THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.AWAMORI VÀ ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ BA SA LÀM NGUYÊN LIỆU CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC

THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.AWAMORI VÀ ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ BA SA LÀM NGUYÊN LIỆU CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC Tác giả NGUYỄN THÚY DIỄM Khóa luận được

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THU NHẬN ENZYME PROTEASE

THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.AWAMORI

VÀ ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ BA SA

LÀM NGUYÊN LIỆU CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC

Tác giả

NGUYỄN THÚY DIỄM

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành

LỜI CẢM TẠ

Lời đầu tiên, con kính ghi ơn ông bà, cha mẹ đã sinh thành ra con và là nguồn động viên, khích lệ cho chúng con trong quá trình học tập cũng như trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

Em xin gởi lời lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và Viện Nghiên Cứu Sinh Học Nhiệt Đới

Gởi lời cảm ơn chân thành đến TS Vũ Văn Độ, CN Đỗ Thị Tuyến đã tận tình hướng dẫn em Trong suốt quá trình thực hiện, thầy cô luôn nhắc nhở, sửa chữa những sai sót và cũng không ngừng động viên tạo điều kiện cho chúng tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

Em chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Công Nghệ Hóa Học trường Đại học Nông Lâm Tp HCM đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cùng các bạn trong lớp DH06HH đã nhiệt tình giúp

đỡ em trong suốt thời gian 4 năm học tập tại trường

Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng khóa luận này chắc chắn không tránh khỏi thiếu sót, kính mong nhận được những góp ý từ thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn thiện hơn

Cuối cùng em xin chúc TS Vũ Văn Độ, CN Đỗ Thị Tuyến, quý Thầy Cô trong

bộ môn Công Nghệ Hóa Học và toàn thể các bạn trong lớp Công Nghệ Hóa Học K32 dồi dào sức khỏe và thăng tiến trên con đường sự nghiệp

TP Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2010

Sinh viên

TÓM TẮT

Tên đề tài: “THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC

ASP.AWAMORI VÀ ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG

CÁ BA SA LÀM NGUYÊN LIỆU CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC”

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THUÝ DIỄM

Đơn vị: DH06HH, Bộ môn Công nghệ Hóa Học – ĐH Nông Lâm Tp HCM Thời gian thực hiện: học kỳ II, năm học 2009-2010

Địa điểm: Viện Sinh Học Nhiệt Đới

• Tìm hiểu tổng quan tài liệu đề tài

• Tính những thông số và những điều kiện cần thiết trong quá trình thí nghiệm

500C và dễ mất hoạt tính theo thời gian

• Áp dụng phương pháp thực nghiệm một nhân tố, qua những số liệu và đồ thì ta thấy nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân và thời gian phản ứng ảnh hưởng quan trọng đến hàm lượng protein và đạm amin tạo thành

• Chạy chương trình JMP 4.0 xác định được hai phương trình:

+ Phương trình protein theo 3 yếu tố

SUMMARY

Project: “Receiving Protease enzyme from Asp awamori fungus and applying

to the hydrolytic process of Basa fish’s viscera in order to use as a protein’s resources for producing animal food”

Practical student: NGUYEN THUY DIEM

Address: class DH06HH, major Chemical Engineering, Chemical Engineering Department, Nong Lam University

Instructor: Dr Vu Van Do

Place: Institute of Tropical Biology

PURPOSE:

• To receive protease enzyme from Asp awamori fungus and to investigate

influential factors in enzyme activity

• To find out the optimum concentration, temperature and time in hydrolytic process of Basa fish’s viscera by protease enzyme

• Experimental producing powder in order to use as a material for producing

animal food

METHOD:

• To study overview document

• To find out the suitable factors in the experiments

+ Protein equation with three factors:

• Experimented producing powder in order to use as a protein’s resources for

producing animal food

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC viii

DANH MỤC CÁC HÌNH xiii

DANH MỤC CÁC BẢNG xv

Chương 1MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Khát quát chung về enzyme 3

