TÌM HIỂU VÀ THU NHẬN COLLAGEN

TÌM HIỂU VÀ THU NHẬN COLLAGEN tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả các lĩnh vự...

TÌM HIỂU VÀ THU NHẬN COLLAGEN

I TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN

1 Collagen là gì?

 Collagen là loại protein tự nhiên chủ yếu của cơ thể người, chiếm 25-35% toàn bộ protein của cơ thể, là thành phần chính của các mô liên kết, có khả năng đàn hồi và chịu lực rất cao, là thành phần chính của da, gân, xương, dây chằng, sụn và răng trong cơ thể trong da collagen chiếm khoảng 70%

 Hàm lượng colagen ở cơ thịt cá thấp hơn ở động vật có vú, thường khoảng 1-10% tổng lượng protein và 0,2-2,2% trọng lượng của cơ thịt Chiếm khoảng 3% ở cá xương và khoảng 10% ở cá sụn (so với 17% trong các loài động vật có vú Có trong mạng lưới ngoại bào, không tan trong nước, dung dịch kiềm hoặc dung dịch muối có nồng độ ion cao.(vocw.edu.com)

Tropocollagen triple helix

Hình: cấu tạo của cơ

2 Hình dạng-cấu trúc collagen

 Collagen là protein hình sợi, do các phân tử cơ sở là Tropocollagen tạo nên Có cấu trúc gồm nhiều sợi xoắn ốc và liên kết lại thành một khối sợi Mỗi tropocollagen gồm 3 mạch polypeptide bện vào nhau tạo thành một cấu trúc siêu xoắn do mỗi mạch polypeptide cũng

có cấu trúc xoắn Chiều cao của mỗi gốc xoắn trên trục siêu xoắn khoảng 2.9 anstrong, mỗi vòng xoắn là 3.3 gốc aa Các mạch polypeptide liên kết với nhau bằng liên kết hydro

 Trong mỗi chuỗi polypeptide thường có các đoạn cấu trúc ( Gly- X-Y)n lặp lại nhiều lần ( n= 5 hoặc 6, X là gốc prolin, hoặc hydroxyprolin, Y là gốc alanin hoặc hydroxyprolin).Xen giữa các đoạn cấu trúc chuỗi ba là các vùng có cực, các gốc glysine chiếm 33% tổng lượng

aa, thường nằm trong chuỗi xoắn ba này, còn các gốc aa thì nằm ngoài xoắn ốc, do đó có thể tham gia tương tác giữa các phân tử

 Collagen có các liên kết chéo trong nội phân tử và giữa các phân tử(liên kết H, S-S, aldol, ester, isopeptid )

 Collagen là thành phần protein cấu trúc nhiều nhất của ECM( Extra Cellular Matrix- chất nền ngoại bào) , chứa ít 20 phân tử khác nhau trong trình tự acid amin, tạo ba chuỗi alpha Collagen rất giàu proline và hydroproline

 ECM chất nền ngoại bào là môi trường để vận chuyển các chất dinh dưỡng , chất thải giữa các tế bào mô liên kết và máu Cơ chất nền là dạng chất liệu không màu , trơn nhớt, trong suốt, giống gel, các sợi fiber và có khảm các tế bào khác nhau Nói chung, đó là một hỗn hợp dịch ,

các protein glycosaminoglycan, proteoglycan và glycoprotein Cơ chất nền giúp ngăn cản sự xâm hại mô bởi tác nhân ngoại lai, đồng thời kháng lại các áp lực

 Có khoảng 30 gen được phát hiện trong bộ gen tổng hợp trên 20 loại collagen khác nhau Loại I, II, III phổ biến nhất, chủ yếu là những sợi fibil tương tự nhau Loại IV là một mạng lưới

2 chiều, chủ yếu hình thành những phiến mỏng Collagen được tổng hợp nhiều hơn trong nguyên bào sợi, tuy nhiên các tế bào biểu mô cũng tổng hợp được loại protein này

