TÌM HIỂU VÀ THU NHẬN ENYME SACCHARASE TỪ VI SINH VẬT

TÌM HIỂU VÀ THU NHẬN ENYME SACCHARASE TỪ VI SINH VẬT tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớ...

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA: KHOA HỌC ỨNG DỤNG NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU VÀ THU NHẬN ENYME SACCHARASE

TỪ VI SINH VẬT

GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

Nhóm SV thực hiện:

Nguyễn Duy Tuyến Trần Công Phúc

Vũ Đức Tâm

Lê Thị Thoan

Lê Thị Minh Thư

MỤC LỤC

I KHÁI NIỆM VỀ ENZYME SACCHARASE

I.1 Đặc tính cấu tạo enzyme Saccharase

I.1.1 Khái niệm enzyme Saccharase

I.1.2 Phân loại enzyme Saccharase

I.1.3 Cấu tạo và phân tử lượng enzyme Saccharase

I.1.4 Tính chất của enzyme Saccharase

I.2 Cơ chế tác dụng của enzyme Saccharase

I.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme I.4 Nguồn thu nhận enzyme Saccharase

I.5 Ứng dụng của enzyme Saccharase

II QUÁ TRÌNH THU NHẬN ENZYME SACCHARASE

II.1 Sơ đồ thu nhận

II.2 Giải thích sơ đồ

II.3 Đánh giá hoạt tính enzyme saccharase trong thực nghiệm

I KHÁI NIỆM VỀ ENZYME SACCHARASE:

I.1 Đặc tính cấu tạo của enzyme Saccharase:

I.1.1 Khái niệm:

Enzyme Saccharase( α, D fructosfulrannoside

fructohydrolase)- (EC 3.2.1.26), là enzyme xúc tác trong quá trình thủy phân Saccharose và phân cắt liên kết glycoside

Saccharase được phát hiện đầu tiên vào năm 1883 và được nghiên cứu vào năm 1909 bởi Sorensen

Enzyme Saccharase phân bố rộng rãi ở động thực vật, đặc biệt là ở

vi sinh vật

I.1.2 Phân loại:

Từ nguồn thu nhận khác nhau thì enzyme Saccharase tồn tại ở các dạng khác nhau:

− Ở động vật:

Năm 1871, Páchutin đã phát hiện sự tồn tại của enzyme

Saccharase trong ruột động vật ở dạng glucosido Hay có ở trong mật ong, hoạt động như một glucosido- invertase, không thủy phân raffinnose mà thủy phân melezitose và matose

− Ở thực vật bậc cao:

Từ năm 1950, nhận thấy có sự hiện diện của enzyme

Saccharase trong cơ quan của thực vật

− Ở vi khuẩn:

Vi khuẩn Saccharolytic clotridia tồn tại ở dạng glucosido-

invertase và dạng β fructosfulranosidase

− Ở nấm:

Điển hình ở Aspergillus oryzae được xem như là một glucoside- invertase Ngoài ra chúng cũng có mặt hầu hết trong các nấm men công nghiệp: men bia, men sản xuất rượu, men bánh mì…

Bản tóm tắt đặc tính của enzyme Saccharase:

TOpt :nhiệt độ tối thích PHOpt ::PH tối thích

Chất tăng hoạt Cu2+,ca2+, K+,Cd2+

Chất kìm hãm Hg2+, sodium,dodecylsunfate

Tính xúc tác Đặc hiệu cơ chất

− Enzyme Saccharase nằm ở bên trong lẫn bên ngoài tế bào nên để thu nhận enzyme Saccharase chúng ta phải chiết tách, tinh sạch để thu được chế phẩm như mong muốn

I.1.3 Cấu tạo và phân tử lượng:

− Cấu tạo:

_ Phân tử lượng:

Saccharase thu nhận từ nấm men Saccharomyces cerevisiae có trọng lượng phân tử 270000 Daltons( ngoại bào), 135000

Daltons( nội bào)

I.1.4 Tính chất của enzyme Saccharase:

Tính đặc hiệu về cơ chất: Saccharase xúc tác cho phản ứng thủy phân Saccharase tạo thành đường khử( đường nghịch đảo), gồm đường glucose và fructose

Cấu trúc không gian của enzyme saccharase

I.2 Cơ chế tác dụng của enyme Saccharase:

Cơ chế tác dụng của enzyme như sau:

Bản chất trong cơ chế tác dụng của enzyme là là khả năng hoạt hóa cơ chất để cơ chất tham gia hoạt hóa mạnh hơn

Khi enzyme tham gia xúc tác thì năng lượng cần thiết cho phản ứng nhỏ hơn rất nhiều so với khi không có enzyme

E +S →ES→P +E

Trong đó : E: enzyme

S: cơ chất

ES: Enzyme cơ chất

P: sản phẩm

Cơ chế tác dụng của enzyme Saccharase gồm 3 giai đoạn:

− Giai đoạn một: E+S →ES Liên kết với nhau bằng các liên kết yếu( liên kết hidro, tương tác tĩnh điện, tương tác Vander Walls) phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp

− Giai đoạn 2: cơ chất bị biến đổi dẫn đến sự kéo căng và phá

vỡ các liên kết đồng hóa trị

− Giai đoạn 3: sản phẩm được hình thành enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do

I.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc của phản ứng enzyme:

I.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:

− Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme:

V=k [E]

V: vận tốc phản ứng [E]: nồng độ enzyme

− Tuy nhiên khi nồng độ quá lớn thì vân tốc không còn phụ thuộc tuyến tính nữa

I.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:

− Mô hình Michaelis –Menten theo cơ chế:

E +S ↔ES → PE

Với [S]: nồng độ cơ chất

Km: hằng số phân ly biểu kiến của ES

Phương trình Michaelis-Menten: V=Vmax[S]/(km+[S])

I.3.3 Ảnh hưởng của chất kìm hãm:

− Trong các phản ứng enzyme một số chất như ion kim loại nặng, các chất vô cơ, hữu cơ với nồng độ cao sẽ kìm hãm tốc độ phản ứng của enzyme, các chất này có thể kìm hãm thuận hay nghịch hoặc không thuận nghịch bao gồm:

− Các chất kìm hãm cạnh tranh

− Các chất kìm hãm không cạnh chanh

− Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng

− Kìm hãm do thừa cơ chất

I.3.4 Ảnh hưởng cuả nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzymes Saccharase:

− Enzyme bị ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc bởi nhiệt độ Mỗi enzyme có nhiệt độ tối ưu riêng và một khoảng ph nhất định.Nếu nhiệt độ và pH không thích hợp sẽ gây biến tính hay làm giảm hoạt tính của protein

I.3.5 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa:

− Các chất kích hoạt làm tăng độ xúc tác của enzyme Chúng có thể là các ion kim loại hay các chất hữu cơ Các chất này thường kết hợp với các phân tử enzyme làm thay đổi cấu tạo không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác Ví

dụ như tác dụng của anion clo, brom,iot, đến hoạt độ của các α amylase động vật Tác dụng của một số ion kim loại như Mn2+,

Zn2+…., đối với các hoạt độ của các protease

I.4 Nguồn thu nhận enzyme Saccharase: ngoài những

dữ liệu trên, ta còn có bảng sau:

I.5 Ứng dụng của enzyme Saccharase:

− Enzyme saccharase được ứng dụng trong quá trình sản xuất đường ngịch đảo, là enzyme thủy phân có tác dụng làm tăng độ hòa tan và vị ngọt, không tạo màu như trường hợp thủy phân bằng acid Khả năng giữ ẩm tốt nên được dùng trong công nghệ sản xuất mứt kẹo mềm, nhân socola, kẹo viên, bánh qui

Nguồn thu nhận Phân tử lượng

kem nhân trái cây…) mật ong nhân tạo, kem, rượu mùi … chế phẩm enzyme saccharse được sử dụng trong siro thượng phẩm thức uống không có cồn có giá trị dinh dưỡng và độ ẩm cao, giảm chi phí về đường cho các đơn vị sản xuất Trong sản xuất nước uống không cồn, khi pha chế siro cần chuyển hóa một phần

saccharose để tăng độ ổn định và ngăn ngừa độ kết tinh của của saccharose Ngoài ra, enzyme saccharase còn có khả năng phân giải một số trisaccarit và tetrasacarit, chúng tách phân tử glucose

và fructose ở đầu và cuối mạch ra

C12H22O11 +H2O →C6H12O6 +C6H12O6

− Sự thủy phân saccharose với sự có mặt của saccharase hình thành glucose và fructose dạng vòng

