Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít

Tìm hiểu và thu nhận enzyme protease từ mủ mít tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về t...

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG



ĐỀ TÀI:

Tìm hiểu và thu nhận

enzyme protease từ mủ mít

GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

Nhóm thực hiện:

1 Nguyễn Thị Mỹ Phụng 072541S

2 Lâm Minh Thuận 072599S

3 Phan Thị Minh Tuyền 072639S

4 Lê Văn Như Vinh 072654S

5 Hồ Thị Tường Vy 072661S

MỤC LỤC

1.Giới thiệu về mít.

1.1 Nguồn gốc 1.2 Đặc điểm 1.3 Đặc điểm sinh lý sinh thái 1.4 Phân loại

1.5 Gía trị sử dụng 2.Giới thiệu về enzyme protease từ mủ mít.

2.1 Định nghĩa enzym protease 2.2 Phân loại enzym protease 2.3 Ứng dụng enzym protease trong

mủ mít

3.Tinh sạch enzyme protease

II.Qui trình thu nhận

1.Sơ đồ qui trình.

2.Giải thích qui trình.

III.Kết quả

IV.Ứng dụng

I- TỔNG QUAN

1.1 Nguồn gốc:

Cây mít có tên khoa học là Artocarpus heterphyllus thuộc họ dâu tằm Moraceae,gốc ở dãy núi Ghats phía

nam Ấn Độ và từ đó đã lan khắp Ấn Độ,philippine.Nó

là cây trồng phổ biến ở : Bangladesh ,Sri Lanka, Indonesia, Brazil và Việt Nam…Quả mít được coi là loại quả quốc gia của bangladesh

1.2 Đặc điểm:

-Mít thuộc loại cây lớn,thường xanh quanh năm ,có thể cao từ 8 đến 15 m ,đường kính gốc đạt đến 1.5m và sống đến 100 năm

- Lá mít mọc cách, hình trứng, đầu lá phình to và hơi nhọn, cạnh đáy thon, khi còn non lá có 3 thùy, lá dày, cứng, mặt trên của lá màu xanh thẫm, nhẵn, không có lông, mặt dưới của lá hơi thô, màu xanh nhạt Mặt lá rộng

từ 1-12cm, dài 8-15cm

- Rễ cọc của cây mít phát triển từ khi cây còn nhỏ, đánh cây đi trồng dễ làm chết cây non Ở cây già bộ rễ phát triển mạnh có khi nổi lên mặt dất bám chắc cho nên chống gió bão tốt

-Mít có hoa đơn tính đồng chu Hoa đực hay cái sinh cùng một chùm, chung một cuống rất to khỏe Mỗi chùm gồm nhiều hoa, không có cánh, dính vào nhau thành những cụm hoa có đực riêng cái riêng Hoa đực rụng sớm còn hao cái sau khi đã thụ phấn lớn lên thành một quả phức

hợp, mỗi múi là một quả con Qủa sinh ra trên cây thân chính hoặc ở chân những cành lớn, cay già quả có khuynh hướng mọc thấp thậm chí mọc cả ở những rễ ăn nổi trên mặt đất

- Quả mít hình bầu dục hay hình tròn, quả to kích thước khoảng (30-60) cm x (20-30) cm, trọng lượng 4.5-27.3kg ; một số giống nhỏ hơn nặng từ 1.4-4.5kg ; vỏ dày và ghồ ghề có nhiều gai nhọn Khi chưa chín vỏ quả có màu xanh, khi quả bắt đầu chín vỏ chuyển từ màu lục sang màu nâu Bên trong có nhiều múi ăn được , ngọt, thơm, giòn Qủa

mít có các thảnh phần cấu tạo gồm: vỏ, xơ, múi, hạt, cùi, lõi

1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh thái:

Mít trồng ở nước ta bao gồm nhiều loại với chất lượng quả khác nhau, nhưng có những đặc điểm sinh thái chung gần giống nhau như:

