THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.AWAMORI VÀ ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ BA SA LÀM NGUYÊN LIỆU CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HÓA HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.AWAMORI VÀ ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ BA SA LÀM NGUYÊN LIỆU CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC Họ tên sinh viên: NGUYỄN THÚY DIỄM Ngành: CƠNG NGHỆ HĨA HỌC Niên khóa: 2006 – 2010 Tháng 09/2010 THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.AWAMORI VÀ ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ BA SA LÀM NGUYÊN LIỆU CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC Tác giả NGUYỄN THÚY DIỄM Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp kỹ sư ngành CƠNG NGHỆ HĨA HỌC Giảng viên hướng dẫn TS VŨ VĂN ĐỘ CN ĐỖ THỊ TUYẾN Tháng 09 năm 2010 ii LỜI CẢM TẠ Lời đầu tiên, kính ghi ơn ơng bà, cha mẹ sinh thành nguồn động viên, khích lệ cho chúng q trình học tập suốt thời gian thực luận văn tốt nghiệp Em xin gởi lời lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Viện Nghiên Cứu Sinh Học Nhiệt Đới Gởi lời cảm ơn chân thành đến TS Vũ Văn Độ, CN Đỗ Thị Tuyến tận tình hướng dẫn em Trong suốt trình thực hiện, thầy ln nhắc nhở, sửa chữa sai sót không ngừng động viên tạo điều kiện cho chúng tơi hồn thành tốt luận văn tốt nghiệp Em chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Cơng Nghệ Hóa Học trường Đại học Nơng Lâm Tp HCM tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm quý báu bạn lớp DH06HH nhiệt tình giúp đỡ em suốt thời gian năm học tập trường Mặc dù có nhiều cố gắng khóa luận chắn khơng tránh khỏi thiếu sót, kính mong nhận góp ý từ thầy bạn để khóa luận hồn thiện Cuối em xin chúc TS Vũ Văn Độ, CN Đỗ Thị Tuyến, q Thầy Cơ mơn Cơng Nghệ Hóa Học tồn thể bạn lớp Cơng Nghệ Hóa Học K32 dồi sức khỏe thăng tiến đường nghiệp TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2010 Sinh viên Nguyễn Thúy Diễm iii TÓM TẮT Tên đề tài: “THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.AWAMORI VÀ ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ BA SA LÀM NGUYÊN LIỆU CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC” Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THUÝ DIỄM Đơn vị: DH06HH, Bộ mơn Cơng nghệ Hóa Học – ĐH Nông Lâm Tp HCM Thời gian thực hiện: học kỳ II, năm học 2009-2010 Địa điểm: Viện Sinh Học Nhiệt Đới Mục đích đề tài: • Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Asp awamori, khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến enzyme • Tìm điều kiện nồng độ, nhiệt độ, thời gian để tối ưu hố q trình thuỷ phân nội tạng cá Ba Sa enzyme Protease Phương pháp thực hiện: • Tìm hiểu tổng quan tài liệu đề tài • Tính thông số điều kiện cần thiết q trình thí nghiệm Kết • Enzyme thơ thu sau q trình tủa cồn 40C có hoạt tính 170,594 U/gCP, hàm lượng 72,65 mg/gCP • Qua q trình khảo xác theo pH, nhiệt độ độ bền nhiệt, ta kết luận enzyme protease hoạt động tối ưu đệm phosphate pH=7, nhiệt độ 500C dễ hoạt tính theo thời gian • Áp dụng phương pháp thực nghiệm nhân tố, qua số liệu đồ ta thấy nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân thời gian phản ứng ảnh hưởng quan trọng đến hàm lượng protein đạm amin tạo thành • Chạy chương trình JMP 4.0 xác định hai phương trình: iv + Phương trình protein theo yếu tố Y = 6,7287 + 0,7314X1 + 0,2785X2 + 0,9753X3 + 0,6711X1X2 - 0,2828X12 0,4588X22 - 0,719X32 R2=0,86 + Phương trình protein theo yếu tố Y = 18,0464 + 1,2562 X1 - 1,9872X2 + 1,05958X3 - 1,537X12 - 3,01593X22 1,2364X32 R2=0,81 Với: X1: Nồng độ enzyme X2: nhiệt độ thủy phân X3: thời gian phản ứng • Xác định điều kiện tối ưu: Nồng độ 0,78%, nhiệt độ 470C, thời gian h 42 phút • Đã thử nghiệm sản xuất bột nội tạng cá làm nguyên liệu phối trộn để chế biến thức ăn gia súc v SUMMARY Project: “Receiving Protease enzyme from Asp awamori fungus and applying to the hydrolytic process of Basa fish’s viscera in order to use as a protein’s resources for producing animal food” Practical student: NGUYEN THUY DIEM Address: class DH06HH, major Chemical Engineering, Chemical Engineering Department, Nong Lam University Instructor: Dr Vu Van Do Place: Institute of Tropical Biology PURPOSE: • To receive protease enzyme from Asp awamori fungus and to investigate influential factors in enzyme activity • To find out the optimum concentration, temperature and time in hydrolytic process of Basa fish’s viscera by protease enzyme • Experimental producing powder in order to use as a material for producing animal food METHOD: • To study overview document • To find out the suitable factors in the experiments RESULTS : • Raw enzyme from the precipitive process by ethanol 40C that has 170,594 U/g degree of activity and 72,65 mg/g content • Protease enzyme has optimum degree of activity in phosphate buffer at pH=7, temperature 500C and easily to decrease the activity for a long time • Enzyme concentration, hydrolytic temperature and reaction time influence signifiacantly on the protein and amino acids content • Applying the JMP 4.0 program and receive two equation: vi + Protein equation with three factors: Y = 6,7287 + 0,7314X1 + 0,2785X2 + 0,9753X3 + 0,6711X1X2 - 0,2828X12 0,4588X22 - 0,719X32 R2=0,86 + Amino acid equation with three factors: Y = 18,0464 + 1,2562 X1 - 1,9872X2 + 1,05958X3 - 1,537X12 - 3,01593X22 1,2364X32 R2=0,81 Where: X1: enzyme concentration, X2: hydrolytic temperature, X3: reaction time • Optimum condition: concentration of enzyme is 0,78% at temperature 470C in hours 42 minutes • Experimented producing powder in order to use as a protein’s resources for producing animal food vii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT iv MỤC LỤC viii DANH MỤC CÁC HÌNH xiii DANH MỤC CÁC BẢNG xv Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Nội dung đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Khát quát chung enzyme 2.1.1 Sơ lược lịch sử enzyme 2.1.2 Định nghĩa enzyme 2.1.3 Tính ưu việt enzyme 2.1.4 Nguồn vật liệu để thu nhận enzyme 2.1.5 Công nghệ sản xuất enzyme 2.2 Khát quát chung enzyme protease [5] 2.2.1 Định nghĩa 2.2.2 Phân loại Protease 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân enzyme 2.2.3.1 Ảnh hưởng nồng đồ enzyme .8 2.2.3.2 Ảnh hưởng nồng độ chất 2.2.3.3 Ảnh hưởng chất kìm hãm chất hoạt hóa 2.2.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ 2.2.3.5 Ảnh hưởng pH môi trường 2.2.3.6 Ảnh hưởng thời gian thủy phân .9 2.2.3.7 Ảnh hưởng lượng nước .10 2.2.4 Ứng dụng Protease 10 2.3 Khát quát chung nấm Aps Awamori 12 viii 2.4 Phương pháp thu nhận enzyme từ vi sinh vật phương pháp lên men bề mặt 12 2.4.1 Khái quát 12 2.4.2 Ưu điểm 12 2.4.3 Nhược điểm 13 2.4.4 Phương pháp lên men bề mặt với môi trường bán rắn 13 2.5 Thu nhận enzyme 13 2.6 Cá Ba Sa phế liệu trình chế biến 13 2.6.1 Đặc điểm sinh học cá Ba Sa [22] 13 2.6.1.1 Phân loại khoa học 13 2.6.1.2 Hình thái 14 2.6.1.3 Phân bố 15 2.6.