3 Tính chất

 Không tan trong nước, dung dịch kiềm hoặc dung dịch muối có nồng độ ion cao

 Khi đun nóng, khoảng 60 độ C, thì collagen bị co lại Ở nhiệt độ cao hơn (100 độ C), collagen chuyển hóa thành gelatin hòa tan trong nước, nhờ vậy thịt được mềm ra Ở nhiệt độ cao hơn nữa (125 độ C, trong nồi áp suất), colagen bị chuyển hóa rất nhanh chóng

 Collagen ít có tính đàn hồi song có khả năng chịu đựng sức căng lớn Khi kết hợp với gelatin

là protein không định hình và có tính đàn hồi cao, chúng tạo thành sự kết hợp vững chắc

Collagen không đàn hồi được là do các cử động hóa trị giữa nhóm e-NH2 của gốc

hydroxyllixin và chức aldehyde của gốc lizin hoặc gốc hydroxyllisin nằm ở phần không xoắn ốc.Ở động vật còn non các cầu đồng hóa trị nối với các phân tử tropocollagen với nhau, tương đối không bền nên dễ dàng bị phá hủy bởi pH, nhiệt độ hoặc bởi các tác nhân biến tính khác Ngược lại, ở động vật già các cầu này thường bị thay thế bởi những cầu khác bền hơn do đó làm tăng độ cứng của thịt

Hình cấu trúc bên trong của da cấu trúc trong gân

4 Chức năng collagen

 Collagen là thành phần chính của mô sợi liên kết, giúp gắn kết các tổ chức với nhau Collagen ít đàn hồi, song có khả năng chịu sức căng rất lớn

 Collagen giống như một chất “keo” kết dính các bộ phận trong cơ thể thành một khối hoàn chỉnh, nếu không có chúng cơ thể người sẽ chỉ là các bộ phận rời rạc

 Collagen là một cấu trúc protein phức tạp giúp duy trì sự phát triển khỏe mạnh và ổn định cho da, dây chằng, xương, khớp, cơ, gân, răng, lợi, mắt, các thành mạch máu, hệ móng và tóc

Types of Collagen

Type Chain Composition Gene Symbol

(s)

Structural Details Localization

I [α1(I)]2[α(I)] COL1A1,COL1A2 300nm, 67nm bandedfibrils skin, tendon, bone,etc.

II [α1(II)]3 COL2A1 300nm, small 67nmfibrils cartilage, vitreoushumor III [α1(III)]3 COL3A1 300nm, small 67nmfibrils

skin, muscle, frequently with type I

IV [α1(IV)2[α2(IV)] COL4A1 thruCOL4A6 390nm C-term globulardomain, nonfibrillar all basal lamina

V [α1(V)][α2(V)][α3(V)]

COL5A1, COL5A2, COL5A3

390nm N-term globular domain, small fibers

most interstitial tissue, assoc with type I

VI [α1(VI)][α2(VI)][α3(VI)]

COL6A1, COL6A2, COL6A3

150nm, N+C term

globular domains, microfibrils, 100nm banded fibrils

most interstitial tissue, assoc with type I

VII [α1(VII)]3 COL7A1 450nm, dimer epithelia

VIII [α1(VIII)]3 COL8A1,

COL8A2 some endothelialcells

IX [α1(IX)][α2(IX)][α3(IX)]

COL9A1, COL9A2, COL9A3

200nm, N-term globular domain, bound proteoglycan

cartilage, assoc with type II

X [α1(X)]3 COL10A1 150nm, C-term globular

domain

hypertrophic and mineralizing

cartilage

XI [α1(XI)][α2(XI)][α3(XI)] COL11A1,COL11A2 300nm, small fibers cartilage

XII α1(XII) COL12A1 interacts with typesI and III

5 Sự tổng hợp collagen trong cơ thể

a) Các sự kiện nội bào là:

 Sự tổng hợp trực tiếp preprocollagen xảy ra tại RER bởi các mRNA mã hóa tạo các kiểu khác nhau của chuỗi alpha

 Sự hydroxyl hóa tại các đầu proline và lysine trên những chuỗi polpetide đang tổng hợp trong RER Phản ứng này luôn đòi hỏi enzyme chuyên biệt hydroxylase và vitamine C như là một cofactor

 Sự glycosyl hóa( gắn phân tử đường) vào các đầu hydroxylysine chuyên biệt cũng xảy ra trong RER