- Thích nghi dễ dàng ở vùng khí hậu ấm áp, không sống được ở nơi có nhiệt độ thấp Có khả năng chịu được khô hạn nhưng trong trường hợp đó cây sinh trưởng kém, ra hoa kết trái kém

- Có thể sống được trên nhiều vùng đất đai khác nhau

- Ở nơi đất tốt mít sinh trưởng và phát triển nhanh, bảo tồn được những đặc tính tốt của cây mẹ

- Mít phát triển nhanh trong những năm đầu (từ 1-4 tuổi), những năm sau cây chậm lớn về chiều cao, to nhanh về đường kính, mít có khả năng tái sinh chồi mạnh khi cây còn dưới 5-6 tuổi

- Mít ra hoa kết quả từ 4-5 tuổi, chậm nhất là 7 tuổi Mít ra hoa từ tháng 1-2, quả chín từ tháng 6-8

1.4 Phân loại:

Theo đặc điểm:2 loại

-Mít thường (Artocapus herterophylluss Lam) :

trồng phổ biến ở cả miền Bắc và miền Nam,búp và lá non không có lông,trái to,vài kg dến 20kg Bao gồm nhiều loại khác nhau như mít mật,mít nghệ,mít dừa…

-Mít tố nữ (Artocarpus interger thumb) : trái nhỏ hơn

mít thường và múi thường dính vào với lõi,vỏ có xơ dính liền có thể mổ bằng một nhát dao dọc rồi tách khỏi múi dễ dàng.Trái tuy nhỏ chỉ khoảng 1-2kg nhưng cây rất sai có sai có đến hàng trăm trái

1.5 Giá trị sử dụng:

-Mít trước hết dùng để ăn quả: hạt mít chứa nhiều tinh bột, thành phần glucid trong múi mít chủ yếu là đường hòa tan

và cellulose

-Mít thường - Mít tố nữ

-Nó có thể sử dụng làm keo dính đáy tàu, thuyền Đồng thời, mủ mít cũng có hoạt tính tương tự như papain từ mủ

đu đủ

-Đặc biệt trong ngành công nghiệp chế biến sữa,lượng renin được sản xuất hiện chưa đáp ứng được nhu cầu thực

tế, xu hướng sử dụng protease thực vât ( mủ mít,hạt mít…) ngày càng phát triển

2.Sơ lược về enzyme protease trong mủ mít

2.1 Định nghĩa enzyme protease:

Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide giữa các L-acid amin,là liên kết chủ yếu trong phân tử protein hay peptide Protease còn có tên gọi khác như :proteinase hay C-N hydrolase

2.2 Phân loại enzym protease:

a Dựa vào nguồn thu nhận enzyme:

-Protease động vật: pepsin, tripsin, chymotripsin -Protease thực vật: papain, bromelin, ficin…

-Protease vi sinh vật: subtilisin, protease vi sinh vật…

b Dựa vào sự phân bố enzyme:

-Protease nội bào (endoprotease) :các enzyme hoạt động chủ yếu bên trong tế bào như: catepsin,…

-Protease ngoại bào(exoprotease): các enzyme này hoạt động ở các mô,các cơ quan đặc hiệu ngoài tế bào như pepsin, chymotrypsin,…

c Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên kết peptide trong phân tử protein:

-Endopeptidase(proteinase):chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trong phân tử protein tạo thành những

đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ (polypeptide mạch ngắn, pepton…)

-Exopeptidase (polypeptidase): chủ yếu phân cắt liên kết peptide ở hai đầu mạch

d Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động:

-Protease serin: Trung tâm hoạt động có nhóm (-OH) như: tripsin, subtilopeptidase

-Protease cystein: Trung tâm hoạt động có nhóm (-SH) như papain, bromelin,…

-Protease acid: trung tâm hoạt động có nhóm (-COOH) như pepsin, renin,…

-Protease kim loại:trung tâm hoạt động có các nguyên

tố kim loại: cacboxypeptidase A,…

e Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease:

