alen (alen sè 8; 9; 10; 11; 12; 13;14; 15) Alen có tần suất cao alen số 11 (chiếm 30,8%) Alen có 14 tần suất thấp alen số alen số 15 (chiếm 0,2% alen) 3.3.1.8 Kết khảo sát tần suất alen locus D3S1358 Số alen khảo sát đ-ợc: alen (alen số 13; 14;15; 16; 17; 18;19) Alen cã tÇn suÊt cao nhÊt lµ alen sè 15 vµ alen sè 16 (chiÕm 35,6% 33,2%) Các alen có tần suất thấp lµ alen sè 13 (chiÕm tû lƯ 0,4%) vµ alen sè 19 (chiÕm tû lƯ 0,4%) 3.3.1.9 KÕt qu¶ kh¶o sát tần suất alen locus vWA Số alen khảo sát ®-ỵc: alen (alen sè 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20) Alen có tần suất cao alen số 14 (chiếm 29,6%) Trong quần thể khảo sát chúng tôi, đà có xuất alen số 13 với tần suất 0,4% 3.3.1.10 Kết khảo sát tần suất alen cho locus F13B So với locus đà khảo sát trên, locus F13B có tính đa hình thấp số l-ợng alen xuất (4 alen: 7; 8; 9;10) Hơn nữa, tỷ lệ phân bố tập trung nhiều alen số 10 (chiếm 69,6%) Alen có tần suất thấp alen số (0,2%) 3.3.1.11 Kết khảo sát tần suất alen locus FES/FPS Locus FES/FPS cã sè l-ỵng alen nhiỊu (8 alen) Tuy nhiên, tỷ lệ phân bố cao lại tËp trung nhiÒu ë alen sè 11 (chiÕm 45,8%) ảnh h-ởng tới mức độ đa hình locus Alen có tần suất thấp alen số 15 (chiếm 0,2%) 3.3.1.12 Kết khảo sát tần suất alen locus LPL Locus LPL có mức độ đa hình không cao (PD = 0,71) số l-ợng alen Hơn nữa, tần suất phân bố lại tập trung cao ë alen sè 10 (64,8%) Alen cã tÇn suÊt thÊp alen số (chiếm 0,2%) 3.3.1.13 Kết khảo sát tần suất alen locus F13A01 Số alen khảo sát đ-ợc: alen (alen số 3.2, 4, 5, 6,7, 13) Tỷ 15 lệ phân bố cao tập trung nhiỊu ë alen sè 3,2 (chiÕm 40,2%) vµ alen số (chiếm 34,2%) ảnh h-ởng tới mức độ đa hình locus Alen có tần suất thấp nhÊt lµ alen sè (chiÕm 0,2%) vµ alen sè 13 (chiếm 0,2%) 3.3.1.14 Kết khảo sát tần suất alen locus D8S1179 Số alen khảo sát đ-ợc: 10 alen lµ alen sè 8; 10; 11; 12; 13; 14;15; 16;17 và18 Alen có tần suất cao alen số 13 (chiếm 18,2%) Alen có tần suất thấp alen sè (chiÕm tû lƯ 0,2%) 3.3.1.15 KÕt qu¶ khảo sát tần suất alen locus HPRTB Số alen khảo sát đ-ợc: 07 alen (alen số 10; 11; 12; 13; 14;15 16 Alen có tần suất cao alen số 13 (chiếm 40,1%) Các alen có tần suÊt thÊp ë locus nµy lµ alen sè 11 (0,5%) alen số 15 (0,5%) 3.3.1.16 Tính đặc tr-ng quần thĨ thĨ hiƯn ë 15 locus STR KÕt qu¶ kh¶o sát tần suất alen 15 locus đa hình ng-ời Việt (khu vực Hải Phòng) đ-ợc tiến hành so sánh với kết khảo sát tác giả khác quần thể khác bao gồm : - Kết khảo sát quần thể ng-ời Việt (khu vực Hà Nội) - Kết khảo sát nhóm quần thể đại diện thuộc châu (Trung Quốc); châu Âu (Ba Lan) châu Mỹ (Mỹ) Nhìn cách tổng quát kết so sánh, chúng t«i rót mét sè nhËn xÐt sau: - ViƯc khảo sát số l-ợng nhiều cá thể giúp cho phát thêm alen đặc biệt alen hiếm, alen có ý nghĩa quan trọng nhận dạng cá thể Ví dụ : Alen