− Saccharase là loại enzyme đầu tiên được sử dụng trong qui mô lớn dưới dạng enzyme cố định Trong thời kì 1941-

1946 người ta đã thay aid bằng enzyme saccharase trong nấm men

để sản xuất siro vàng các tế bào nấm men sẽ tự hủy và sản phẩm của sụ tự hủy này được làm sạch bằng cách điều chỉnh pH bằng 4,7, sau đó lọc qua lóp calcium sunfat và hấp thụ trong than xương

có chứa enzyme invertase

II QUI TRÌNH THU NHẬN ENZYME SACCHARASE:

II.1 Sơ đồ thu nhận enzyme Sacharase:

Nước

Nấm men, bã men

Ly tâm( 4000v/15 phút)

Lọc

Cát

Đệm phosphate

0.1M, ph 7

Nghiền

Thẩm tích đối nước

Sắc kí trao đổi ion Đông khô

Ly tâm( 4000v/ 5 phút)

Sản phẩm

B ã

B ã B ã

II.2 Giải thích sơ đồ:

− Nghiền: Saccharase là loại enzyme chủ yếu nằm trong tế bào Do đó cần phải phá vở tế bào để thu nhận

enzyme( bằng cách nghiền với cát) đồng thời khi tiến hành chiết tách cần phải làm lạnh môi trường để tránh sự giảm hoạt tính của enzyme Saccharase

− Lọc: Đối với bã men sau khi nghiền phải qua lọc thô để loại bớt bã nhằm thuận tiện cho các quá trình sau

− Ly tâm: Dịch enzyme sau khi thu được đem ly tâm ở 4000v/15 phút mục đích loại bỏ tạp chất

− Thẩm tích: Trong quá trình tinh sạch enzyme cần phải thẩm tích để loại bỏ các phân tử hòa tan có kích thước nhỏ không phải là enzyme mong muốn

− Đông khô: phương pháp bảo quản các sản phẩm sinh học: enzyme, protein, các tế bào vi sinh vật được lâu hơn mà hoạt tính của chúng không bị biến tính Muốn vậy, chúng ta cần phải tiến hành đông khô mẫu trước khi khảo sát.Nếu đây là quy mô

CN thì công đoạn này với công đoạn kế tiếp đổi ngược lại

− Sắc kí trao đổi ion: Trong hổn hợp enzyme thu được ngoài enzyme, protein mong muốn còn có các protein và các tạp chất khác do đó phải tách và tinh sạch chúng bằng phương pháp sắc kí

II.3 Đánh giá hoạt tính enzyme saccharase trong thực nghiệm.

dựa vào bảng số liệu thực nghiệm dưới, ta có thể kết luận sau:

hoạt lực enzyme saccharase trong nấm men > bã men

hoạt lực enzyme saccharase trong men khô > men tươi

Với công thức tính hoạt lực như sau:

(V1-V2) × A × B×10-3

20 × 2 × a × b × t × m Trong đó: A:tổng thể tích trong mỗi ống (ml)

B:tổng thể tích enzyme có trong m (g) nguyên liệu (ml) a:thể tích lấy ra trong mỗi ống để định lượng glucose (ml) b:thể tích dd enzyme cho vào mỗi ống (ml)

m,t: lần lượt là khối lượng enzyme (g) và thời gian thuỷ phân tính bằng phút

Hoạt lực của enzyme saccharase trong nguyên liệu thô:

(mol/g/phút)

a) Nấm men tươi: men bánh mì đông dạng bột mua ở chợ, hãng

sx tại Thái Lan, chủng Saccharamyces cerevisiae

b) Nấm men khô: chế phẩm saccharase thu nhận từ men bánh

mì sau khi chiết xuất và đông khô dung dịch

c) Bã men tươi: bã nấm men thu nhận từ bã men bia của nhà máy bia Sài Gòn

d) Bã men khô: chế phẩm saccharase thu nhận từ bã men tươi sau khi qua chiết xuất và đông khô dung dịch

Nguyên

liệu

Khối lượng(g)

Vdd (ml)

Thể tích Na2S2O3(ml)

V1-V2 Hoạt lực

mol/g/phút Nấm men

tươi

0.383 Nấm men

khô

2.595

Bã men

tươi

0.666

Bã men

-3 2.15