-Protease acid: pepsin, renin,… hoạt động ở vùng acid

-Protease kiềm: Trypsin,chymotrypsin,… hoạt động ở vùng pH kiềm

-Protease trung tính: amylase,papain,… hoạt động ở vùng pH trung tính

2.3 Ứng dụng của enzyme protease trong mủ mít:

Khả năng thay thế renin của enzym protease mủ mít trong công nghệ chế biến sữa:

Công nghệ chế biến các sản phẩm từ sữa không thể không sử dụng các chế phẩm enzym Có thể nói, các chế phẩm enzym đóng vai trò quyết định để tạo ra các sản phẩm sữa Thông thường để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta sử dụng enzym renin thu nhận từ dạ dày bê Trong 10 năm trở lại đây xu hướng sử dụng enzym protease thực vật ngày càng phát triển như papain từ nhựa cây đu đủ, bromelin từ trái dứa hoặc ficin từ cây sung đã

được nghiên cứu nhiều trên thế giới Nhưng hiện nay enzym protease từ mủ mít chỉ có một công trình nghiên cứu tại Ai Cập Nơi mà có những thử nghiệm đầu tiên và tìm thấy một vài ứng dụng của enzym protease trong lĩnh vực sản xuất bơ, phomai…

3 Các phương pháp tinh sạch và độ tinh sạch:

-Tủa cồn

-Tủa aceton

-Tủa sunfat amon

-Sắc kí lọc gel

-Sắc kí trao đổi ion trên DEAE-cellulose

II- QUI TRÌNH THU NHẬN

1 Thu nhận:

-Cách tiến hành lấy mủ: lau cuống trái ,dao và hũ nhựa đựng mủ bằng bông tẩm cồn Hủ nhựa để trong thùng

đá, dùng dao inox cắt đứt phần cuống trái, khi hết mủ tiếp tục cắt cách vết cắt trước khoảng 1-2cm, làm như thế cho đến khi vết cắt tiếp xúc với ruột trái mít Mủ thu nhận được bảo quản lạnh và đưa về phòng thí nghiệm

để giữ lạnh trong tủ đông

Sơ đồ qui trình:

Giải thích qui trình

• Hòa tan

-Đối với mủ tươi: cân khối lượng mủ và hoà tan đệm

phosphat 0.05M pH 7.5 đã làm lạnh theo tỉ lệ: 1g mủ:

10ml đệm Khuấy bằng đũa khuấy trong 15 phút và thực

hiện trong tủ lạnh (2oC)

Mủ mít Hòa tan

Đệm phosphat 0.05 M pH 7.5

Lọc thu dịch

Sắc ký trao đổi ion trên DEAE-Cellulose

Enzym Protease

Tủa acetone Tủa cồn

Tủa (NH4)2SO4

Sắc ký lọc gel

Điện di

-Đối với mủ đông khô: hòa tan mủ bằng đệm phosphat theo tỉ lệ 20mg: 3ml đệm phosphat 0.05M pH 7.5

-Đệm phosphat 0.05M pH 7.5 được pha như sau

-Dung dich mononatri orthophosphat 0.05M: cân 7.8005g NaH2PO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000ml bằng nước cất(dung dịch a)

-Dung dịch đinatri hydrophosphat: 17.907g

NaH2PO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000ml bằng nước cất (dung dịch b)

-Trộn 80ml dung dịch a, 420ml dung dịch b(tỉ lệ dung dịch a: dung dịch b là 16:84)và định mức đến 1000ml thu dung dịch đệm phosphat 0.05M pH7.5 (nếu đo pH không phù hợp phải dùng dung dịch hoặc dung dịch b chỉnh pH)

