Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus awamori và ứng dụng trong quá trình thủy phân nội tạng cá basa dùng chế biến thức ăn gia súc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP.AWAMORI VÀ ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ BASA DÙNG CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC GVHD : CN ĐỖ THỊ TUYẾN SVTH: VŨ THỊ LÊ HOÀNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2006-2010 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2010 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, ngoài sự cố gắng của bản thân, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học Trường đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM đã hết lòng truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong quá trình em học tại trường. Xin cảm ơn các thầy cô Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã giúp đỡ em trong lúc làm đồ án tại Viện Em cũng xin cảm ơn những người bạn đã giúp em khi em cần trợ giúp. Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến: Thầy PGS Nguyễn Tiến Thắng đã truyền đạt cho em những kiến thức và sự hiểu biết đầu tiên về enzyme. Cử nhân Đỗ Thị Tuyến đã tận tâm giải thích và hướng dẫn cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Cuối cùng con Lời cảm ơn sâu sắc nhất xin được gửi đến ba, mẹ người đã nuôi dưỡng và dạy bảo con, cho con được đi học đến ngày nay. Ba mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất của con, là nguồn động viên, để con tiếp tục phấn đấu hơn nữa trong cuộc sống. Tp.HCM, tháng 7 năm 2010. SVTH: Vũ Thị Lê Hoàng MỤC LUC Trang Bìa Lời Cảm ơn Danh Mục Các Chữ Viết Tắt Danh Mục Các Hình Danh Mục Các Bảng Danh Mục Các Đồ Thị DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT U: Unit, đơn vị hoạt tính HT: Hoạt tính. h Giờ (thời gian) Asp: Aspergillus TCA: Tricloacetic acid SSF: Solid State Fermentation (lên men bán rắn). VSV: Vi Sinh Vật. Stt: Số thứ tự a w Chỉ số hoạt độ nước (activity water) Daltons Trọng lượng phân tử CP Chế phẩm enzyme DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Cá Basa 14 Hình 3.1 : Nấm mốc Asp.awamori 18 Hình 3.2 : Hệ thống sắc ký 28 Hình 3.3: Nội tạng cá trước khi sấy 35 Hình 4.1: Kết quả chạy điện di của mẫu protein 59 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1 : Chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá Basa 50 Bảng 4.2: Hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme thô của nấm mốc Asp.awamori 50 Bảng 4.3: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của pH 51 Bảng 4.4: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của nhiệt độ 52 Bảng 4.5: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của độ bền nhiệt 53 Bảng 4.7: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính sau khi tinh sạch 56 Bảng 4.6: Tổng hoạt tính và tỏng hàm lượng enzyme của hãng Amano 57 Bảng 4.8: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính của enzyme 57 Bảng 4.9: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein trong thang chuẩn 60 Bảng 4.10: Giá trị Rf từng vạch của của mỗi peak trong mẫu 61 Bảng 4.11: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Hãng Amano 61 Bảng 4.12: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Peak 2 61 Bảng 4.13: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Peak 3 62 Bảng 4.14: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở mẫu thô 62 Bảng 4.15: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 40 0 C 63 Bảng 4.16: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 40 0 C 65 Bảng 4.17: Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 40 0 C 66 Bảng 4.18 : Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở nhiệt độ 50 0 C Bảng 4.19: Hàm lượng đạm amin ở 50 0 C 70 Bảng 4.20: Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 50 0 C 72 Bảng 4.21 : Hàm lượng protein ở nhiệt độ 60 0 C 73 Bảng 4.22: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 60 0 C……………….75 Bảng 4.23: Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 60 0 C 76 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme 51 Đồ thị 4.2 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme 52 Đồ thị 4.3 : Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme 54 Đồ thị 4.4 : Sắc ký của hãng Amano 55 Đồ thị 4.5 : Đồ thị sắc ký lọc gel 56 Đồ thị 4.6 : Độ tinh sạch trước và sau sắc ký 58 Đồ thị 4.7: Sự tương quan giữa log của trọng lượng phân tử và giá trị Rf 60 Đồ thị 4.8: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 40 0 64 Đồ thị 4.9: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 40 0 C 65 Đồ thị 