số locus D5S818 đ-ợc phát quần thể ng-ời Mỹ (gốc Capca) ng-êi Trung Quèc (B¾c Kinh) nh-ng ch-a 16 thÊy cã quần thể ng-ời Việt theo khảo sát Shimada - Mỗi quần thể châu lục khác có tính chất đặc tr-ng riêng vỊ ph©n bè alen, vÝ dơ alen sè 11 cđa locus D7S820 cã tÇn st cao nhÊt ë qn thĨ ng-ời Việt (theo nghiên cứu Shimada) ng-ời Trung Quốc (Bắc Kinh) nh-ng quần thể ng-ời Ba Lan ng-ời Mỹ (Cápca) lại có khác biệt, thể tần suất cao lại alen số 10 Nh- việc khảo sát tần suất alen đặc tr-ng cho quần thể cần thiết 3.3.2 Kết đánh giá độ tin cậy (khả phân biệt) cá thể 15 locus STR quần thể ng-ời Việt Từ kết thu đ-ợc khả phân biệt locus, tính đ-ợc độ tin cậy tổ hợp locus nh- sau: Bảng 3.2 Khả phân biệt tổ hợp locus STR quần thể ng-ời Việt Tỉ hỵp Locus locus D5S818 - D7S820 - D13S317 CSF1PO - TPOX - TH01 D3S1358 - D16S539 - vWA D5S818 - D7S820 - D13S317 CSF1PO - TPOX - TH01 D5S818 - D7S820 - D13S317 CSF1PO - TPOX - TH01 D3S1358 - D16S539 - vWA D5S818 - D7S820 - D13S317 CSF1PO - TPOX - TH01 D3S1358 - D16S539 - vWA F13B - FES/FPS - LPL F13A01- D8S1179 - Amel - HPRTB locus locus 15 locus Khả phân biÖt 1/1764 1/320 1/924 1/564.480 1/521.579.520 1/1,9 x 1013 Tõ kết trên, thấy sử dụng phối hợp nhiều locus khác khả phân biệt cá thể cao Kết thu 17 đ-ợc bảng 3.2 cho thấy hoàn toàn ứng dụng kết việc tính toán tần suất cho nhận dạng cá thể ng-ời (đối với quần thể ng-ời Việt) bao gồm truy nguyên cá thể xác định quan hƯ hut thèng 3.3.3 §Ị xt h-íng øng dơng locus STR nhận dạng cá thể xây dùng tµng th- an ninh ë ViƯt Nam HiƯn Việt Nam, việc ứng dụng locus STR nhận dạng cá thể đ-ợc thực dựa công nghệ: công nghệ điện di nhuộm bạc công nghệ điện di mao quản tùy thuộc vào điều kiện cụ thể phòng thí nghiệm Công nghệ điện di nhuộm bạc đà đ-ợc phát triển ứng dụng Việt Nam từ năm 2001 Cho đến nay, tất phòng thí nghiệm phân tích ADN có khả trang bị thiết bị để thực công nghệ việc trang bị không tốn nhiều chủ động công nghệ Hiện Việt Nam, đà có 07 sở công an địa ph-ơng bao gồm Hà Nội, Hải Phòng, Thanh Hóa, Nghệ An, Cần Thơ, Khánh Hòa, thành phố Hồ Chí Minh đ-ợc trang bị chuyển giao công nghệ Riêng Hải Phòng tiến hành xây dựng tàng th- ADN nhận dạng cá thể ng-ời sử dụng công nghệ điện di nhuộm bạc với số l-ợng mẫu khởi đầu 1000 mẫu cho locus Đặc tr-ng công nghệ điện di nhuộm bạc cần lựa chọn locus có số l-ợng alen phù hợp (8- 10 alen) mang alen lẻ để phân tách tốt gel điện di Các locus mà lựa chọn đáp ứng đ-ợc yêu cầu Nh- đà phân tích trên, việc xây dựng tàng th- để phục vụ truy nguyên cá thể quần thể ng-ời Việt Nam cần thực với locus cho phép truy nguyên cá thể với độ xác cao 18 (1/5,6.108) Tàng th- hầu hết n-ớc cịng ®Ịu sư dơng tõ -13 locus ë Anh, tàng th- khởi đầu sử dụng locus STR locus giới tính, cho khả phân biệt 1/50.106, sau phát triển