 Sự hình thành các procollagen( triple-helix) xảy ra trong RER và được điều hòa chính xác bởi các propetide( trình tự các protein không xoắn) , định vị tại hai đầu của chuỗi alpha , ba chuỗi sắp xếp thẳng hàng, cuộn thành một triple helix

 Trong phức hợp Golgi, carbohydrate được gắn thêm lên những procollagen nào sẽ được vận chuyển xuyên qua màng ( thông qua vận chuyển các bóng màng)

 Sự tiết collagen ra ngoại , nhờ sự xuất bào sau khi các bóng màng tiết được vận chuyển từ mạng lưới Golgi trans, đến bề mặt tế bào dọc theo các vi ống

b) Các sự kiện ngoại bào:

 Sự cắt các procollagen được xúc tác bởi enzyme procollagen peptidase sẽ tách bỏ hầu hết các trình tự tại đầu mút của các chuỗi alpha, tạo thành tropocolagen hay collagen đơn giản

 Sự kết hợp của các tropocollagen xảy ra khi các tropocollagen không tan trong nước tụ tập gần bề mặt tế bào, các sợi fibril của collagen kiểu I, II, III, V và VII đựoc tạo ra , chúng có những dải tuần hoàn với độ dày 67nm trong fibril collagen type I,II và III, độ dày của các dải này khác nhau những kiểu collagen khác nhau

 Sự hình thành các liên kết đồng hóa trị( lk chéo ) xảy ra giữa những tropocollagen gần nhau

 Sự tổng hợp collagen type IV khác với các dạng khác, các trình tự peptide bị tách ra khỏi các đầu tận cùng của các phân tử procollagen của nó Cấu trúc cuộn xoắn mạch bị gián đoạn ở nhiều vùng Chúng hình thành các dimer đầu –đầu, sự tương tác giữa các dimer sẽ tạo ra các liên kết bên, cuối cùng tạo ra các mạng lưới phiến mỏng( sheet)

 Sự sai lệch trong quá trình tổng hợp collagen, hay sự biến đổi cấu trúc collagen sẽ dẫn đến những bệnh hay những tật bẩm sinh Trong đó có các hội chứng như Alport, Larsen, Ehler-Danlas( EDS), … sự rối loạn cấu trúc này bắt nguồn từ gen điều khiển tổng hợp collagen đó

Hình minh họa quá trình tổng hợp protein collagen trong

cơ thể

Hình: sự tổng hợp collagen trong cơ thể

Hình: các tổn thương ở phổi do sự biến đổi từ cấu trúc collagen

ĐẶC TÍNH CỦA 6 LOẠI COLLAGEN PHỔ BIẾN

Kiểu phân

tử Tế bào tổng hợp Các định vị chính trong cơ thể Chức năng

I Nguyên bào sợi

tế bào xương nguyên bào ngà

Chân bì ( dermis) da, xương, gân , dây chằng

và xơ-sụn

Chống chịu lực căng

II Nguyên bào sụn Sụn trong mở ( hyaline

cartilage) Chống chịu các áp suất gián đoạn III Nguyên bào sợi

Tế bào lưới

Tế bào cơ trơn

Tế bào Schwann

Tế bào gan

Hệ bạch huyết, hệ tim mạch, gan, phổi, tách, ruột, tử cung, và mô kẽ thần kinh

Hình thành mạng lưới cấu trúc trong các cơ quan phát triển

IV Tế bào nội bộ

Tế bào biểu mô

Tế bào cơ

Tế bào Schwann

Lá nền Phiến ngoài ( external lamina)

Cung cấp giá thể và lọc Hoạt động như là một giàn đỡ ( scaffold) cho

sự di cư của tế bào

V Tế bào trung mô Bánh nhau Đang nghiên cứu

VI Tế bào sừng

( keratinocyte)