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng 15 2.6.1.5 Đặc điểm sinh trưởng 15 2.6.1.6 Đặc điểm sinh sản 15 2.6.2 Tình hình sản xuất cá Ba Sa Việt Nam 15 2.6.3 Phế liệu cá 16 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 3.1 Đối tượng nguyên cứu 17 3.1.1 Vật liệu 17 3.1.2 Hóa chất 17 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 18 3.2 Phương pháp nguyên cứu thu nhận enzyme Protease 18 3.2.1 Thu nhận enzyme từ vi sinh vật phương pháp lên men bề mặt sử dụng chất bán rắn 19 3.2.1.1 Nấm mốc Asp Awamori 19 3.2.1.2 Hóa chất 19 3.2.1.3 Thiết bị 19 3.2.1.4 Chuẩn bị môi trường .19 3.2.1.5 Nuôi cấy nấm mốc Asp Awamori 19 3.2.3 Xác định protein phương pháp Bradford 20 ix 3.2.3.1 Nguyên tắc .20 3.2.3.2 Tiến hành thí nghiệm .21 a Hóa chất thiết bị 21 3.2.3.3 Tính kết .22 3.2.4 Xác định hoạt độ enzyme protease 22 3.2.4.1 Nguyên tắc .22 3.2.4.2 Tiến hành thí nghiệm .22 3.2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme 25 3.2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme 25 3.2.4.5 Độ bền nhiệt enzyme theo thời gian 26 3.2.5 Tinh enzyme protease sắc khí lọc gel (sắc ký rây phân tử) 27 3.2.5.1 Bản chất phương pháp .27 3.2.5.2 Nguyên tắc .27 3.2.5.3 Hóa chất thiết bị 27 3.2.5.4 Tiến hành chạy sắc ký .28 3.2.6 Phân tích protein điện di gel polyacrylamide (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 30 3.2.6.1 Nguyên tắc .30 3.2.6.2 Xác định trọng lượng phân tử protein 31 3.3 Các phương pháp phân tích hóa học từ nội tạng cá Ba Sa 32 3.3.1 Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu 32 3.3.2 Phương pháp xác định khoáng tổng số 33 3.3.3 Xác định hàm lượng Canxi 34 3.3.4 Xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (Định lượng nitơ tổng số) 35 3.3.5 Phương pháp định lượng Phospho tổng số quang phổ kế 37 3.3.6 Xác định lượng đạm amin theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá mức độ thủy phân protein 39 3.3.7 Xác định protein hòa tan phương pháp biuret 40 3.3.8 Xác định NH3 cách chưng cất theo nước 41 x Phụ lục 1.3: Đường chuẩn Phospho Phụ lục 2: Khảo sát biến động Protein, đạm amin NH3 Phụ lục 2.1: Số liệu thể biến động Protein a Sự biến động protein 40oC Thời Nồng độ enzyme gian 0h 0,5% 0,7% 0,9% 1,846 1,794 1,806 1h 3,265 3,635 4,151 2h 3,689 4,443 4,721 3h 3,986 4,674 5,14 4h 4,012 4,863 5,194 5h 4,213 5,109 5,583 6h 4,593 5,229 5,732 7h 4,769 5,346 5,742 8h 5,235 5,592 5,746 9h 5,351 5,887 5,898 10h 5,498 5,956 5,947 84 b.Sự biến động protein 50oC Thời Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% gian 0h 2,468 2,44 2,225 1h 4,344 4,83 4,661 2h 4,844 5,775 5,435 3h 4h 5h 4,977 5,552 5,739 6,179 6,374 6,578 6,098 6,218 6,426 6h 5,86 6,697 6,46 7h 8h 6,331 6,728 6,724 6,845 6,653 6,922 9h 6,935 7,107 7,151 10h 7,026 7,335 7,337 c Sự biến động protein 60oC Thời gian 0h Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% 1,764 2,599 2,609 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10h 2,334 2,766 3,047 3,124 3,67 3,981 4,202 4,361 4,389 4,403 4,249 5,275 5,517 5,975 6,018 6,524 6,647 6,897 7,055 7,112 85 4,761 5,553 