lên 10 locus STR locus giới tính, cho khả phân biệt 1/3.1012 Tại Mỹ, tàng th- đ-ợc xây dựng với 13 locus STR locus giới tính cho khả phân biệt lµ 1/109 ViƯc lùa chän locus nµo lµ tïy thc vào nhiều yếu tố : công nghệ sử dụng, khả phân biệt locus, hệ locus quần thĨ Do vËy, sù lùa chän locus cho viƯc x©y dựng tàng th- ADN khác quốc gia Tuy nhiªn, cã thĨ nhËn thÊy rÊt nhiỊu locus cïng đ-ợc lựa chọn Ví dụ có tất locus đ-ợc lựa chọn giống châu Âu Mỹ để sử dụng cho việc xây dựng tàng th-, locus FGA, TH01, vWA, D3S1358, D8S1179, D16S1359, D8S51 D21S11 Đây locus có tính đa hình cao tỷ lệ đột biến thấp quần thể Khi so sánh 16 locus STR khảo sát với locus đ-ợc lựa chọn FBI (M) h CODIS số locus đ-ợc lựa chọn giống 10 locus bao gồm locus CSF1PO, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317 D16S539 Đây locus đ-ợc nhiều quốc gia lựa chọn sử dụng cho việc xây dựng tàng th- phân tích xác định cá thể, xác định huyết thống Mặc dù số locus này, đa số có tính đa hình cao, nhiên có locus tính đa hình không cao nh- TPOX (alen sè lu«n chiÕm tû lƯ > 50% nhiều quần thể khảo sát) nh-ng ®-ỵc nhiỊu n-íc lùa chän ViƯc lùa chän cã thĨ chúng có tính ổn định cao quần thể (ít đột biến), đồng thời dễ phối hợp với phản ứng PCR phức phù hợp với công nghệ sử dụng 19 Tuy nhiên, bên cạnh việc xây dựng tàng th-, phân tích giám định huyết thống yêu cầu th-ờng xuyên dân hình Trong phân tích xác định huyết thống việc tăng số l-ợng locus cần thiết Số locus cần thiết sử dụng 16 locus (bao gồm locus xác định giới tính) Do locus F13A01, D8S1179, HPRTB Amelogenin mà lựa chọn bổ sung nghiên cứu nhằm phối hợp với locus khác đà nghiên cứu để giúp tăng độ xác giám định, đặc biệt giám định huyết thống Tần suất alen 16 locus mà đà khảo sát hoàn toàn sử dụng cho việc tính toán độ tin cậy truy nguyên cá thể giám định huyết thống quần thể ng-ời Việt (Kinh) Tần suất đảm bảo độ tin cậy đà kiểm tra tiêu chuẩn đảm bảo phù hợp với phân bố lý thuyết theo định luật Hardy Weinberg 20 Kết luận Đà nghiên cứu xây dựng đ-ợc tổ hợp locus ®a h×nh STR míi bao gåm F13A01, D8S1179, HPRTB Amelogenin, cụ thể : - Đà thiết kế đ-ợc cặp mồi cho phép nhân đặc hiệu locus đa hình F13A01, D8S1179 HPRTB Amelogenin phản ứng PCR - Đà tối -u hóa thành phần điều kiện PCR phức hợp locus F13A01, D8S1179, HPRTB Amelogenin : Nồng độ dNTP 400 M; nồng độ MgCl2 2mM ; đệm phản ứng 2X ; ADN khu«n 2ng tỉng thĨ tÝch 25l ; Taq ADN-polymerase 2U ; tû lÖ måi locus F13A01 : D8S1179 : AME : HPRTB lµ 0,8M : 0,8M : 0,4M : 0,8M ; nhiệt độ gắn mồi 60oC Đà xây dựng thang alen thị chuẩn cho locus Thang alen chØ thÞ cđa locus F13A01 bao gồm alen, đ-ợc ký hiệu từ alen số 3,2; đến alen số 13 Thang alen thị locus D8S1179 bao gồm 10 alen, đ-ợc ký hiệu từ 8; 10 đến 18 Thang alen thị cđa locus Amelogenin bao