Kết nối da- biểu bì Hình thành các sợi móc

neo các phiến với mô liên kết bên dưới

6 Sự thiếu hụt collagen

a Nguyên nhân

Khi càng lớn tuổi, cấu trúc collagen bị giảm đi do khả năng tổng hợp của cơ thể giảm cộng với

sự thoái hoá của cấu trúc này gia tăng, vì thế chất này giảm khoảng 1%, mỗi năm về cả mặt khối lượng và độ dày, cấu trúc collagen cũng không còn được trật tự chặt chẽ, sự thiếu hụt collagen và quá trình lão hóa có liên quan chặt chẽ với nhau

Biểu hiện:

 Collagen gắn liền với quá trình lão hóa theo thời gian đối với mọi cơ thể

 Yếu tố di truyền là sự lão hóa sinh học, tự nhiên và không tránh được, đã được lập trình trước trong tế bào.Sự lão hóa tùy vào mỗi người do di truyền quyết định

 Nhiều năm qua ta đã biết estrogen có ảnh hưởng đến chất tạo keo.vì thế có mối liên hệ giữa giảm sản xuất estrogen với giảm sản xuất chất tạo keo

 Lão hóa theo thời gian phụ thuộc vào thời gian trao đổi chất hằng ngày của tế bào.Mỗi tế bào

có năng lượng sống và mitochondria của riêng nó.Mitochondria ảnh hưởng đến việc giải phóng

thành từ các mitochondria có thể được đưa trực tiếp đến các tế bào cần năng lượng để phát triển, để phân chia, và sản xuất những gì cần thiết cho các mô đặc biệt giúp bảo vệ chống lại các tác hại và chữa lành các tổn thương…

 Qua quá trình thở, chúng ta đã cung cấp cho tế bào lượng ôxi để các mitochondria sản xuất năng lượng Và tác dụng phụ của quy trình này là các gốc ôxi tự do được hình thành Lúc trẻ, các tế bào sản xuất ít các gốc tự do và nhiều chất đề kháng chống lại tác hại của các gốc tự do Theo thời gian, các tế bào sản xuất nhiều hơn các gốc tự do và cùng lúc đó hệ thống miễn dịch của tế bào đã “mệt mỏi” do đó tế bào dễ bị các gốc tự do tấn công Thực chất thì các gốc tự do

đã ảnh hưởng đến các collagen và sợi đàn hồi, kết quả ảnh hưởng đến cấu trúc tự nhiên của collagen

 Sự lão hóa từ bên ngoài: các yếu tố về phong cách sống và môi trường ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lão hóa, đặt biệt trên da là rõ rệt nhất yếu tố này còn do thói quen uống rươu, hút thuốc, ăn uống và nghỉ ngơi không hợp lý Bia rượu có tác dụng lợi tiểu và vì thế chúng là yếu

tố gây trở ngại trong việc duy rì sự cân bằng lượng nước của cơ thể Dùng nhiều rượu bia làm cho máu chạy nhanh hơn, ảnh hưởng sự cân bằng vốn có trong cơ thể dinh dưỡng và cản trở việc lấy đi chất thải từ các lớp trên cùng của da, làm cho da bị mờ xỉn, xuất hiện các vết nhăn Hơn nữa nicotin được chứng minh là rất có hại ngay cả đối với các mạch máu khỏe nhất

b Biện pháp phục hồi sự thiếu hụt collagen.

 Tốt nhất là ăn uống nghỉ ngơi hợp lý, có chế độ luyện tâp thích hợp, đồng thời hạn chế đồ uống có cồn, thuốc lá, các chất kích thích, đó là những biện pháp phục hồi và kéo dài cấu trúc vững chắc của collagen

• Đối với da, thường bổ sung các sản phẩm dùng bên ngoài, phục vụ trong việc làm đẹp( mỹ phẩm), phục hồi các hư tổn trên da( vết bỏng, vết thương,…) Tuy nhiên phương pháp này không cho hiệu quả thực sự tốt nhất do một hạn chế của các sản phẩm dùng ngoài là khả năng thẩm thấu không cao, tác động chủ yếu trên lớp thượng bì (phía trên cấu trúc

collagen) nên ít cho hiệu quả mong muốn Hơn nữa, collagen trong mỹ phẩm thường không phải là chế phẩm từ tự nhiên mà chủ yếu là từ nguồn nguyên liệu tổng hợp nên cơ thể khó dung nạp