2.1.1 Sơ lược về lịch sử enzyme 3

2.1.2 Định nghĩa về enzyme 3

2.1.3 Tính ưu việt của enzyme 4

2.1.4 Nguồn vật liệu để thu nhận enzyme 4

2.1.5 Công nghệ sản xuất enzyme 5

2.2 Khát quát chung về enzyme protease [5] 6

2.2.1 Định nghĩa 6

2.2.2 Phân loại Protease 6

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng enzyme 8

2.2.3.1 Ảnh hưởng của nồng đồ enzyme 8

2.2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 8

2.2.3.3 Ảnh hưởng của chất kìm hãm và chất hoạt hóa 8

2.2.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 8

2.2.3.5 Ảnh hưởng của pH môi trường 9

2.2.3.6 Ảnh hưởng thời gian thủy phân 9

2.2.3.7 Ảnh hưởng của lượng nước 10

2.2.4 Ứng dụng Protease 10

2.3 Khát quát chung về nấm Aps Awamori 12

2.4 Phương pháp thu nhận enzyme từ vi sinh vật bằng phương pháp lên men

bề mặt 12

2.4.1 Khái quát 12

2.4.2 Ưu điểm 12

2.4.3 Nhược điểm 13

2.4.4 Phương pháp lên men bề mặt với môi trường bán rắn 13

2.5 Thu nhận enzyme 13

2.6 Cá Ba Sa và phế liệu trong quá trình chế biến 13

2.6.1 Đặc điểm sinh học của cá Ba Sa [22] 13

2.6.1.1 Phân loại khoa học 13

2.6.1.2 Hình thái 14

2.6.1.3 Phân bố 15

2.6.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng 15

2.6.1.5 Đặc điểm sinh trưởng 15

2.6.1.6 Đặc điểm sinh sản 15

2.6.2 Tình hình sản xuất cá Ba Sa ở Việt Nam 15

2.6.3 Phế liệu cá 16

Chương 3VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

3.1 Đối tượng nguyên cứu 17

3.1.1 Vật liệu 17

3.1.2 Hóa chất 17

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị 18

3.2 Phương pháp nguyên cứu thu nhận enzyme Protease 18

3.2.1 Thu nhận enzyme từ vi sinh vật bằng phương pháp lên men bề mặt sử dụng chất bán rắn 19

3.2.1.1 Nấm mốc Asp Awamori 19

3.2.1.2 Hóa chất 19

3.2.1.3 Thiết bị 19

3.2.1.4 Chuẩn bị môi trường 19

3.2.1.5 Nuôi cấy nấm mốc Asp Awamori 19

3.2.3 Xác định protein bằng phương pháp Bradford 20

3.2.3.1 Nguyên tắc 20

3.2.3.2 Tiến hành thí nghiệm 21

a Hóa chất và thiết bị 21

3.2.3.3 Tính kết quả 22

3.2.4 Xác định hoạt độ của enzyme protease 22

3.2.4.1 Nguyên tắc 22

3.2.4.2 Tiến hành thí nghiệm 22

3.2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme 25

3.2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme 25

3.2.4.5 Độ bền nhiệt của enzyme theo thời gian 26

3.2.5 Tinh sạch enzyme protease bằng sắc khí lọc gel (sắc ký rây phân tử) 27

3.2.5.1 Bản chất phương pháp 27

3.2.5.2 Nguyên tắc 27

3.2.5.3 Hóa chất và thiết bị 27

3.2.5.4 Tiến hành chạy sắc ký 28

3.2.6 Phân tích protein bằng điện di trên gel polyacrylamide (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 30

3.2.6.1 Nguyên tắc 30

3.2.6.2 Xác định trọng lượng phân tử của protein 31

3.3 Các phương pháp phân tích hóa học từ nội tạng cá Ba Sa 32

3.3.1 Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu 32

3.3.2 Phương pháp xác định khoáng tổng số 33

3.3.3 Xác định hàm lượng Canxi 34

3.3.4 Xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (Định lượng nitơ tổng số) 35

3.3.5 Phương pháp định lượng Phospho tổng số bằng quang phổ kế 37

3.3.6 Xác định lượng đạm amin theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá mức độ thủy phân protein 39

3.3.7 Xác định protein hòa tan bằng phương pháp biuret 40

3.3.8 Xác định NH3 bằng cách chưng cất theo hơi nước 41

3.4 Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá

Ba Sa 43

3.5 Thí nghiệm xác định điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân nội tạng cá Ba Sa 44

3.6 Thí nghiệm sản xuất thử bột nguyên liệu thô dùng phối trộn chế biến thức ăn gia súc 46

Chương 4KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48

4.1 Một số chỉ tiêu của nấm mốc Asp awomori 48

4.1.1 Chiết xuất thô enzyme protein từ nấm mốc Asp awamori và kết tủa enzyme bởi cồn lạnh 48

4.1.2 Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt của enzyme protease 48

4.1.2.1 pH tối ưu 48

4.1.2.2 Nhiệt độ tối ưu 49

4.1.2.3 Độ bền nhiệt của enzyme protease 51

4.2 Tiến hành tinh sạch enzyme protease từ nấm mốc Awamori bằng phương pháp lọc gel 52

4.3 Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di 55

4.4 Khảo sát sự ảnh hưởng quá trình thủy phân nội tạng cá Ba Sa bằng enzyme protease thô 59

4.4.1 Một số chỉ tiêu sinh học và hoá học của nội tạng cá Ba Sa 59

4.4.2 Sự biến động hàm lượng protein của chế phẩm thủy phân 60

4.4.3 Sự biến động hàm lượng đạm amin của chế phẩm thủy phân 62

4.4.4 Sự biến động hàm lượng NH3 của chế phẩm thủy phân 64

4.5 Điều kiện tối ưu hóa hàm lượng protein 66

4.6 Điều kiện tối ưu hóa hàm lượng đạm amin 70

4.7 Thí nghiệm sản xuất thử bột nội tạng cá 76

Chương 5KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78

5.1 Kết luận 78

5.2 Kiến nghị 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

PHỤ LỤC 82

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

EDTA : Etilendiamin tetraaxetic axit

TCA: Trichloaxetic axit

UV-Vis: Ultraviolet-visible spectroscopy

OD: Optical Density (trị số mật độ quang)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Quan sát nấm Asp Awamori qua kính hiển vi 12 

Hình 2.2: Cá Ba Sa 14 

Hình 3.1 Sơ đồ nuôi cấy nấm mốc và thu nhận enzyme thô 18 

Hình 3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme 25 

Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme 26 

Hình 3.4 Độ bền nhiệt của enzyme theo thời gian 26 

Hình 3.5 Sơ đồ quá trình thủy phân nội tạng cá Ba Sa 43 

Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease 49 

Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính protease 50 

Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn độ bền nhiệt của enzyme protease 51 

Hình 4.4 Sắc kí chuẩn của hãng AMANO 53 

Hình 4.5 Sắc kí tủa bằng cồn tỉ lệ 1:4 54 

Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn độ tinh sạch của enzyme trước sắc ký, sau sắc ký và của hãng Amano 55 

Hình 4.7 Kết quả chạy điện di của mẫu protein 56 

Hình 4.8 Đồ thị thể hiện sự tương quan giữa log của trọng lượng phân tử và giá trị Rf 57 

Hình 4.9 Khảo sát hàm lượng protein ở 400C 60 

Hình 4.11 Khảo sát hàm lượng protein ở 600C 61 

Hình 4.12 Khảo sát hàm lượng đạm amin ở 400C 62 

Hình 4.13 Khảo sát hàm lượng đạm amin ở 500C 62 

Hình 4.14 Khảo sát hàm lượng đạm amin ở 600C 63 

Hình 4.15 Khảo sát hàm lượng NH3 ở 400C 64 

Hình 4.16 Khảo sát hàm lượng NH3 ở 500C 64 

Hình 4.17 Khảo sát hàm lượng NH3 ở 600C 65 

Hình 4.18 Mô hình thể hiện sự tương thích giữa các yếu tố tác động lên hàm lượng protein 66 

Hình 4.19 Mô hình bề mặt đáp ứng của các yếu tố lên hàm lượng protein .68 

Hình 4.20 Ảnh hưởng từng yếu tố lên hàm lượng protein 69 

Hình 4.21 Tương tác của các yếu tố lên hàm lượng protein 69 

Hình 4.22 Mô hình thể hiện sự tương thích giữa các yếu tố tác động lên hàm lượng đạm amin 70 

Hình 4.23 Mô hình bề mặt đáp ứng của các yếu tố lên hàm lượng đạm amin 72 

Hình 4.24 Ảnh hưởng từng yếu tố lên hàm lượng đạm amin 73 

Hình 4.25 Tương tác của các yếu tố lên hàm lượng đạm amin 73 

Hình 4.26 Sơ đồ quy trình sản xuất bột nội tạng 76 

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của cá Ba Sa 14 

Bảng 3.1 Xây dựng đồ thị dung dịch albumine chuẩn 21 

Bảng 3.2: Xây dựng đường chuẩn tyrosine chuẩn 23 

Bảng 3.3 Mã hóa các yếu tố khảo sát 45 

Bảng 3.4 Bố trí thực nghiệm các điều kiện khảo sát 46 

Bảng 4.1 Hoạt tính Enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme thô của nấm mốc Asp Awamori 48 

Bảng 4.2 Khảo sát pH tối ưu từ pH 6, 7, 8, 9, 10 theo hoạt tính protease (U/g CP)49  Bảng 4.3 Khảo sát nhiệt độ tối ưu từ 30, 40, 50, 60, 70, 80 theo hoạt tính protease (U/g CP) 49 

Bảng 4.4 Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease theo hoạt tính protease (U/g CP) 51 

Bảng 4.7 So sánh độ tinh sạch và hiệu suất của enzyme trước và sau sắc kí 55 

Bảng 4.8 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein trong thang chuẩn 56 

Bảng 4.9 Giá trị Rf từng vạch của của mỗi peak trong mẫu 57 

Bảng 4.10: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở hãng Amano 57 

Bảng 4.11: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở peak 2 58 

Bảng 4.12 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Peak 3 58 

Bảng 4.13 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở mẫu thô 58 

Bảng 4.14 Các chỉ tiêu sinh học và hóa học trên nôi tạng cá Ba Sa chín 59 

Bảng4.15 Tác động các yếu tố khảo sát lên hàm lượng protein 67 

Bảng 4.16 Tác động các yếu tố khảo sát lên hàm lượng đạm amin 71 

Bảng 4.17 Thể hiện giá trị và điều kiên tối ưu của protein 74 

Bảng 4.18 Thể hiện giá trị các điều kiện tối ưu của đạm amin 74 

Bảng 4.19 So sánh các giá trị hàm lượng ở 2 điều kiện tối ưu 75 

Bảng 4.20 So sánh hàm lượng đạm tổng số và đạm amin 77 

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong đời sống và sản xuất, enzyme nói chung và protease nói riêng, được sử dụng ngày càng phổ biến, sản lượng và kim ngạch mua-bán các chế phẩm enzyme trên thị trường thế giới tăng 20-30% mỗi năm Trước đây, chế phẩm protease được sản xuất chủ yếu từ vi sinh, một số ít từ thực vật, phần protease thu nhận từ mô động vật rất nhỏ Gần đây, do những yêu cầu về vệ sinh, an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí kiểm tra chất lượng, giá thành chế phẩm protease từ vi sinh ngày càng cao Trong khi đó, chế phẩm protease thu nhận từ mô động vật và thực vật luôn được xem

là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút được sự quan tâm của các phòng thí nghiệm cũng như các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thương mại Nguồn nguyên liệu từ nội tạng động vật để thu chế phẩm protease ngày càng khan hiếm và không kinh

tế do nội tạng thường được làm thực phẩm

Việt Nam là một trong những quốc gia có nghề cá phát triển nhờ có bở biển trải dài trên 3.000 cây số, khí hậu nhiệt đới là điều kiện đặc biệt thuận lợi cho nghề chăn nuôi thủy sản Trong tổng lượng thủy sản, cá là nguyên liệu có vị trí quan trọng hàng đầu Với 200 loài cá kinh tế, sản lượng 1.500.000 tấn chiếm 70% tổng sản lượng thủy sản nuôi và khai thác hàng năm, với giá trị dinh dưỡng đặc biệt, cá là nguồn thực phẩm quý không thể thiếu trong mỗi bữa ăn hàng ngày và nguyên liệu chế biến ra nhiều sản phẩm xuất khẩu, chiếm tỷ trọng ngày càng lớn trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản Tuy nhiên, sản lượng cá được sử dụng hữu ích chỉ chiếm khoảng gần 50% Nghĩa là trong 70.000 tấn phế liệu thì có trên 30.000 tấn nội tạng cá Theo thói quen, nội tạng cá chỉ được sử dụng làm bột cá chăn nuôi, một phần được chế biến nước mắm, phần lớn

bị thải bỏ vào môi trường, vừa lãng phí vừa gây ô nhiễm

Tình hình trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học, công nghệ ngành thủy sản là sử dụng hợp lý và hiệu quả lượng phế liệu cá rất lớn do các nhà máy chế biến cá tạo ra hàng ngày để sản xuất sản phẩm mới, có giá trị cao Một trong hướng giải quyết yêu cầu trên là thủy phân nguồn nội tạng cá trên tạo ra sản phẩm mới, có giá trị dinh dưỡng, vừa giảm thiểu chất thải, vừa thoả mãn nhu cầu mở rộng mặt hàng thủy sản, nâng cao hiệu quả kinh tế ngành chế biến thủy sản

Với mong muốn góp phần giải quyết yêu cầu trên và sự phân công của bộ môn

CNHH tôi đã thực hiện đề tài: Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Asp Awamori

và ứng dụng trong quá trình thủy phân nội tạng cá Ba Sa dùng chế biến thức ăn gia súc

1.3 Nội dung đề tài

- Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Asp awamori, tủa bằng cồn lạnh

- Khảo sát các thông số tối ưu ảnh hưởng hoạt động của enzyme protease như nhiệt độ, pH, độ bền nhiệt của enzyme theo thời gian

- Tinh sạch enzyme protease bằng sắc ký lọc gel

- Xác định trọng lượng phân tử protein bằng phương pháp điện di

- Xác định các thành phần hóa học trong nội tạng cá: Độ ẩm, phospho, canxi, hàm lượng protein, tro, NH3

- Sử dụng enzyme protease để thủy phân nội tạng cá Ba Sa (phế liệu gây ô nhiễm môi trường) Khảo sát nồng độ, pH, nhiệt độ, thời gian tối ưu để quá trình thủy phân xảy ra tốt nhất

- Xác định các thành phần hóa học trong nội tạng cá Ba Sa đã thuỷ phân: Protein theo phương pháp biuret

Đạm amin

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khát quát chung về enzyme

2.1.1 Sơ lược về lịch sử enzyme

Năm 1883, Payen và Persoz đã phân lập được một số chất có trong lúa nảy mầm có khả năng phá vỡ cấu trúc tinh bột thành đường và đặt tên là diastase hiện nay được gọi là amylase

Năm 1867 Wilhelm Kuhne là một nhà vật lý học người Đức lần đầu tiên dề nghị đặt tên “emzyme” thay thế cho từ ferments

Năm 1897 Edward Buchner là một nhà hóa học người Đức đã khám phá ra những tế bào tự do của cao nấm men có khả năng lên men rượu

Năm 1906, Otto Rohm là người đầu tiên nguyên cứu về những việc sử dụng những sản phẩm enzyme vào trong công nghiệp Ông đã dùng mô tuyến tụy dể thu nhận trypsin sử dụng trong công nghiệp thuộc da

Năm 1926, Jame B.Summer nhà sinh học của Mỹ đã thành công trong việc tách chiết và kết tinh urease dạng tinh thể từ một loại đậu có tên Jack bean

Năm 1930, John H Northop là nhà sinh hóa học người Mỹ đã thành công trong việc tách chiết và tạo tinh thể pepsin và trypsin

2.1.2 Định nghĩa về enzyme

Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Enzyme có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (in-vivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (in-vitro) Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với chất xúc tác hóa học khác Chính

sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện

thường ở ngoài cơ thể (do nhiệt độ, áp suất cao, axit mạnh hay kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu và nhẹ nhàng (370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay axit mạnh )

Hiện nay người ta khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme thu được ở dạng tinh thể Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc biệt như công nghiệp chế biến thực phẩm (bia, rượu, nước chấm, bánh mì…)

2.1.3 Tính ưu việt của enzyme

Enzyme hoạt động xúc tác trong điều kiện “nhẹ nhàng”: nhiệt độ 30 -45oC với

áp suất thông thường, pH thường là axit yếu hay trung tính

Enzyme có tính đặc hiệu cao trên những cơ chất nhất định và xúc tác theo một kiểu phản ứng nhất định

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có thể kiểm soát nhẹ nhàng bằng các yếu tố: nhiệt độ, pH, chất kìm hãm, chất hoạt tính…

Enzyme thường có cường lực xúc tác rất cao nên chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất trong một thời gian ngắn

2.1.4 Nguồn vật liệu để thu nhận enzyme

Nguồn nguyên liệu thu nhận thường là tế bào thực vật, mô động vật và vi sinh vật Từ tuyến tụy và màng dạ dày động vật có thể thu nhận chế phẩm enzyme như: amylase, lipase, proteinase, ribonuclease, đặc biệt là các enzyme như: pepsin, trypsin, chimotrysin Một số enzyme thu nhận từ thực vật như: papain từ nhựa thân và quả đu

đủ, bromelin từ trái dứa hoặc ficin từ các cây quả sung họ ficus

Tuy nhiên, việc khai thác enzyme từ thực vật và động vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hiện nay phần lớn các enzyme được thu nhận từ tế bào vi sinh vật So với việc thu nhận enzyme

từ các nguồn động vật, thực vật việc sản xuất enzyme từ tế bào vi sinh vật có nhiều ưu điểm như sau:

+ Vi sinh vật có chu kỳ sinh sản rất ngắn

+Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú

+Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những vi sinh vật có khả năng tổng hợp

ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một các dễ dàng trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật rất cao

+Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh

+Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có thể tận dụng những phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme tư vi sinh vật và có thể

dễ dàng điều khiển các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy đề có thể thu được hiệu suất cao trong sản xuất

+Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo qui mô công nghiệp

Những điều kiện cần lưu ý khi quyết định xây dựng hoặc nâng cao năng suất của công nghiệp enzyme như sau:

+Giống vi sinh vật: có thể tăng khả năng tổng hợp enzyme bằng nhiều con đường khác nhau Trong đó, biện pháp thay đổi yếu tố di truyền (đột biến, tái tổ hợp) đang được quan tâm

+ Tối ưu hóa quá trình lên men

+Áp dụng những tiến bộ của công nghệ chế tạo máy để tạo ra nhưng thiết bị lên men hiện đại

+ Áp dụng công nghệ cố định enzyme để sử dụng lặp lại được nhiều lần

Ngày nay, người ta đã tìm được nhiều loại enzyme khác nhau, một số đã được khai thác và sử dụng, trong đó protease là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong cả đời sống

2.1.5 Công nghệ sản xuất enzyme

a Công nghệ sản xuất enzyme Protease ở nước ta

Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử

dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino axit từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lên men rượu bằng enzyme cố định trên cột Cũng đã có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt-P450 trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất độc Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên một số thuốc dùng điều trị một số bệnh đặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dưỡng ở trẻ em, đồng thời đã tiến hành sản xuất đại trà Đây là một đóng góp rất thiết thực và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta

b Công nghệ sản xuất enzyme Protease trên thế giới

Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%),

và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%)

2.2 Khát quát chung về enzyme protease [5]

2.2.1 Định nghĩa

Protease là enzyme thuộc nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

2.2.2 Phân loại Protease

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino axit, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino axit hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và hoạt động ở vùng pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease axit: pH 2-4

- Protease trung tính: pH 7-8

- Protease kiềm: pH 9-11

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng enzyme

2.2.3.1 Ảnh hưởng của nồng đồ enzyme

Tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm

2.2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất Nhưng khi tăng nồng độ cơ chất đến một mức độ nào đó, nếu tiếp tục tăng nồng

độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng

Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất, nồng

độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng Vì vậy, với từng enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme

2.2.3.3 Ảnh hưởng của chất kìm hãm và chất hoạt hóa

Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ hay hữu cơ khác nhau Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hóa) hoặc làm giảm (tính kìm hãm) hoạt độ của enzyme Tác dụng của chúng có thể là đặc hiệu hay không đặc hiệu và thay đổi theo từng chất, tùy từng enzyme

Chất kìm hãm (chất ức chế) là chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme Các chất này

có thể là các ion, các phân tử vô cơ hay hữu cơ kể cả protein

Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme chuyển thành dạng hoạt động từ dạng không hoạt động Các chất này thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại hoặc các chất hữu cơ Chất hữu cơ làm tăng hay phục hồi hoạt tính của enzyme một các trực tiếp hay gián tiếp

2.2.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng của enzyme và tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng tới một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá giới hạn đó, tốc độ giới hạn đó

sẽ giảm và dẫn đến mức bị triệt tiêu

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không còn khả năng phục hồi lại hoạt tính

Ngược lại, ở nhiệt độ 00C, enzyme sẽ bị hạn chế rất mạnh nhưng khi đưa nhiệt

độ lên từ từ thì hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp

Ở nhiệt độ thấp (0-500C) vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng Sự tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng

Ở nhiệt độ sau đó (tùy thuộc vào từng loại enzyme, khoảng 550C) vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80-1000C

Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trường

2.2.3.5 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH của môi trường ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein - enzyme Đa số enzyme bền trong khoảng pH = 6-10, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có các yếu tố bền như: cơ chất, coenzyme, Ca2+ …

Mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ…

Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng vẫn có một

số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepsin, protease axit của vi sinh vật….) hoặc khá cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10

2.2.3.6 Ảnh hưởng thời gian thủy phân

Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệt độ… Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thiết trong quá trình thủy phân Khi cơ chất trong quá trình thủy phân hết, quá trình thủy phân kết thúc Thời gian thủy phân thích hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo hiệu suất tốt

Trong thực tế, thời gian thủy phân phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân cụ thể

2.2.3.7 Ảnh hưởng của lượng nước

Với phản ứng thủy phân bởi enzyme thì nước vừa là môi trường để phân tán enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng Nước ảnh hưởng đến tốc độ và chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme Vì thế, nước là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bằng enzyme, nó có thể tăng cường hoặc ức chế của các phản ứng do enzyme xúc tác

sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L sang D làm giảm giá trị sinh học của axit amin) Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ

lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân

Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm và một số loài mắm khác thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải

thiện hương vị của nước mắm Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ

Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt

tính làm đông tụ sữa của chúng Protease từ một số vi sinh vật như A candidus, P

roquerti, B mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát Trong công nghiệp sản

xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn

Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm

tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Protease của A oryzae được dùng để

thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn

Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật Hiện nay, việc đưa các

protease tách từ vi khuẩn (B mesentericus, B subtilis), nấm mốc (A oryzae, A flavus)

và xạ khuẩn (S fradiae, S griseus, S rimosus ) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại

nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng

Trong công nghiêp dệt: Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi được được bóng, dể nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng

Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như:

- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng

- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm

- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh…

- Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm…

2.3 Khát quát chung về nấm Aps Awamori

Giới (regnum): Funlum

Ngành (phylum): Ascomycota

Lớp (class): Ascomycetes

Bộ (order): Eurotiales

Họ (familia): Trichocomaceae

Chi (genus): Aspergillus

Loài (species): Aspergillus awamori

Hình 2.1 Quan sát nấm Asp awamori qua kính hiển vi

2.4 Phương pháp thu nhận enzyme từ vi sinh vật bằng phương pháp lên men bề mặt

2.4.1 Khái quát

Theo phương pháp này giống vi sinh vật hiếu khí sau khi gieo cấy sẽ phát triển trên bề mặt và dần dần lan xuống phía dưới theo các khe hở, các cấu tử thành phần môi trường Môi trường nuôi cấy bề mặt là môi trường rắn và xốp Phương pháp này thích hợp cho các quá trình nuôi cấy nấm mốc, một số trường hợp là xạ khuẩn, cũng

có vài trường hợp nuôi cấy vi khuẩn theo phương pháp này

2.4.2 Ưu điểm

• Nồng độ enzyme tạo thành ở nồng độ môi trường bán rắn cao hơn so với nuôi cấy theo phương pháp chìm khi đã tách tế bào vi sinh vật

• Không cần thiết phức tạp, chủ yếu nuôi cấy trên khay và buồng nuôi, giữ ở nhiệt độ thích hợp, quá trình sản xuất tiêu ít năng lượng

2.4.3 Nhược điểm

• Tốn nhiều diện tích mặt bằng

• Khó cơ khí hóa và đặc biệt là khó tự động hóa được toàn bộ quá trình

• Chi phí nhân công, điện nước cho một đơn vị sản phẩm cao

2.4.4 Phương pháp lên men bề mặt với môi trường bán rắn

Môi trường bán rắn thường dùng các nguyên liệu tự nhiên: cám mì, cám gạo, bột ngô, hạt kê, đậu tương… Trong đó, cám mì là cơ chất chủ yếu và được sử dụng phổ biến nhất và đồng thời tinh bột trong cám không được nhỏ hơn 20%, cám phải tương đối xốp, dễ thông khí, cám không có mùi hôi Ngoài ra có thể bổ sung thêm trấu, rơm băm vụn, lõi ngô, mùn cưa… để làm cho cám xốp Tuy nhiên vì các phụ liệu cho thêm vào thường nghèo chất dinh dưỡng trong môi trường người ta có thể bổ sung các nguồn nitơ, kali, phospho và các chất sinh trưởng

Để đảm bảo cho vi sinh mọc đều trên bề mặt môi trường và sử dụng được nhiều chất dinh dưỡng để sinh sản enzyme, lớp môi trường rắn cần phải mỏng, chiều dày chỉ vào khoảng 2 – 5 cm

2.5 Thu nhận enzyme

Để thu nhận enzyme từ môi trường nuôi cấy, ta có thể sử dụng nhiều cách khác nhau như dùng dung dịch muối loãng hay nước để tách enzyme Cho môi trường nuôi cấy vào nước tỉ lệ thích hợp và khuấy đều trong một thời gian ngắn nhất định Sau đó, loại bỏ cặn, lấy dung dịch trong chứa enzyme hòa tan bằng phương pháp lọc và ly tâm Dịch lọc này sẽ được kết tủa bằng cồn lạnh (40C) với tỉ lệ 1:4 Cho vào tủ lạnh 30 phút cho kết tủa hoàn toàn Đem ly tâm thu kết tủa là enzyme protease thô Được bảo quản trong tủ lạnh

2.6 Cá Ba Sa và phế liệu trong quá trình chế biến

2.6.1 Đặc điểm sinh học của cá Ba Sa [22]

2.6.1.1 Phân loại khoa học

Giới (regnum): Animalia

Ngành (phylum): Chordata

Lớp (class): Actinopterygii

Bộ (ordo): Siluriformes

Họ (familia): Pangasiidae

Chi (genus): Pangasius

Loài (species): P Bocourti

Hình 2.2: Cá Ba Sa Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của cá Ba Sa [21]

Thành phần dinh dưỡng của cá Ba Sa trong 100g chất khô

Calo Calo từ

chất béo

Tổng lượng chất béo (g)

Chất béo bão hòa (g)

Cholesterol (mg)

Natri (mg)

Protein (g)

2.6.1.2 Hình thái

Về ngoại hình, cá ba sa rất dễ phân biệt đối với các loài khác trong họ Cá tra Thân ngắn hình thoi, hơi dẹp bên, lườn tròn, bụng to tích lũy nhiều mỡ, chiều dài tiêu chuẩn bằng 2,5 lần chiều cao thân Đầu cá ba sa ngắn hơi tròn, dẹp đứng Miệng hẹp, chiều rộng của miệng ít hơn 10% chiều dài chuẩn, miệng nằm hơi lệch dưới mõm Dải răng hàm trên to rộng và có thể nhìn thấy được khi miệng khép lại, có 2 đôi râu, râu hàm trên bằng 1/2 chiều dài đầu; râu hàm dưới bằng 1/3 chiều dài đầu Răng trên xương khẩu cái là một đám có vết lõm sâu ở giữa và hai đám răng trên xương lá mía nằm hai bên Có 40 - 46 lược mang trên cung mang thứ nhất, vây hậu môn có 31-36 tia vây Răng vòm miệng với dải răng trên xương khẩu cái ở giữa và răng trên xương lá mía ở 2 bên Chiều cao của cuống đuôi hơn 7% chiều dài chuẩn Mặt lưng có màu nâu, mặt bụng có màu trắng

2.6.1.3 Phân bố

Cá ba sa phân bố rộng ở Myanma, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam Cá sống chủ yếu ở những sông rộng nước chảy mạnh Đây là đối tượng nuôi nước ngọt có sản lượng xuất khẩu lớn nhất hiện nay Nghề nuôi cá Ba Sa trong bè rất phát triển trên thế giới dưới mô hình nuôi mang tính công nghiệp với mật độ cao, năng suất trung bình 130-150 kg/m³/năm Cá sống đáy ăn tạp thiên về động vật

Cá giống thả nuôi trong bè cở 80-150 g/con, được nuôi với khẩu phần cho loài

ăn tạp (50% cám, 30% rau, 20% cá và bột cá) sau 10 - 11 tháng đạt trọng lượng

800-1500 g/con (Phillip) Cá tăng trưởng nhanh trong tự nhiên, một năm tuổi 0,7 kg, hai năm tuổi 1,2 kg Kích cỡ tối đa khoảng gần 1 m, trọng lượng 15 - 18 kg

2.6.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá có tính ăn tạp, thiên về ăn thức ăn động vật nhưng ít háo ăn và ít tránh mồi hơn cá Tra Sau khi hết noãn hoàng, cá ăn phù du động vật là chính, giai đoạn lớn cá cũng thích nghi với các loại thức ăn có nguồn gốc từ động vật, thực vật dễ kiếm: cá con, giun ốc, cám rau, phế phẩm nông nghiệp, phân động vật… do đó thuận lợi cho việc nuôi bè

2.6.1.5 Đặc điểm sinh trưởng

Thời kỳ cá giống, cá lớn rất nhanh sau 60 ngày đạt chiều dài 8 - 10,5 cm Sau

10 tháng cá đạt thể trọng 300 -550 g, sau 1 năm cá đạt từ 700 - 1300 g Nuôi bè sau 2 năm cá đạt tới 2500 g

2.6.1.6 Đặc điểm sinh sản

Cá Ba Sa thành thục ở độ tuổi 3-4 Trong tự nhiên vào mùa sinh sản cá Ba Sa bơi ngược dòng tìm chỗ thích hợp để đẻ trứng Ở giai đoạn thành thục có thể phân biệt giới tính cá bằng các vuốt tinh dịch cá đực và thăm trứng cá cái Sức sinh sản tuyệt đối đạt tới 6-7 chục ngàn trứng, đường kính trứng đạt tới 1,6-1,8 mm Trong nuôi vỗ sinh sản nhân tạo, mùa vụ thành thục và sinh sản cá Ba Sa sớm hơn 2-3 tháng Cá thành thục và bước vào mùa sinh sản nhân tạo từ tháng 3 và kéo dài đến tháng 7, chủ yếu tập trung vào tháng 4-5

2.6.2 Tình hình sản xuất cá Ba Sa ở Việt Nam

Đồng bằng Nam bộ đã có truyền thống nuôi cá Ba Sa, nuôi chủ yếu trong bè Hiện nay cá Ba Sa không chỉ ở Nam bộ mà còn một số nơi ở miền Trung và miền Bắc

cũng quan tâm đến đối tượng này Gần đây, việc nuôi các loài cá này bắt đầu nhằm phục vụ nhu cầu tiêu thụ nội địa và xuất khẩu Nuôi thương phẩm, thâm canh cho năng suất cao 100 – 300 kg/m3 bè

Việc nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá tra được bắt đầu từ năm 1978 và cá ba sa

từ năm 1990 Năm 1996, Trường Đaị học Cần Thơ, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Công ty Agifish An giang đã nghiên cứu đẻ nhân tạo cá Ba Sa thành công, chủ động giải quyết con giống cho nghề nuôi cá Ba Sa Ngành nuôi cá tra và Ba Sa phát triển rất nhanh trong những năm vừa qua do có thị trường xuất khẩu Vì điều kiện chế

độ nuôi dễ dàng, giá trị xuất khẩu cao, nên dù giá thấp hơn, cá tra vẫn chiếm tỷ trọng chủ yếu trong xuất khẩu cá da trơn ở Việt Nam (theo SASEP, khoảng 90%) Nếu năm

2004, tổng sản lượng cá tra, ba sa của các tỉnh ĐBSCL là 264,436 tấn, thì năm 2006 là 825.000 tấn và dự báo đến cuối năm 2007 sẽ lên đến khoảng một triệu tấn, bằng sản lượng quy hoạch cho đến năm 2010 theo dự đoán của ngành Thủy sản Như vậy, sẽ có khoảng 600.000 tấn phụ phẩm sau xuất khẩu cần được nghiên cứu ứng dụng để làm tăng hiệu quả sử dụng từ nguồn lợi thủy sản này

Tận dụng phế liệu:

Cá vụn người ta dùng làm nguyên liệu để sản xuất surimi, mỡ cá dùng làm nguyên liệu để sản xuất dầu sinh học Bio-diesel, DHA Máu và nội tạng cá thì theo thống kê thì hầu như chưa có cách xử lý

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Đối tượng nguyên cứu

Thời gian: 3/3/2010 đến 3/8/2010

Địa điểm: Viện Nghiên Cứu Sinh Học Nhiệt Đới

3.1.1 Vật liệu

Giống mốc Asp awamori do phòng Vi sinh ứng dụng Viện Nghiên Cứu Sinh

Học Nhiệt Đới cung cấp

Cám gạo: Nguồn cung cấp từ Viện Nghiên Cứu Sinh Học Nhiệt Đới

Trấu: Nguồn cung cấp là nhà máy xay lúa tỉnh Long An

Nội tạng cá Ba Sa là phế phẩm từ nhà máy chế biến ở thành phố Long Xuyên Tỉnh An Giang

(Bio-Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme: dung dịch tyrosine 1mg/ml, HCl 0,1M,

Na2CO3 0,4M, dung dịch trichloacetic 0,4M (TCA), Thuốc thử folin, dung dịch đệm phosphate 0,1M và casein dạng bột

Hóa chất trong quá trình tủa: ethanol 96%

Hóa chất dùng trong quá trình thủy phân nội tang cá Ba Sa: thuốc thử folin, formol…

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ: Ống nghiệm, becher, erlen, bình định mức, ống đong, pipette…

Thiết bị: Tủ sấy, bể ủ (bể ổn nhiệt), bếp điện, máy khuấy và máy khuấy từ, máy

đo quanh phổ UV-Vis, nồi hấp Tommy -SS-325; Nhật Bản, máy đo pH precisa; Thụy

Sĩ, cân phân tích Mettler Toledo; Thụy Sĩ, máy li tâm lạnh Jouan CR 412; Pháp, giấy lọc, giấy thấm, găng tay, pH kế, pipettetman 1000 µl

3.2 Phương pháp nguyên cứu thu nhận enzyme Protease

Tiến hành nuôi cấy nấm mốc theo quy trình sau

Hình 3.1 Sơ đồ nuôi cấy nấm mốc và thu nhận enzyme thô

Thu sinh khối

3.2.1 Thu nhận enzyme từ vi sinh vật bằng phương pháp lên men bề mặt sử dụng chất bán rắn

Nồi hấp Tommy -SS-325, tủ sấy, buồng sấy, cân phân tích M Toledo

3.2.1.4 Chuẩn bị môi trường

Môi trường giữ giống PGA: khoai tây 200 g, agar 20 g, glucose 20 g, nước cất

1000 ml Chia vào các ống nghiệm để làm thạch nghiêng, khử trùng ở 1 atm/20 phút Môi trường nuôi cấy nấm mốc Asp awamori

• Bã đậu nành: Cám gạo: bã mì: trấu = 50 g: 25 g: 25 g: 10 g

• Dung dịch dinh dưỡng bổ sung vào môi trường có thành phần như sau: (NH4)2SO4 1,4 %, CaCl2 0,3%, MgSO4.7H2O 0,3%, FeSO4.7H2O 1,2576 g/ml, MnSO4 0,415 g/ml, peptone

3.2.1.5 Nuôi cấy nấm mốc Asp Awamori

A Phương pháp cấy chuyền giữ giống

Môi trường nuôi cấy đổ vào 1/4 ống nghiệm, thanh trùng ở 1210C trong vòng

20 phút Lấy ra để nghiêng 300 cho tới khi thạch nguội Dùng que cấy đã thanh trùng trên ngọn lửa đèn cồn, lấy một ít bào tử từ ống giống rồi cấy lên ống thạch theo hình ziczac

B Nuôi cấy nấm mốc Asp awamori

Môi trường nuôi cấy gồm: cám gạo, bã mì, bã đậu nành, dung dịch dinh dưỡng

và nước

Dung dịch dinh dưỡng bổ sung vào môi trường có thành phần như sau: (NH4)2SO4 1,4 %, CaCl2 0,3%, MgSO4.7H2O 0,3%, FeSO4.7H2O 1,2576 g/ml, MnSO40,415 g/ml, peptone

Tiến hành cho 20 erlen 250ml

Cho 20 g môi trường nuôi cấy, tiếp tục cho 10ml dung dịch dinh dưỡng, trộn đều đem đi hấp ở 1210C trong 20 phút Để nguội bắt đầu cấy giống Sau 36 h nuôi cấy

ở nhiệt độ phòng, môi trường nuôi cấy sẽ mọc đầy tơ trắng

Ta thu chế phẩm và tách bằng nước ở tỉ lệ 1:3 Khuấy trong 30 phút nhằm phá

vỡ các bào tử Sau đó, lọc thô qua vải lọc, lặp lại quá trình này 3 lần Gom các dịch lọc đem ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, ta thu dịch chiết thô bỏ bã lọc

Cho từ từ lượng cồn 40C vào, khuấy tiếp 15 phút, để trong tủ lạnh trong 30-40 phút để quá trình kết tủa xảy ra Lấy dịch đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút Thu được enzyme thô cho vào lọ nhỏ, bảo quản ở nhiệt độ lạnh

Quá trình nuôi cấy và thu nhận enzyme thô:

3.2.3 Xác định protein bằng phương pháp Bradford

3.2.3.1 Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi của bước sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi coomasie brilliant blue liên kết với protein trong dung dịch axit

Trong dung dịch mang tính axit, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm

có bước sóng hấp thụ cực đại ở 465 nm Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm Độ hấp thụ ở bước sóng 595nm liên hệ trực tiếp với nồng độ protein

Dạng proton hóa của thuốc nhuộm coomasie brilliant blue có màu da cam đỏ Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện Màu xuất hiện trong 2 phút và ổn định trong gần một giờ

Nuôi ở tphòngtrong 24-26h

10ml dd dinh dưỡng

Enzyme thô

Hấp ở 1210C trong 20’

Cấy giống Để nguội 30’

3.2.3.2 Tiến hành thí nghiệm

a Hóa chất và thiết bị

Dung dịch albumine chuẩn 1 mg/ml: cân chính xác 100 mg albumine dạng bột trên cân phân tích, định mức đến 100 ml bằng nước cất

Dung dịch thuốc thử theo phương pháp Bradford

• Coomassie brilliant blue: 0,001g

• Ethanol tuyệt đối: 4,7g

• Axit phosphoric 85%: 8,5g

Phẩm màu coomassie brilliant blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng

có nắp, bổ sung axit phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất, lắc đều và giữ

Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu là 0 phút Thực hiện phản ứng ở các ống còn lại 2, 3, 4 các ống các nhau 1 phút

Tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm ở bước sóng 595 nm

Mẫu thí nghiệm được tiến hành tương tự như trên Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ được trong khoảng cách đường chuẩn

3.2.3.3 Tính kết quả

Trị số mật độ quang (OD) của những đối chứng (ống 2 đến ống 10) sau khi trừ

đi trị số mật độ quang của ống thử không (ống 1) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml) Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số của ống thử không, rồi chiếu vào đường cong để suy ra lượng protein có trong dịch mẫu thí nghiệm (μg/ml)

3.2.4 Xác định hoạt độ của enzyme protease

3.2.4.1 Nguyên tắc

Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử folin Dựa vào đồ thị chuẩn để định lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme Hoạt động của enzyme được biển diễn bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme

3.2.4.2 Tiến hành thí nghiệm

a Dụng cụ và hóa chất:

Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc

Bộ ổn nhiệt, máy quang phổ kế UV-Vis

Cân phân tích, máy khuấy từ, máy đo pH

b Hóa chất:

HCl 0,1 M, Na2CO3 0,4 M, dung dịch TCA 0,4M; tyrosine tinh khiết, thuốc thử folin, đệm phosphate pH = 7, nồng độ 0,1 M, dung dịch casein 1% (cân 1g casein thêm vào 100ml dung dịch đệm phosphate 0,1 M ở pH = 7)

c Dựng đường tyrosine chuẩn: thực hiện một loạt ống nghiệm theo bảng sau

Bảng 3.2: Xây dựng đường chuẩn tyrosine chuẩn

Ống số 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nồng độ (μg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

d Xác định hoạt tính của enzyme protease

Hoạt tính enzyme được khảo sát ở nhiệt độ 37±0,5oC và pH = 7

Cho 1ml dung dịch cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 37±0,50C trong

10-15 phút

Sau thời gian ủ, cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều Đem ủ hỗn hợp này 37±0,50C trong 1 giờ

Cho vào 2ml dung dịch TCA 0,4M để ngưng phản ứng enzyme

Để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại hết kết tủa

Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc

Thêm 1 ml thuốc thử folin

Lắc đều ống nghiệm, để yên ở 37±0,50C trong 20 phút

Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả Am)

Mẫu đối chứng: Lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện Ghi nhận kết quả độ hấp thụ là Ao

Hàm lượng tyrosine được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng cách lấy Am-A0 rồi lấy kết quả này so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt độ protease theo tính toán sau:

Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme

để tạo ra lượng amino axit tương đương với 100 μg tyrosine trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm

Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = 100

1 ) (A m−A0 FN

Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = 100

1 )

m

FnV A

A m −

90 80

70 60

50 40

30 20

10

90 80 70

60 50

40 30

n: Hệ số pha loãng của enzyme

1/100: Hệ số chuyển đổi

V: Thể tích của dung dịch enzyme

Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease

Từ kết quả hàm lượng protein (mg/ml) và hoạt tính riêng của enzyme protease (U/ml) tính được hoạt tính riêng của enzyme:

enzyme protein

mg

hoat tinh Don vi

(U/mg)

3.2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme

Enzyme protease của nấm mốc thường hoạt động trong môi trường trung tính

Do đó ở đây chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme protease ở các giá trị pH=6, 7, 8, 9, 10 trong cùng điều kiện nhiệt độ 37±0,5oC

Cho 1 ml enzyme protease (pha loãng 50 lần) và 1 ml casein 1% vào bể ủ nhiệt khoảng 20 phút Tiếp tục hòa chúng lại với nhau, cho thủy phân trong 60 phút Lấy dung dịch ra đem xác định hoạt tính enzyme (3.2.4) Ở giá trị nào cho hoạt tính của protease mạnh nhất (hoạt tính cao nhất) thì đó là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme

Hình 3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme 3.2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme

Thực hiện tương tự như trên, nhưng ta cho phản ứng xúc tác ở các nhiệt độ khác nhau là: 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC trong cùng một điều kiện về pH (pH tối ưu xác định được ở thí nghiệm trên)

Cho 1 ml enzyme protease (pha loãng 50 lần) và 1 ml casein 1% vào bể ủ nhiệt khoảng 20 phút Tiếp tục hòa chúng lại với nhau, cho thủy phân trong 60 phút Lấy

Dịch enzyme

Xác định hoạt độ

pH tối ưu