• Lọc: Dùng giấy lọc thô để tách riêng phần không

tan,dung dịch sau lọc tiếp tục tinh sạch Thực hiện trong tủ lạnh (2oC)

• Tinh sạch

 Tinh sạch theo phương pháp tủa sunfat amon [(NH 4 ) 2 SO 4]:

Sunfat amon là muối trung tính có khả năng gây tủa thuận nghịch thường được sử dụng nhiều trong phòng thí nghiệm để tủa protein, enzyme nhờ khả năng không gây biến tính và có độ hòa tan cao Dung dịch protein và enzyme khi bổ sung (NH4)SO4 các ion NH4+ và SO4-2 sẽ trung hòa điện tích của protein hoặc enzym ,các phân tử mất điện tích không còn đẩy nhau mà liên kết lại thành tủa

-Sau khi tủa ,protein và enzyme thu được còn giữ lại một lượng nhỏ muối (NH4)2SO4 do vậy phải loại muối nhờ quá trình thẩm tích qua màng bán thấm (túi cetophan)

Quy trình tủa sunfat amon (NH 4 ) 2 SO 4 như sau:

Giải thích một số công đoạn:

-Tủa (NH 4 ) 2 SO 4: muối để lạnh và cho từ từ vào dịch trích

ly, khuấy đều nhẹ để tránh biến tính protein Quá trình tủa được tiến hành ở nhiệt độ 20C, thời gian tủa 30phút

-Ly tâm: khi tủa hình thành tiến hành ly tâm tủa với tốc

độ 4000vòng/phút trong 10 phút, thu tủa Trong quá trình

ly tâmnhiệt độ tăng cùng với thời qian nên cần làm lạnh dịch kỹ trước khi ly tâm

-Hòa tan tủa: tủa được hòa tan trong đệm phosphat 0.05M

Dịch trích ly

Tủa (NH4)2SO4

Để yên 30 phút nhiệt độ 2 0 C

Ly tâm thu tủa

Hòa tan tủa

Thẩm tích

Dịch protease

Dịc h

Đệm phosphat

0.05M ph7.5

-Thẩm tích: dịch enzym trên được thẩm tích loại muối

trong túi Celophan đối dung dịch đệm phsphat 0.05M pH 7.5 có khuấy để rút ngắn thời gian thẩm tích Quá trình được thực hiện ở nhiệt độ thấp (40C) và kết thúc khi dịch thẩm tích không cho kết tủa trắng với BaCl2 1%, Sau đó, dịch enzym được đông khô

 Tinh sạch theo phương pháp tủa cồn

Protein được bao bọc bởi lớp vỏ hydrat, cồn là dung môi hữu cơ háo nước nên khi bổ sung cồn vào dung dịch

có chứa enzym hòa tan, nó sẽ bóc lớp vỏ hydrat gây tủa protein

Cách thực hiện: enzym rất dễ biến tính với dung môi hữu cơ nên trước khi tủa cần làm lạnh dung dịch chứa protein và enzym, cồn ở nhiệt độ -40C Rót cồn chảy theo thành cốc để tránh biến tính enzym Để lạnh cho đến khi xuất hiện tủa, tiến hành ly tâm 4000v/phút trong 10 phút Thu tủa, để bay hơi tự nhiên trong tủ lạnh

 Tinh sạch theo phưong pháp tủa acetone

Acetone cũng là tác nhân tủa protein và enzym Khác với muối trung tính,acetone là dung môi hữu cơ háo nứơc, khi bổ sung acetone vào dung dịch có chứa enzym hòa tan,

nó sẽ hút lớp áo nước của phân tử enzym, do vậy cá enzym kết với nhau tủa xuống

Sắc kí lọc gel

Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel

filtration)

Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra

Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein

enzyme Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học

Tóm lại bằng phương pháp lọc rây phân tử người ta thể tách các chất có trọng lượng phân tử khác nhau có trong hỗn hợp Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loại muối thay cho quá trình thẩm tích

 Sắc kí trao đổi ion trên DEAE-cellulose :

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc

dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion.