• Dùng các sản phẩm đường uống, các chế phẩm này chưa các

protein hay collagen giúp cơ thể tổng hợpcollagen để sử dụng, đặc biệt collagen thu nhận từ da cá có phân tử nhẹ nên được hấp thụ tốt hơ

Kẹo collagen bổ dưỡng làm đẹp

• Ngoài ra có thể bổ sung bằng con đường tiêm chế phẩm có chứa collagen vào

Mức Độ hấp thu collagen từ các sản phẩm trich ly khác nhau

II QUÁ TRÌNH THU NHẬN COLLAGEN

Trong công nghệ sản xuât Collagen thường được thu nhận từ da động vật: da cá, da heo,… cho hiệu suất và độ tinh sạch cao, collagen được thu nhận từ da cá có phân tử nhẹ nên dễ hấp thu hơn

Ngoài ra còn được tổng hợp hóa học, để dùng cho việc nghiên cứu cấu trúc và thành phần

collagen

Collagen được lấy từ da chính người bị thương, thường dung trong điều trị vết thương, lở loét… giúp mau lành vì cơ thể dễ tiếp nhận do không có khác biệt về cấu trúc

THU NHẬN COLLAGEN TỪ VẢY CÁ LÓC BÔNG TRONG PHÒNG THÍ NGHIÊM 1) Nguyên liệu

Vảy là mô cứng của da tạo thành “một bộ xương ngoài” ở cơ thể động vật đặc biệt phổ biến ở nhiều loài cá Trong vảy chủ yếu chứa các chất khoáng CaCO3, CaHPO4, collagen và chất sừng gelatin

Collagen là protein dạng sợi có độ co giản rất cao Collagen dạng bột có màu vàng nhạt, không tan trong nước lạnh, tan trong nước nóng đun lâu, tan trong acid acetic, urea, và glyceril

2) Giải thích quá trình thu nhận

 Quá trình làm sạch

 Vảy cá được tách ra riêng, sau đó rửa bằng nước sạch nhiều lần để loại bỏ bụi bẩn, các thành phần khác trong quá trình tách da ra từ cá

 Ngâm trong dung dịch HCl 0.8% trong 24h để hòa tan và tách các chất khoáng, đồng thời có tác dụng làm trương phồng vảy, phần còn lại là collagen và keratin

 Rửa lại bằng nước sạch nhiều lần vảy này có thể sử dụng ngay hay làm khô để sử dành sử dụng dần

 Quá trình thủy phân và thu nhận collagen

 Nguyên tắc: dùng acid acetic ( CH3COOH) để thủy phân các protein trong vảy cá, sau đó trung hòa lại bằng NH4OH ở điểm đẳng điện, cuối cùng là trích ly bằng cồn

 Ngâm khoảng 15g vảy cá trong 50mL acid acetic 9% trong 24h, acid acetic sẽ thủy phân protein trong vảy cá, đem lọc ta thu được dung dịch collagen(1), phần vảy còn lại đem thủy phân lần II với acid acetic 9% trong 15h, đem lọc ta thu được dung dịch collagen (2)

 Gộp dung dịch collagen (1) và (2) lại, đem trung hòa bằng NH4OH 10% đến pH=8.2, đây là

pH đẳng điên của collagen

 Dung dịch trung hòa được đem tủa với cồn theo tỷ lệ dung dịch collagen : cồn tuyệt đối = 1:1, sau đó đem ly tâm 5000 vòng/ phút trong 5 phút Tủa thu được là collagen sản phẩm, ta đem sấy khô ở T< 400C, tủa khô đem xoay nhuyễn thu được collagen bột

 Định tính và định lượng sản phẩm collagen thu được

Trong phòng thí nghiêm ta có thể dùng một trong các phản ứng sau để định tính collage:

• Phản ứng biure: cho 2mL dung dịch collagem tác dụng với 2mL dung dịch NaOH vào lắc đều, sau đó nhỏ từng giọt CuSO4 0.5% Dung dịch sau đó sẽ cho màu tím đỏ đặc trưng

Collagen có là một protein do đó trong phân tử chứa nhiều liên kết –CO-NH- có thể liên kết