5,793 6,291 6,828 6,9 7,065 7,111 7,159 7,216 Phụ lục 2.2: Số liệu thể biến động đạm amin a Sự biến động đạm amin 400C Thời gian 0h Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% 9,197 11,116 11,369 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10h 9,568 9,893 10,698 10,895 11,213 11,461 11,58 11,855 11,961 12,245 12,181 12,858 13,386 13,75 14,414 14,936 15,345 15,496 15,598 15,719 12,695 13,653 14,562 14,986 15,772 15,815 15,895 16,081 16,09 16,311 b Sự biến động đạm amin 50oC Thời gian 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10h Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% 12,023 14,633 14,228 12,356 15,285 15,202 12,897 15,638 15,813 13,258 16,63 16,745 13,453 17,097 17,199 13,867 17,403 17,631 14,153 17,758 17,903 14,46 18,065 18,119 14,468 18,517 18,295 14,469 18,521 18,772 14,472 18,522 18,786 86 b.Sự biến động đạm amin 60oC Thời Nồng độ enzyme gian 0h 0,5% 0,7% 0,9% 5,32 5,49 5,45 1h 6,42 7,44 7,63 2h 6,89 8,03 8,06 3h 7,27 8,25 8,43 4h 7,47 8,39 8,72 5h 7,63 8,68 9,01 6h 7,91 8,93 9,65 7h 8,22 9,56 9,75 8h 8,24 9,8 9,85 9h 8,39 10,04 10,05 10h 8,45 10,08 10,12 Phụ lục 2.3: Số liệu thể biến động NH3 a Sự biến động NH3 400C Thời gian 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10h Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% 0,698 0,678 0,504 0,752 0,695 0,534 0,893 0,756 0,554 0,926 0,822 0,584 1,035 0,872 0,638 1,096 0,952 0,684 1,135 0,999 0,691 1,306 1,075 0,721 1,39 1,196 0,756 1,453 1,217 0,825 1,506 1,306 0,913 87 b Sự biến động NH3 500C Thời gian 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10h Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% 0,623 0,634 0,646 0,654 0,658 0,657 0,661 0,691 0,669 0,699 0,708 0,682 0,713 0,723 0,692 0,726 0,732 0,699 0,764 0,756 0,726 0,854 0,801 0,787 0,901 0,842 0,836 0,956 0,96 0,892 1,001 0,99 0,986 c Sự biến động NH3 600C Thời Nồng độ enzyme 0,5% 0,7% 0,9% gian 0h 0,696 0,647 0,695 1h 0,708 0,654 0,698 2h 0,719 0,664 0,718 3h 0,764 0,707 0,733 4h 0,847 0,731 0,783 5h 0,926 0,776 0,859 6h 0,999 0,826 0,923 7h 1,053 0,903 0,954 8h 1,171 1,035 1,001 9h 10h 1,268 1,358 1,125 1,263 1,156 1,266 88 Phụ lục 3: Số liệu hàm lượng protein đạm amin để tối ưu hố chương trình JMP 4.0 STN Pattern X1 X2 X3 ++- 1 -1 6,791 8,566 + -1 -1 5,498 12,245 00a 0 -1,68179 2,446 14,693 +-+ -1 5,947 16,311 A00 1,681793 0 6,652 18,011 0A0 1,681793 6,312 8,86 +++ 1 7,216 10,12 0A0 1,681793 6,401 8,793 - -1 -1 -1 3,689 9,893 10 +-+ -1 5,926 16,319 11 000 0 6,692 17,789 12 00a 0 -1,68179 2,449 14,691 13 -++ -1 1 4,403 8,456 14 000 0 6,698 17,811 15 000 0 6,691 17,799 16 0a0 -1,68179 4,911 14,362 17 a00 -1,68179 0 5,423 13,526 18 + -1 -1 4,721 13,653 19 000 0 6,721 17,823 20 00A 0 1,681793 7,339 18,553 21 + -1 -1 5,495 12,246 22 +++ 1 7,219 10,162 23 -+- -1 -1 2,766 7,123 24 -++ -1 1 4,405 8,492 25 + -1 -1 4,698 13,658 89 Protein Đạm amin 26 STN 000 Pattern 0 X1 X2 X3 6,722 Protein 17,801 Đạm amin 27 0a0 -1,68179 4,896 14,326 28 A00 1,681793 0 6,61 17,999 29 a00 -1,68179 0 5,826 13,533 30 ++- 1 -1 6,795 8,562 31 - -1 -1 -1 3,684 9,895 32 -+- -1 -1 2,782 7,013 33 00A 0 1,681793 7,342 18,533 34 000 0 6,712 17,836 Phụ lục 4: Kết xử lý số liệu JMP 4.0 Phụ lục 4.1: Response protein Protein Actual 6.28571 4.71429 3.14286 Protein Predicted P F F 10.52061 |t| 6.728771 0.259184 25.96