4.10: Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 40 0 C 67 Đồ thị 4.11: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 50 0 C 69 Đồ thị 4.12: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 50 0 C 71 Đồ thị 4.13: Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 50 0 C 72 Đồ thị 4.14: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 60 0 C 74 Đồ thị 4.15: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 60 0 C 75 Đồ thị 4.16: Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 60 0 C 77 MỤC LỤC CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về enzyme 3 2.1.1 Khái quát chung về enzyme 3 2.1.2 Lịch sử phát triển 4 2.1.3 Tính chất của enzyme 5 2.1.3.1 Bản chất sinh học 5 2.1.3.2 Bản chất hóa học 5 2.1.4 Nguồn thu nhận enzyme 5 2.1.4.1 Nguồn enzyme động vật 6 2.1.4.2 Nguồn enzyme thực vật 6 2.1.4.3 Nguồn enzyme vi sinh vật 6 2.2 Khái quát chung về enzyme protease 7 2.2.1 Định nghĩa 7 2.2.2 Phân loại protease 8 2.2.3 Ứng dụng của protease 9 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân của enzyme 11 2.2.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 11 2.2.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 12 2.2.4.3 Ảnh hưởng của chât kiềm hãm và chất hoạt hóa 12 2.2.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 12 2.2.4.5 Ảnh hưởng của pH môi trường 13 2.2.4.6 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân 13 2.2.4.7 Ảnh hưởng của lượng nước 14 2.3 Cá Basa và phế liệu trong quá trình chế biến 14 2.3.1 Đặc điểm sinh học của cá Basa 14 2.3.1.1 Phân loại khoa học 14 2.3.1.2 Hình thái 15 2.3.1.3 Phân bố 15 2.3.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng 15 2.3.1.5 Đặc điểm sinh trưởng 15 2.3.1.6 Đặc điểm sinh sản 16 2.3.1.7 Mỡ cá Basa 16 2.4 Tình hình sản xuất cá Basa ở Việt Nam 16 2.5 Phế liệu cá 17 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.1.1 Khái quát chung về nấm mốc Asp awamori 18 3.1.2 Phương pháp nuối cấy nấm mốc Asp awamori 18 3.1.2.1 Phương pháp giữ giống cấp 1 18 3.1.2.2 Làm môi trường thạch nghiêng 18 3.1.2.3 Cấy truyền giống 19 3.1.2.4 Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn 19 3.1.2.5 Nuôi nấm mốc trong bình tam giác 20 3.2 Phương pháp thu nhận enzyme protease 20 3.2.1 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Braford 20 3.2.1.1 Nguyên tắc 20 3.3.1.2 Tiến hành thí nghiệm 21 3.3.1.3 Tính kết quả 22 3.2.2 Phương pháp xác định enzyme protease 22 3.2.2.1 Nguyên tắc 22 3.2.2.2 Tiến hành thí nghiệm 22 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme 25 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme 26 3.2.5 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính của enzyme 27 3.2.6 Tinh sạch enzyme protease bằng sắc ký lọc gel 27 3.2.6.1 Bản chất phương pháp 28 3.2.6.2 Hóa chất và dụng cụ 29 3.2.6.3 Tiến hành chạy sắc ký 29 3.2.7 Phương pháp điện di 31 3.2.7.1 Thiết bị và dụng cụ 31 3.2.7.2 Hóa chất 32 3.2.7.3 Chuẩn bị mẫu và chạy điện di 34 3.2.7.4 Xác định trọng lượng phân tử rotein 35 3.3 Thủy phân nội tạng cá 35 3.3.1 Xác định độ ẩm 35 3.3.1.1 Nguyên tắc 35 3.3.1.2 Dụng cụ và vật liệu 35 3.3.1.3 Cách tiến hành 36 3.3.1.4 Tính kết quả 36 3.3.2 Xác định hàm lượng tro 36 3.3.2.1 Nguyên tắc 36 3.3.2.2 Dụng cụ và vật liệu 36 3.3.2.3 Tiến hành 37 3.3.2.4 Tính kết quả 37 3.3.3 Xác định hàm lượng Canxi 37 3.3.4 Xác định hàm lượng Photpho 39 3.3.5 Xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl 42 3.3.5.1 Nguyên tắc 42 3.3.5.2 Hóa chất và dụng cụ 43 3.3.5.3 Tiến hành 43 3.3.6 Xác định hàm lượng acid amin theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá mức độ thủy phân protein 44 3.3.6.1 Nguyên tắc 44 3.3.6.2 Hóa chất 45 3.3.6.3 Dụng cụ 45 3.3.6.4 Tiến hành 46 3.3.6.5 Tính kết quả 46 3.3.7 Xác định protein bằng phương pháp Biure 46 3.3.7.1 Nguyên tắc 46 3.3.7.2 Thực hành 46 3.3.7.3 Tính kết quả 47 3.3.8 Xác định lượng NH 3 bằng chưng cất hơi nước 47 3.3.8.1 Nguyên tắc 47 3.3.8.2 Dụng cụ và hóa chất 48 3.3.8.3 Tiến hành 48 3.3.8.4 Cách tính kết quả 48 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Kết quả các chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá basa chưa thủy phân (nguyên liệu ban đầu 50 4.2 Thu nhận enzyme trước tinh sạch 50 4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 50 4.3.1 Ảnh hưởng của pH 50 4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 52 4.3.