gåm 02 alen kÝch th-íc t-¬ng ứng 212bp 218bp Thang alen thị locus HPRTB bao gồm alen, đ-ợc ký hiệu từ alen sè 10 ®Õn alen sè 16 Đã điều tra, khảo sát để bổ sung số liệu TSAL 15 locus đa hình người Việt, đó khảo sát 07 alen locus F13A01, 10 alen locus D8S1179 07 alen locus HPRTB, phát thêm alen quần thể người Việt alen số locus CSF1PO; alen số 13 locus vWA alen số 15 locus FES/FPS Đà đánh giá đề xuất đ-ợc locus STR sử dụng nhận dạng cá thể xác định hut thèng phï hỵp víi ng-êi ViƯt Nam 21 - - Trong nhận dạng cá thể xây dựng tàng th- ADN: sư dơng locus D5S818, D7S820, D13S317 - CSF1PO, TPOX, TH01 - D16S539, D3S1358, vWA Trong ph©n tÝch giám định huyết thống: Sử dụng 16 locus D5S818, D7S820, D13S317 - CSF1PO, TPOX, TH01 D16S539, D3S1358, vWA - F13B, FES/FPS, LPL - F13A01, D8S1179, Amel vµ HPRTB KIẾN NGHỊ Nghiên cứu khảo sát bổ sung locus ADN đa hình nhóm người thuộc dân tộc khác lãnh thổ Việt Nam để xây dựng bảng phân bố tần suất alen phục vụ giám định, nhận dạng cá thể Xây dựng sở liệu nhận dạng ADN (tàng thư) cho đối tượng khác như: tội phạm, đối tượng làm ngành nghề đặc thù có nguy cao (phi công, tiếp viên hàng không, ngư dân, thợ mỏ…), người tích, chết vơ tung tích… để phục vụ công tác quản lý công tác giám định 22 CÁC CƠNG TRÌNH Đà CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Lê Thị Bích Trâm, Lƣơng Thị Yến, Trần Minh Đơn, Nguyễn Thanh Hà, Đinh Đồn Long, Trịnh Đình Đạt (2011), “Nghiên cứu thiết kế mồi, tối ưu điều kiện phản ứng PCR phức ba locus : F13A01 - D8S1179 - HPRTB locus giới tính Amelogenin” Tạp chí phân tích Hóa-Lý Sinh học T-16 - Số 2/2011, trang 39-43 Lê Thị Bích Trâm, Trần Tr ng H i, B i Nguyên Hải, Nguyễn V n Hà, Đinh Đoàn Long, Trịnh Đình Đạt 11 , “Kết nghiên cứu chế tạo thang alen thị locus đa hình F13A01, D8S1179 HPRTB người Việt” Tạp chí phân tích Hóa-Lý Sinh học T-16 - Số 1/2011, trang 10-14 Lê Thị Bích Trâm, Lƣơng Thị Yến, Trần Minh Đơn, Nguyễn Thị Thu Hồi, Đinh Đồn Long, Trịnh Đình Đạt 11 , “Nghiên cứu khảo sát tần suất phân bố alen locus đa hình F13A01, D8S1179 HPRTB quần thể người Việt” Tạp chí phân tích Hóa-Lý Sinh học T-16 - Số 3/2011 Trang 71-74 23 .. .thể tần suất phân bố locus STR quần thể người Việt để đưa hướng ứng dụng phù hợp Đề tài luận án ? ?Nghiên cứu số locus đa hình STR người Việt Nam nhằm sử dụng khoa học hình sự, nhận dạng cá thể. .. alen locus HPRTB, phát thêm alen quần thể người Việt alen số locus CSF1PO; alen số 13 locus vWA alen số 15 locus FES/FPS §· đánh giá đề xuất đ-ợc locus STR sử dụng nhận dạng cá thể xác định huyết. .. PHƢƠNG PHÁP NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƢỜI Các phương pháp giám định nhận dạng cá thể người nghiên cứu từ trước tới bao gồm: - Phương pháp hình thái học Nhận dạng cá thể yếu tố có chất protein (Xác định nhóm