Để tách enzyme protease từ mủ mít ra khỏi hỗn hợp Qua Sắc kí trao đổi ion các enzyme khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau trong đó chứa phần chiết có enzyme cần thu với nồng độ cao nhất

 Điện di :

Điện di là quá trình phần tử tích điện chuyển động nhờ một điện trường di qua một hỗn hợp chất

Trong điện di, chất mang được tạo thành từ nhiều chất khác nhau : giấy Cellullose-acetate, gel poliacrylamide, gel agarose, tinh bột Và cũng có rất nhiệu loại điện di : điện di ống, lớp mỏng hoặc tờ mỏng (trong bài này ta sử dụng điện di poliacrylamide)

Phương pháp điện di được dùng để kiểm tra độ tinh sạch protein sau khi qua quá trình tách chiết và tinh chế Ngoài ra nó còn được dùng để xác định gián tiếp trọng lượng phân tử của mẫu vừa tách

Nguyên tắc :

Dưới tác dụng của điện trường, các chất có phân tử lượng khác nhau có trong mẫu sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực

âm của điện trường.Sự di chuyển phụ thuộc vào điện tích, hình dạng, kích thước, thành phần hóa học và lực điện trường Khi quá trình phận tách kết thúc,các chất có cùng phân tử lượng tập trung lại thành dãy(vạch) ngang ở các vị trí khác nhau trên chất mang Sau đó những vạch này được phát hiện nhờ các phương pháp nhuộm màu, autoradiography, định lượng bằng các phương pháp quét qua dencitometer

Tùy thuộc vào trọng lượng phân tử của protein mà sử dụng gel có nồng độ thích hợp.Nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra

lỗ gel lớn , cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn,ngược lại nồng độ cao sẽ cho lỗ gel nhỏ,vì vậy chỉ có khả năng phân tách những phân tử sinh học có kích thước nhỏ

Quá trình điện di chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ, đệm,

pH và sự ổn định của dòng điện

Định lượng và đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm

protein

Các phương pháp xác định hàm lượng protein

Protein sau khi đã được tách chiết và làm sạch có

thể định lượng được Nếu protein nghiên cứu là

enzyme thì việc định lượng thông qua xác định hoạt

độ của enzyme (theo quy ước quốc tế: 1 đơn vị hoạt

độ enzyme là lượng enzyme làm chuyển hoá 1 mol 

cơ chất trong 1 phút ở các điều kiện tiêu chuẩn) Như vậy cứ sau các bước tách chiết và làm sạch protein người ta thấy tổng lượng protein giảm nhưng hoạt độ enzyme tăng nghĩa là hoạt độ riêng tăng rất cao

Protein được coi là sạch nếu những bước tách chiết

và làm sạch sau không làm tăng hoạt độ riêng của

chúng nữa, và chỉ khi đó ta mới hoàn thành việc tách chiết và làm sạch protein Nếu protein không phải là enzyme thì ta có thể định lượng chúng bằng các

phương pháp khác

III.KẾT QUẢ :

Bảng so sánh hiệu suất và độ tinh sạch

Giai đoạn Độ tinh sạch (ŋ) Hiệu suất %

Dựa vào các tài liệu tham khảo được, nhóm chúng tôi

đã tổng hợp các bảng số liệu so sánh các hiệu suất và độ tinh sạch trong các phương pháp tủa Đối với phương pháp tủa cồn va aceton cho kết quả thấp, đặc biêt là aceton hầu như không tạo được tủa( sau 5h) Và kết quả cho thấy với phương pháp tủa bằng sunfat amon là có kết quả được coi

là tối ưu nhất

Và đây là bảng so sánh riêng trong phương pháp tủa bằng sunfat amon với những nồng độ khác nhau

Độ tinh sạch (ŋ) Hiệu suất thu hồi (%)