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt 53 4.4 Kết quả tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel 55 4.4.1 Kết quả tinh sạch enzyme của hãng Amano 55 4.4.2 Kết quả tinh sạch enzyme của mẫu 56 4.5 Kết quả tinh sạch enzyme bằng phương pháp điện di 59 4.6 Kết quả thủy phân nội tạng cá 63 4.6.1 Thủy phân ở 40 0 C 63 4.6.1.1 Hàm lượng protein theo phương pháp Biure 63 4.6.1.2 Hàm lượng đạm amin 65 4.6.1.3 Hàm lượng NH 3 66 4.6.2 Thủy phân ở 50 0 C 68 4.6.2.1 Hàm lượng protein theo phương pháp Biure 68 4.6.2.2 Hàm lượng đạm amin 70 4.6.2.3 Hàm lượng NH 3 72 4.6.3 Thủy phân ở 60 0 C 73 4.6.3.1 Hàm lượng protein theo phương pháp Biure 73 4.6.3.2 Hàm lượng đạm amin 75 4.6.3.3 Hàm lượng NH 3 76 CHƯƠNG V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC [...]... hơn 10 2.2.4.6 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay ngắn phụ thu c vào nhiều yếu tố Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân Khi cơ chất cần thủy phân đã hết quá trình thủy phân kết thúc Thời gian thủy phân phải thích hợp để đảm bảo hiệu... nước Với phản ứng thủy phân bởi enzyme thì nước vừa là môi trường để phân tán enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng Nước ảnh hưởng đến tốc độ và chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme Vì thế, nước là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bằng enzyme, nó có thể tăng cường hoặc ức chế của các phản ứng do enzyme xúc tác 2.3 Cá Basa và phế liệu trong quá trình chế biến: 2.3.1 Đặc... thực phẩm cho gia súc là điều khả thi Nhiệm vụ: Thu nhận enzyme từ nấm mốc Asp Awamori Khảo sát các ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Thủy phân nội tạng cá Basa Mục đích: Tránh gây ô nhiễm môi trường Bổ sung lượng đạm vào thức ăn gia súc 2 CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương II: Tổng quan tài liệu 2.1 Sơ lược về enzyme 2.1.1 Khái quát chung về enzyme Enzyme theo tiếng Hi Lạp là chất trong nấm men, là một... 2.1.3 Tính chất của enzyme 2.1.3.1 Bản chất sinh học Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản ứng cả trong và ngoài tế bào Một gen  một enzyme  một phản ứng Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau từ sinh vật, các enzyme thu nhận từ nguồn sinh vật như rau quả thông dụng không có tính... lý: Do đó, tôi đã tiến hành dùng enzyme protease từ nấm mốc Asp awamori thủy phân lượng nội tạng cá để bước đầu tìm được phương pháp tận dụng làm thức ăn gia súc 17 CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chương III: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.1.1 Khái quát chung về nấm mốc Asp awamori: Giống mốc Asp awamori do phòng Vi sinh ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung... nghiên cứu và được đánh giá là mang lại hiệu quả cao trong việc thu nhận enzyme 2.2 Khái quát chung về enzyme protease 2.2.1 Định nghĩa: Protease là enzyme thu c nhóm enzyme protease (peptid-hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận... nhu cầu tiêu thụ nội địa và là nguyên liệu cho xuất khẩu Nuôi thương phẩm, thâm canh cho năng xuất cao từ 100-300 kg/m3 bè Việc nuôi vỗ thành thục cá bố mẹ và cho đẻ nhân tạo cá Basa thành công đã chủ động giải quyết con giống cho nghề nuôi cá Basa Từ khi chúng ta mở rộng thị trường xuất khẩu cá Tra và cá Basa thì nghề nuôi cá Tra và cá Basa bước sang một giai đoạn mới Cá Tra và cá Basa trở thành đối... rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như: + Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng + Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm + Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine,... thu phân Trong chế biến thu sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thu phân (độ đạm) lại phụ thu c rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và. .. đích thu nhận enzyme 2.1.4.2 Nguồn enzyme từ thực vật Trong các bộ phận của thực vật có chứa rất nhiều enzyme và có hoạt tính rất cao Phần lớn gồm các loại sau: + Enzyme amylase: Từ đại mạch nảy mầm (malt) + Enzyme papain: Từ quả đu đủ + Enzyme bromelin: Từ cây dứa + Enzyme ficin: Từ quả sung Nhược điểm: Tuy các loài thực vật cho enzyme có hoạt tính cao nhưng cũng gặp rất nhiều khó khăn do lệ thu c vào . Thu nhận enzyme từ nấm mốc Asp. Awamori Khảo sát các ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Thủy phân nội tạng cá Basa Mục đích: Tránh gây ô nhiễm môi trường Bổ sung lượng đạm vào thức ăn gia. THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASP .AWAMORI VÀ ỨNG DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ BASA DÙNG CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC GVHD : CN ĐỖ THỊ TUYẾN SVTH: VŨ THỊ LÊ HOÀNG. gen. Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản ứng cả trong và ngoài tế bào. Một gen  một enzyme  một phản ứng Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn