Sơ lược về enzyme
Khái quát chung về enzyme
Enzyme theo tiếng Hi Lạp là chất trong nấm men, là một chất xúc tác sinh học chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật
Enzyme là yếu tố thiết yếu trong việc xúc tác các phản ứng sinh hóa của tế bào trong điều kiện đẳng nhiệt và đẳng áp Sự sống có thể được hiểu là sự điều phối của các phản ứng enzyme Những enzyme này không chỉ hoạt động bên trong tế bào mà còn tham gia vào các phản ứng bên ngoài, từ đó con người đã ứng dụng enzyme vào nhiều lĩnh vực trong cuộc sống.
Mỗi enzyme có tính đặc hiệu riêng biệt với một phản ứng nhất định
Dưới tác động của enzyme, các phản ứng sinh hóa diễn ra với hiệu suất cao, cho phép nhiều phản ứng xảy ra đồng thời theo chuỗi mà tiêu tốn ít năng lượng.
Enzyme là protein có tính đặc hiệu cao và có hiệu quả hơn gấp nhiều lần so với các chất xúc tác vô cơ
Enzyme là những chất khó có thể được tổng hợp bằng phương pháp hóa học, do đó chúng thường được chiết xuất từ các nguồn vi sinh vật, thực vật và động vật, đảm bảo an toàn khi sử dụng.
Enzyme có thể được chiết xuất từ nhiều nguồn khác nhau, nhưng enzyme vi sinh vật là lựa chọn tối ưu cho sản xuất công nghiệp Các enzyme này không chỉ có hoạt tính cao mà còn đa dạng và dễ dàng thu nhận Đặc biệt, nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme từ vi sinh vật rất phong phú, dễ kiếm và chi phí thấp.
Hiện nay, đã có hơn 2000 loại enzyme được khám phá, trong đó hơn 200 enzyme đã được tinh chế dưới dạng tinh thể Enzyme ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm y dược, chăn nuôi, thú y và các ngành công nghiệp đặc biệt như chế biến thực phẩm, chẳng hạn như sản xuất bia, rượu, nước chấm và bánh mì.
Lịch sử phát triển
stt năm Nội dung nghiên cứu, phát triển
Payen và peoz tách được diatase từ malt
Hansen là người đầu tiên tách được gen từ bào tử cừu
Kiihne đầu tiên gọi chất xúc tác sinh học là enzyme
Hai anh em Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men có thể chuyển hóa đường glucose thành cồn và CO 2
Rohm sử dụng protease vào công nghiệp thuộc da và tẩy rửa
Samner kết tinh được uerase và Northrop kết tinh được protease Fleming phát hiện ra penicilline
Bắt đầu sản xuất kháng sinh theo quy mô công nghiệp Sử dụng glucoamylase thủy phân tinh bột
Boyeretal đưa ra kỹ thuật di truyền và được ứng dụng vào công nghệ enzyme sau này
Nito xác lập quy trình cơ bản tạo acrylamide và một loạt các quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme
Giai đoạn sản xuất hàng trăm loại enzyme khác nhau đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người Việc ứng dụng enzyme ngày càng phổ biến, và sự ra đời của kỹ thuật enzyme cố định đã nâng cao công nghệ enzyme lên một tầm cao mới.
Bảng 2.1: Lịch sử phát triển
Tính chất của enzyme
Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen
Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản ứng cả trong và ngoài tế bào
Mỗi gen mã hóa cho một enzyme, và mỗi enzyme xúc tác cho một phản ứng hóa học cụ thể Enzyme có thể được chiết xuất dễ dàng từ nhiều nguồn nguyên liệu sinh vật khác nhau, bao gồm các loại rau quả thông dụng, mà không gây độc hại Hầu hết các enzyme hoạt động hiệu quả trong điều kiện nhiệt độ khoảng 20 độ C.
45 0 C, 1atm, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính
Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một cơ chất cụ thể, giúp tăng tốc độ phản ứng lên nhiều lần so với các chất xúc tác sinh học khác Do đó, enzyme chỉ cần sử dụng với một lượng rất nhỏ để đạt hiệu quả tối ưu.
Có thể điều chỉnh hay ngừng phản ứng bằng nhiệt độ, pH, thời gian xúc tác…
+ Nhóm enzyme đơn cấu tử: Enzyme chỉ được cấu tạo bởi một thành phần duy nhất là protein
+ Nhóm enzyme đa cấu tử: Là những loại enzyme mà được cấu tạo bởi hai thành phần gồm:
Một thành phần là protein
Thành phần không phải protein Thành phần này là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác
Nguồn thu nhận enzyme
Hiện nay người ta có nhiều cách thu nhận enzyme từ các nguồn sau:
2.1.4.1 Nguồn enzyme từ động vật
Enzyme có thể được chiết xuất từ các tuyến dịch và các bộ phận khác trong hệ tiêu hóa, bao gồm tuyến tụy, dạ dày, màng nhầy và tim, với trọng tâm chính là enzyme protease.
Enzyme từ nguồn động vật có ưu điểm nổi bật với hoạt tính cao và ổn định Tuy nhiên, việc thu nhận enzyme này gặp nhiều khó khăn, dẫn đến hiệu quả thu nhận và hiệu quả kinh tế chưa đạt mức cao.
Có nhiều rủi ro và không ổn định về nguồn nguyên liệu
Chưa có nghiên cứu nào nhằm tạo ra giống động vật với mục đích thu nhận enzyme
2.1.4.2 Nguồn enzyme từ thực vật
Trong các bộ phận của thực vật có chứa rất nhiều enzyme và có hoạt tính rất cao Phần lớn gồm các loại sau:
+ Enzyme amylase: Từ đại mạch nảy mầm (malt)
+ Enzyme papain: Từ quả đu đủ
+ Enzyme bromelin: Từ cây dứa
+ Enzyme ficin: Từ quả sung
Mặc dù các loài thực vật cung cấp enzyme có hoạt tính cao, nhưng chúng gặp nhiều khó khăn do phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên và thời gian thu hoạch kéo dài, điều này khiến việc đáp ứng nhu cầu sử dụng trở nên khó khăn.
2.1.4.3 Nguồn enzyme từ vi sinh vật Đây là nguồn enzyme duy nhất được sử dụng để sản xuất enzyme trên quy mô công nghiệp, nó được quan tâm nhiều để phát triển về khối lượng và số lượng enzyme
Vi sinh vật, với đặc điểm là động vật đơn bào, mang lại nhiều ưu điểm vượt trội so với nguồn động thực vật, bao gồm thời gian thu nhận enzyme ngắn hơn và khả năng sản xuất một lượng lớn enzyme.
Hoạt tính của enzyme từ nguồn vi sinh vật cao hơn các nguồn động vật, thực vật
Vi sinh vật có tốc độ sinh sản nhanh trong thời gian ngắn, cho phép thu được lượng sinh khối lớn sau nuôi cấy Điều này tạo điều kiện thuận lợi để chiết xuất một lượng lớn enzyme Một trong những ưu điểm nổi bật của vi sinh vật là kích thước nhỏ, giúp dễ dàng đưa vào các thiết bị lên men Nhờ đó, việc điều khiển và kiểm soát các điều kiện như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, ánh sáng và lưu thông khí trở nên đơn giản, từ đó có thể quản lý hiệu quả tốc độ tổng hợp enzyme.
Nguyên liệu để nuôi vi sinh vật sản xuất enzyme thường là các phế liệu từ các ngành công nghiệp, mang lại lợi ích kinh tế nhờ tính chất rẻ tiền và dễ kiếm.
Có nhiều phương pháp nuôi cấy và thu nhận enzyme từ vi sinh vật, bao gồm nuôi cấy trong môi trường lỏng, môi trường bán rắn và môi trường rắn, tùy thuộc vào các điều kiện cụ thể.
Hiện nay, nghiên cứu về nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường bán rắn đang được chú trọng, vì phương pháp này cho thấy hiệu quả cao trong việc thu nhận enzyme.
Khái quát chung về enzyme protease
Định nghĩa
Protease là một loại enzyme thuộc nhóm peptid-hidrolase (3.4), có chức năng xúc tác quá trình thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-) trong protein và polypeptide, tạo ra các acid amin Ngoài ra, một số protease còn có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin.
Protease là enzyme thiết yếu cho sự sống, với chức năng đa dạng từ tế bào đến cơ thể, được phân bố rộng rãi trong nhiều đối tượng sinh vật như vi sinh vật, thực vật và động vật So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt, tạo thành một hệ thống protease độc đáo.
8 phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất
Protease vi sinh vật là một phức hệ enzyme đa dạng, có khả năng thủy phân rộng rãi các loại sản phẩm khác nhau Tính đặc hiệu của protease vi sinh vật giúp chúng thực hiện quá trình phân hủy hiệu quả, tạo ra nhiều sản phẩm phong phú và đa dạng.
Phân loại protease
Protease, hay peptidase, là một enzyme thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 Enzyme này được chia thành hai loại chính: endopeptidase và exopeptidase Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase lại được phân chia thành hai loại khác nhau.
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide
+ Carboxypeptidase: xúc tác liên kết thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide
*Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:
Serin proteinase là các enzyme chứa nhóm –OH- của gốc serin trong trung tâm hoạt động, đóng vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác Chúng được chia thành hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin và elastase, trong khi nhóm subtilisin chứa các enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm và có tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
Cysteine proteinase là loại enzyme chứa nhóm –SH- trong trung tâm hoạt động, bao gồm các proteinase thực vật như papain và bromelin, cũng như một số protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein này đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học.
9 proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng
Aspastic proteinase chủ yếu thuộc nhóm pepsin, bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin và renin Những enzyme này có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động hiệu quả ở pH trung tính.
Metallo proteinase là một loại enzyme proteinase được phát hiện ở vi khuẩn, nấm mốc và các vi sinh vật bậc cao Chúng thường hoạt động hiệu quả trong môi trường có pH trung tính, tuy nhiên, hoạt tính của chúng giảm đáng kể khi tiếp xúc với EDTA.
Ngoài ra protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: Protease acid: pH 2-4
Protease trung tính: pH 7-8 Protease kiềm: pH 9-11
Ứng dụng của protease
Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp…
Trong ngành chế biến thịt, protease đóng vai trò quan trọng trong việc làm mềm thịt thông qua quá trình thủy phân một phần protein, giúp thịt trở nên mềm mại và có hương vị tốt hơn Các phương pháp sử dụng protease bao gồm ngâm thịt trong dung dịch protease với pH và nhiệt độ xác định, tẩm hỗn hợp enzyme, muối và bột ngọt, cũng như tiêm dung dịch enzyme vào thịt trước khi giết mổ, mang lại hiệu quả tối ưu trong việc cải thiện chất lượng thịt.
Using protease for protein production involves isolating keratinase from Streptomyces fradiae, which effectively hydrolyzes keratin from valuable sources such as feathers and skin Unlike acid hydrolysis, which completely destroys amino acids, this enzymatic method preserves their integrity, making it a superior choice for producing protein-rich solutions.
10 chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng
Để thuỷ phân triệt để protein trong chế tạo dịch truyền đạm y tế, cần sử dụng các protease có tính đặc hiệu cao từ ba nguồn: vi khuẩn, nấm mốc và thực vật, với tỷ lệ 1-2% khối lượng protein Phương pháp này giúp bảo toàn vitamin trong nguyên liệu, không tạo ra sản phẩm phụ và giữ màu sắc sáng cho dịch thuỷ phân.
Trong chế biến thủy sản, sản xuất nước mắm thường có thời gian chế biến dài nhất, và hiệu suất thủy phân phụ thuộc vào nhiều yếu tố như địa phương, phương pháp gài nén và nguyên liệu cá Hiện nay, quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được cải tiến bằng cách sử dụng chế phẩm enzyme thực vật như bromelain và papain, cùng với vi sinh vật, nhằm rút ngắn thời gian chế biến và nâng cao hương vị của nước mắm.
Mặc dù công nghệ trong ngành công nghiệp thực phẩm đã phát triển, vẫn còn một số vấn đề cần cải thiện Trong sản xuất phomat, protease từ các vi sinh vật như A candidus, P roquerti và B mesentericus được sử dụng để làm đông tụ sữa Bên cạnh đó, trong ngành sản xuất bánh mì và bánh quy, protease giúp giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, đồng thời cải thiện độ xốp và khả năng nở của sản phẩm.
Trong sản xuất bia, chế phẩm protease đóng vai trò quan trọng trong việc tăng độ bền và rút ngắn thời gian lọc của bia, với protease từ A oryzae được sử dụng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, giúp cải thiện quy trình xử lý bia Trong ngành công nghiệp da, protease cũng được ứng dụng để làm mềm da bằng cách thủy phân một phần protein, chủ yếu là collagen, giúp loại bỏ các chất nhớt và mang lại độ mềm dẻo cho da, tính chất này được cải thiện thêm sau quá trình thuộc da.
Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân của enzyme
làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật
Hiện nay, việc ứng dụng protease tách từ vi khuẩn như B mesentericus và B subtilis, nấm mốc như A oryzae và A flavus, cùng với xạ khuẩn như S fradiae, S griseus và S rimosus trong ngành công nghiệp thuộc da đã mang lại nhiều kết quả tích cực và ngày càng khẳng định vai trò quan trọng của chúng.
Trong ngành dệt, enzyme proteinase từ vi sinh vật được ứng dụng để làm sạch tơ tằm và tẩy tơ nhân tạo, giúp sợi trở nên bóng mượt và dễ nhuộm Chúng có khả năng thủy phân lớp protein sericin, lớp protein này làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, từ đó tách rời và giảm thiểu lượng hóa chất cần thiết cho quá trình tẩy trắng.
Protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành, bao gồm việc điều chế dịch đạm thủy phân, sử dụng làm chất dinh dưỡng và chất tăng vị trong thực phẩm, cũng như trong sản xuất một số loại thức ăn kiêng.
Protease từ nấm mốc và vi khuẩn kết hợp với amylase tạo ra một hỗn hợp enzyme có độ tiêu hóa cao, mang lại ý nghĩa quan trọng trong việc chăn nuôi gia súc và gia cầm Sản phẩm này không chỉ cải thiện hiệu quả tiêu hóa mà còn nâng cao chất lượng thức ăn cho động vật.
+ Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh
+ Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm,…
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng enzyme 2.2.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm
2.2.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Khi nồng độ cơ chất ở mức thấp, tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất Tuy nhiên, khi nồng độ cơ chất được tăng lên đến một mức nhất định, việc gia tăng thêm nồng độ sẽ không còn làm tăng tốc độ phản ứng.
Nồng độ tới hạn của cơ chất và enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng, và mỗi enzyme có nồng độ tới hạn riêng cho từng cơ chất.
Để thủy phân một cơ chất cụ thể bằng enzyme, cần nghiên cứu và xác định nồng độ tới hạn của enzyme trong những điều kiện cụ thể.
2.2.4.3 Ảnh hưởng của chất kiềm hãm và chất hoạt hóa
Hoạt động của enzyme có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều chất vô cơ và hữu cơ, với khả năng làm tăng (chất hoạt hóa) hoặc giảm (chất ức chế) hoạt độ của enzyme Tác động của các chất này có thể mang tính đặc hiệu hoặc không đặc hiệu, và sự thay đổi này phụ thuộc vào từng loại enzyme cụ thể.
Chất kìm hãm (chất ức chế) là những hợp chất làm giảm hoạt tính của enzyme trong phản ứng mà không bị chuyển hóa bởi enzyme Chúng có thể là ion, phân tử vô cơ hoặc hữu cơ, bao gồm cả protein Ngược lại, chất hoạt hóa là những chất tăng cường hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc chuyển enzyme từ dạng không hoạt động sang dạng hoạt động Các chất này có bản chất hóa học đa dạng, bao gồm anion, ion kim loại và các hợp chất hữu cơ, giúp tăng cường hoặc phục hồi hoạt tính enzyme một cách trực tiếp hoặc gián tiếp.
2.2.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme, nhưng tốc độ phản ứng enzyme không luôn tỉ lệ thuận với nhiệt độ Tốc độ phản ứng chỉ tăng lên đến một mức nhiệt độ nhất định; khi vượt qua mức này, tốc độ sẽ giảm và enzyme có thể bị triệt tiêu.
Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không còn khả năng phục hồi lại hoạt tính
Ở nhiệt độ 0°C, enzyme hoạt động rất hạn chế, nhưng khi nhiệt độ tăng dần, hoạt tính enzyme cũng tăng lên đến mức tối ưu Trong khoảng nhiệt độ thấp từ 0-50°C, vận tốc phản ứng tăng theo nhiệt độ do năng lượng cung cấp cho phản ứng Tuy nhiên, khi nhiệt độ vượt quá khoảng 55°C, vận tốc phản ứng bắt đầu giảm do sự biến tính của protein Hầu hết các enzyme sẽ mất hoạt tính hoàn toàn ở nhiệt độ từ 80-100°C.
Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trường
2.2.4.5 Ảnh hưởng của pH môi trường pH của môi trường ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein- enzyme Đa số enzyme bền trong khoảng pH 5-9, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có các yếu tố bền như: cơ chất, coenzyme, Ca 2+ mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ…
Nhiều enzyme protease hoạt động hiệu quả nhất trong môi trường pH trung tính, tuy nhiên, cũng có một số enzyme như pepsin và protease acid từ vi sinh vật có pH tối ưu rất thấp Ngược lại, subtilin là một enzyme protease có pH thích hợp lớn hơn 10.
2.2.4.6 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố
Thời gian thủy phân cần được kéo dài đủ để enzyme có thể cắt đứt các liên kết trong cơ chất, tạo ra các sản phẩm cần thiết cho quá trình này Khi cơ chất đã được thủy phân hoàn toàn, quá trình sẽ kết thúc Để đạt hiệu suất cao và đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt, thời gian thủy phân phải được xác định một cách hợp lý.
2.2.4.7 Ảnh hưởng của lượng nước
Nước đóng vai trò quan trọng trong phản ứng thủy phân bởi enzyme, không chỉ là môi trường phân tán enzyme và cơ chất mà còn trực tiếp tham gia vào phản ứng Nó ảnh hưởng đến tốc độ và chiều hướng của quá trình này, do đó, nước là yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân, có khả năng tăng cường hoặc ức chế các phản ứng do enzyme xúc tác.
Cá Basa và phế liệu trong quá trình chế biến
Đặc điểm sinh học của cá Basa
Giới: Animalia Ngành:Chordata Lớp: Actinopterygii
Họ : Pangasiidae Chi : Pangasius Loài : Pangasius bocourti
Thành phần dinh dưỡng của cá basa
Thành phần sản phẩm trên 100g sản phẩm ăn được
Chất béo bão hòa 2mg
Bảng 3.1: Thành phần cá Basa
Cá da trơn có đặc điểm nhận diện như đầu dẹp bằng, trán rộng và răng nhỏ mịn Râu mép dài đến hoặc vượt quá gốc vây ngực, cùng với đôi mắt to và bụng lớn Lá mỡ của cá lớn, phần sau thân dẹp bên lưng Màu sắc của cá da trơn gồm màu xanh xám ở đầu và màu trắng bạc ở bụng.
Cá sống ở nước ngọt và phân bố ở Thái Lan, Miến Điện, Indonesia, Campuchia và đồng bằng song Cửu Long (Việt Nam)
Cá có tính ăn tạp, chủ yếu tiêu thụ thức ăn động vật nhưng lại không quá háo ăn Sau khi hoàn thành giai đoạn phát triển noãn hoàn, cá chủ yếu ăn phù du động vật Khi lớn lên, chúng thích nghi với nhiều loại thức ăn khác nhau, bao gồm cá con, giun ốc, côn trùng, cám rau, phế phụ phẩm nông nghiệp và phân động vật Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc nuôi cá trong môi trường bè.
Trong thời kỳ nuôi cá giống, cá phát triển nhanh chóng, đạt chiều dài từ 8-10,5 cm chỉ sau 60 ngày Sau 6 tháng, trọng lượng cá có thể đạt từ 300-550g, và sau 1 năm, cá có thể nặng từ 700-1300g Đặc biệt, khi nuôi trong bè, sau 2 năm, cá có thể đạt trọng lượng lên tới 2500g.
Cá Basa đạt độ thành thục ở tuổi 3-4 và vào mùa sinh sản, chúng bơi ngược dòng để tìm nơi đẻ trứng Giới tính cá có thể phân biệt bằng cách vuốt tinh dịch cá đực và thăm trứng cá cái Sức sinh sản của cá Basa có thể lên tới 60-70 nghìn trứng, với đường kính trứng từ 1,6-1,8mm Trong nuôi vỗ sinh sản nhân tạo, cá Basa bắt đầu mùa sinh sản sớm hơn từ 2-3 tháng, thường từ tháng 3 đến tháng 7, với thời điểm cao điểm vào tháng 4-5.
2.3.1.7 Mỡ cá basa: Ở bụng cá có buồng mỡ chiếm 25% trọng lượng cơ thể cá Trong mỡ cá có khoảng 50 acid béo gần giống như dầu thực vật, 75% là acid béo không no Ngoài ra trong mỡ cá còn có vitamin A Có thể dùng mỡ cá thay thế dầu ăn hằng ngày.
Tình hình sản xuất cá Basa ở Việt Nam
Đồng bằng Nam Bộ nổi tiếng với truyền thống nuôi cá Tra và cá Basa, chủ yếu thực hiện trong các bè Gần đây, việc nuôi cá Tra và cá Basa đã mở rộng ra cả miền Trung và miền Bắc, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ nội địa và xuất khẩu Sự phát triển mạnh mẽ của ngành nuôi cá này cho thấy tiềm năng lớn, với năng suất thương phẩm đạt từ 100-300 kg/m³ bè.
Việc nuôi cá bố mẹ và thực hiện đẻ nhân tạo cá Basa đã giúp chủ động nguồn giống cho nghề nuôi cá này Sự mở rộng thị trường xuất khẩu cá Tra và cá Basa đánh dấu một giai đoạn mới, khi hai loại cá này trở thành đối tượng xuất khẩu với nhiều sản phẩm chế biến phong phú, được xuất sang hàng chục quốc gia và vùng lãnh thổ Tuy nhiên, nhu cầu thực phẩm trong nước vẫn là một thị trường tiềm năng lớn chưa được khai thác đúng mức.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
3.1.1 Khái quát chung về nấm mốc Asp awamori :
Giống mốc Asp awamori do phòng Vi sinh ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp
Giới (regnum): Funlum Ngành (phylum): Ascomycota Lớp (class): Ascomycetes
Họ (familia): Trichocomaceae Chi (genus): Aspergillus Loài (species):Aspergillus Awamori
Hình 3.1 : Nấm mốc Asp.awamori 3.1.2 Phương pháp nuối cấy nấm mốc Asp awamori
3.1.2.1 Phương pháp giữ giống cấp 1
Phương pháp giữ giống cấp 1 hay còn gọi là phương pháp cấy giống trên môi trường thạch nghiêng, gồm các bước sau:
3.1.2.2 Làm môi trường thạch nghiêng
Môi trường thạch nghiêng là một loại môi trường nuôi cấy chứa pepton cao Sau khi nấu sôi, môi trường không nên được hấp khử trùng ngay lập tức, mà cần được rót vào các ống nghiệm, sao cho chiếm khoảng 1/4 đến 1/3 thể tích ống nghiệm.
Bịt đầu ống nghiệm bằng bông không thấm và bọc kín đầu bông bằng giấy gói Mang đi hấp khử trùng ở 121 0 C, 1atm, 30 phút
Môi trường sau khi hấp được để nghiêng sao cho môi trường không đụng các nút bông, đợi môi trường đông rồi mang đi cấy giống
Mang tất cả các vật dụng cần thiết cho việc cấy truyền vào tủ cấy
Vệ sinh 2 lần tủ cấy, dụng cụ và ống thạch nghiêng bằng cồn 75 0 Thắp đèn UV 30 phút, sau khi tắt đèn 10 phút mới bắt đầu vào cấy truyền
Trước tiên vệ sinh tay và phía trước tủ cấy bằng cồn 75 0 Cho các đĩa pertri có chứa giống đã phân lập vào tủ cấy
Mở ống thạch nghiêng và hơ lên ngọn lửa đèn cồn, đồng thời hơ xung quang đĩa pertri trên ngọn đèn cồn
Dùng que cấy chọn lấy những khuẩn lạc mọc tốt nhất và đặt nhẹ nhàng lên mặt thạch nghiêng theo hình rích rắc
Hơ miệng ống thạch vừa cấy lên ngọn đèn cồn, nút lại, gói kín và mang đi cất nơi ít ánh sáng, để ở nhiệt độ phòng
Tiếp tục thực hiện cấy các ống thạch nghiêng, đảm bảo mỗi ống lấy giống từ một đĩa giống khác nhau Trong quá trình cấy, cần giữ khoảng cách an toàn với ngọn lửa đèn cồn để đảm bảo an toàn và hiệu quả.
3.1.2.4 Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn
Thành phần môi trường nuôi cấy
Thành phần Tỷ lệ cơ chất
Bảng 3.1: Thành phần môi trường nuôi cấy
Môi trường bán rắn được thực hiện dựa trên tỷ lệ cơ chất cùng với sự bổ sung độ ẩm bằng môi trường khoáng Czapeak để đạt độ ẩm 60%
K 2 HPO 4 1g Đong lên thành 1000ml
Bổ sung vào cơ chất đã pha sẵn trong bình tam giác
3.1.2.5 Nuôi nấm mốc trong bình tam giác
Cho vào mỗi bình 20g hỗn hợp cơ chất cùng 10ml dung dịch khoáng Czapeak mang đi hấp khử trùng
Sau khi hấp xong, để nguội và cấy vào bình tam giác Tiếp theo, cho vào bình lúa đã cấy sẵn nấm mốc cùng với nước muối sinh lý, rồi trộn đều Sử dụng pipet hút 2ml hỗn hợp và cho vào bình tam giác chứa cơ chất Cuối cùng, ủ trong tủ ủ khoảng 24-26 giờ.
Phương pháp thu nhận enzyme protease
3.2.1 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Braford
Nguyên tắc này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và màu sắc khi Commasie brilliant blue liên kết với protein trong dung dịch Trong môi trường acid, thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại ở 465nm khi không kết nối với protein Tuy nhiên, khi kết hợp với protein, bước sóng hấp thu cực đại chuyển sang 595nm, cho thấy độ hấp thu ở bước sóng này liên quan trực tiếp đến nồng độ protein.
Thuốc nhuộm Commasie brilliant blue ở dạng proton hóa có màu da cam đỏ và liên kết chặt chẽ với các protein Nó tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein, tạo ra sự gắn kết mạnh mẽ trong môi trường.
Trong 21 trường hợp của các gốc mang điện tích dương, hiện tượng proton hóa không xảy ra, dẫn đến sự xuất hiện của màu xanh Màu sắc này sẽ xuất hiện trong vòng 2 phút và duy trì ổn định trong 1 giờ.
A/ Hóa chất và thiết bị:
Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml: cân chính xác 100mg albumine dạng bột trên cân phân tích, định mức đến 100ml bằng nước cất
Dung dịch thuốc thử theo phương pháp Bradford
Để chuẩn bị dung dịch phẩm màu Commasie brilliant blue, cần hòa tan 4,7g ethano tuyệt đối trong một chai có nắp Tiếp theo, bổ sung 8,5g acid phosphoric 85% và điều chỉnh thể tích lên 100ml bằng nước cất Sau đó, lắc đều và bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 4°C.
Thiết bị máy quang phổ
B/ Lập đồ thị chuẩn: Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Bảng 3.2: Lập đường chuẩn protein
22 Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút Thực hiện phản ứng ở các ống còn lại 2,3,4 các ống cách nhau 1 phút
Tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm trong các ống nghiệm ở bước sóng 595nm
Mẫu thí nghiệm được tiến hành tương tự mẫu trên Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng cách đường chuẩn
Trị số mật độ quang (OD) của các ống đối chứng (từ ống 2 đến ống 10) sau khi trừ đi trị số của ống thử không (ống 1) sẽ được sử dụng để xây dựng đồ thị thể hiện sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml) Tương tự, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng cần trừ đi trị số của ống thử không, sau đó so sánh với đường cong để xác định lượng protein có trong dịch mẫu.
3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease
Sử dụng casein làm cơ chất, nghiên cứu xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease thông qua việc định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Từ đồ thị chuẩn, ta có thể tính lượng tyrosine tương ứng với sản phẩm thủy phân do enzyme tạo ra Hoạt động của enzyme được thể hiện bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme.
A/ Dụng cụ và hóa chất: Ống nghiệm, pipet, bình định mức, giấy lọc…
Bể ổn nhiệt, máy đo quang phổ, cân phân tích,máy khuấy từ, máy đo pH
Dung dịch TCA 0,4 M Tyrosine tinh khiết Thuốc thử folin Đệm Photphat pH=7, 0,1M Dung dịch casein 1%: Cân 1g casein thêm vào 100ml dung dịch đệm Photphat 0,1M ở pH=7
Thực hiện 1 loạt phản ứng theo bảng sau: Ống số 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Bảng 3.3: Lập đường chuẩn tyrosine
Pha dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,
Chuẩn bị dung dịch tyrosine với nồng độ 80 và 90 µg/ml HCl theo bảng hướng dẫn Lấy 5ml dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau, thêm 1ml thuốc thử Folin vào hỗn hợp và lắc đều Để ổn định dung dịch ở nhiệt độ 37 ± 0,5 °C trong 20 phút Tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch tại bước sóng 660nm và ghi nhận kết quả Đối với ống đối chứng, sử dụng 1ml acid HCl 0,1 M thay cho tyrosine và đo độ hấp thu ở cùng bước sóng 660nm, sau đó ghi nhận kết quả.
Trị số mật độ quang của các ống từ ống 1 đến ống 9, sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng, sẽ cho ra giá trị OD từ OD 1 đến OD 9 Dựa trên bảng biến, tiến hành vẽ đồ thị để thể hiện kết quả.
24 thiên của OD theo nồng độ protein Đồ thị này còn gọi là dường chuẩn tyrosine
D/ Xác định hoạt tính enzyme protease:
Hoạt tính enzyme dược khảo sát ở nhiệt độ 37± 0,5 0 C và pH=7 Cho 1ml dung dịch cơ chât casein 1% vào ống nghiệm ủ ở 37± 0,5 0 C trong 10-15 phút
Sau thời gian ủ, cho 1ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều đem ủ hỗn hợp này ở 37 ± 0,5 0 C trong 1 giờ
Để ngừng phản ứng enzyme, cho vào 2ml dung dịch TCA 0,4M và ổn định dung dịch trong 25 phút Tiếp theo, lọc dung dịch qua giấy lọc để loại bỏ hoàn toàn tủa.
Cho 5 ml dung dịch Na 2 CO 3 vào 1ml dịch lọc Thêm 1ml thuốc thử folin
Lắc đều ống nghiệm và giữ ở nhiệt độ 37±0,5°C trong 20 phút Khi dung dịch chuyển sang màu xanh, tiến hành đo độ hấp thu tại bước sóng 660nm và ghi nhận kết quả là Am.
Mẫu đối chứng được thực hiện bằng cách sử dụng 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme, sau đó tiến hành các bước tương tự như trong mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện Kết quả độ hấp thụ thu được sẽ là A0.
Hàm lượng tyrosine được giải phóng từ quá trình thủy phân bởi protease được xác định bằng cách so sánh kết quả với đường chuẩn tyrosine, từ đó tính toán hoạt độ của protease.
One activity unit (AU) of protease enzyme is defined as the amount of enzyme required to produce a quantity of amino acids equivalent to 100 micrograms of tyrosine in 1 milliliter of filtrate under experimental conditions.
Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) =( )
Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = ( )
Am: Độ hấp thu của mẫu
Độ hấp thu của ống đối chứng được xác định qua hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thu tại bước sóng 660nm trên đường chuẩn Hệ số pha loãng của enzyme là n, trong khi hệ số chuyển đổi được thiết lập là 1/100.
V: Thể tích của dung dịch enzyme m: Khối lượng chế phẩm enzyme thô Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease
Từ kết quả hàm lượng protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (UI/ml) tính được hoạt tính riêng của enzyme
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme
Khảo sát hoạt tính enzyme protease được thực hiện ở các giá trị pH 6, 7, 8, 9 và 10, trong điều kiện nhiệt độ 37,5 độ C Giá trị pH tại đó enzyme protease hoạt động mạnh nhất sẽ được xác định là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme này.
3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Kết quả các chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá basa chưa thủy phân (nguyên liệu
Bảng 4.1 : Chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá Basa
Thu nhận enzyme trước tinh sạch
Để chuẩn bị dịch chiết enzyme, bạn cần lấy 400 g chế phẩm enzyme thô và thêm 1200 ml nước cất theo tỷ lệ 1:3 Khuấy hỗn hợp trong 30 phút, sau đó lọc thô qua vải và lặp lại quá trình này 3 lần Gom các dịch lọc lại và ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút để thu được dịch chiết thô Cuối cùng, bảo quản dịch chiết thô này trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 độ C.
Bảng 4.2: Hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme thô của nấm mốc Asp.awamori
Hoạt tính enzyme (U/g CP) Hàm lượng protein (mg/g CP) HTR (U/mg)
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme
Mỗi loại enzyme hoạt động hiệu quả trong một khoảng pH nhất định Để tối ưu hóa quá trình thu nhận protein hòa tan, việc khảo sát pH tối ưu cho quá trình thủy phân là rất quan trọng Điều này cần được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lý tưởng là 37 độ C.
Bảng 4.3: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của pH pH 6 7 8 9 10
HT (u/g CP) 111,838 147,395 112,632 99,618 81,417 Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme
Enzyme rất nhạy với pH của môi trường pH thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme
Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng enzyme Mỗi enzyme thích hợp với một vùng pH nhất định
Từ đồ thị 4.1 cho thấy pH tối ưu cho hoạt động của protease là pH=7( 147,395 U/g CP) Ở pH thấp hay cao hơn pH tối ưu, hoạt tính enzyme đều giảm
160 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease
4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Khảo sát nhiệt độ tối ưu từ 30-70 0 C trong cùng điều kiện pH tối ưu ở trên
Bảng 4.4: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của nhiệt độ
HT (U/g CP) 156,15 213,152 169,098 135,047 130,048 Đồ thị 4.2 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme
Nhiệt độ là yếu tố vật lý quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme, đặc biệt là khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất Thông thường, tốc độ phản ứng enzyme tăng lên đến một mức nhiệt độ nhất định, nhưng khi vượt qua giới hạn này, tốc độ phản ứng sẽ bắt đầu giảm.
30C 40C 50C 60C 70C Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease
Enzyme là một loại protein, vì vậy chúng chỉ hoạt động hiệu quả trong một khoảng nhiệt độ nhất định mà không bị biến tính Khi nhiệt độ tăng, tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác cũng tăng theo Tuy nhiên, nếu nhiệt độ tiếp tục tăng lên quá mức, protein của enzyme sẽ bắt đầu bị biến tính, dẫn đến giảm hoạt tính xúc tác và tốc độ phản ứng sẽ giảm dần về 0 Do đó, nhiệt độ tối ưu cho enzyme là mức nhiệt độ tại đó hoạt động của enzyme đạt giá trị cao nhất.
Từ đồ thị 4.2 cho thấy enzyme protease hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ
40 0 C (213,152U/g CP) Vượt quá nhiệt độ này hoạt tính enzyme giảm và đặc biệt giảm mạnh ở 70 0 C do sự biến tính protein
4.3.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt
Bảng 4.5: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của độ bền nhiệt Độ bền nhiệt ( phút) Hoạt tính(U/g CP) Phần trăm theo hoạt tính (%)
54 Đồ thị 4.3 : Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme
Thời gian tác dụng của enzyme trong quá trình thủy phân phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó thời gian cần đủ dài để enzyme có thể cắt các liên kết trong cơ chất Khi cơ chất đã được thủy phân hoàn toàn, quá trình này sẽ kết thúc.
Thời gian thủy phân phải thích hợp để bảo đảm hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng tốt
Theo đồ thị 4.3, thời gian thủy phân (độ bền nhiệt) tại thời điểm 0 phút cho thấy hoạt tính cao nhất so với các mốc thời gian sau Các mốc thời gian tiếp theo đều có hoạt tính thấp hơn đáng kể so với thời điểm 0 phút.
Khi thủy phân ở độ bền nhiệt 10 phút thì hoạt tính giảm 13,86 % so với khi thủy phân ở độ bền nhiệt 0 phút
Nếu cho thời gian thủy phân kéo dài thêm 20 phút thì hoạt tính giảm 19,1% so với độ bền nhiệt 0 phút
0 phút 10 phút 20 phút 30 phút 40 phút 50 phút 60 phút Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme protease hoạt tính (U/g CP)
Giảm 26,63% hoạt tính ở độ bền nhiệt 30 phút và giảm 30,98% hoạt tính so với thủy phân với độ bền nhiệt 0 phút
Nếu cứ kéo dài thời gian thủy phân thì hoạt tính enzyme giảm 35,24% ở độ bền nhiệt 50 phút và giảm 36,43% ở độ bền nhiệt 60 phút so với độ bền nhiệt 0 phút
Vì thế khi thủy phân ta chọn độ bền nhiệt 0 phút
Kết quả tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel
4.4.1 Kết quả tinh sạch enzyme của hãng Amano Đồ thị 4.4 : Sắc ký của hãng Amano
Nhìn vào đồ thị ta thấy enzyme của hãng Amano có 3 peak
Theo đồ thị thì ta nhận thấy rằng peak 3 khá cao nên có thể chứa protease mà ta quan tâm
Bảng 4.6: Tổng hoạt tính và tỏng hàm lượng enzyme của hãng Amano
Hoạt tính (U) Hàm lượng (mg) Hoạt tính riêng (U/mg)
4.4.1 Kết quả tinh sạch enzyme của mẫu enzyme Đồ thị 4.5 :Đồ thị sắc ký lọc gel
Qua sắc kí ta thu được 3 peak
Hàm lượng và hoạt tính của từng peak đã được xác định, trong đó peak 3 cho thấy hàm lượng và hoạt tính protein cao nhất Do đó, có thể dự đoán rằng peak 3 chứa protease quan tâm.
Bảng 4.7: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính sau khi tinh sạch
Hoạt tính enzyme (U/g CP) Hàm lượng protein (mg/g CP) HTR (U/mg)
Sau khi tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel, hàm lượng protein giảm so với trước khi tinh sạch Đồng thời, hoạt tính của enzyme cũng thấp hơn so với mẫu enzyme ban đầu.
Kết quả cho thấy hàm lượng protein sau khi tinh sạch thấp hơn trước tinh sạch do sự hiện diện của protein tạp Sau quá trình tinh sạch, protein tạp bị loại bỏ, dẫn đến việc hoạt tính riêng của enzyme sau tinh sạch tăng đáng kể so với trước tinh sạch.
Bảng 4.8: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính của enzyme
Hoạt tính riêng (U/mg) Độ tinh sạch (lần)
58 Đồ thị 4.6 : Độ tinh sạch trước và sau sắc ký
Sau qui trình sắc ký lọc gel độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch tăng lên 2,66 lần so với enzyme trước tinh sạch
Enzyme của hãng Amano tăng lên 2,95 lần so với enzyme thô
Enzyme của hãng Amano tăng 1,11 lần so với enzyme sau khi tinh sạch
Enzyme thô Enzyme sau sắc ký Enzyme hãng Amano Độ tinh sạch trước và sau sắc ký
Kết quả tinh sạch enzyme bằng phương pháp điện di
Hình 4.1: Kết quả chạy điện di của mẫu protein
Giếng 5: Enzyme của hãng Amano
Vì hoạt tính peak 1 quá thấp nên ta không xác định trọng lượng phân tử của protein enzyme của peak 1 Ta chỉ quan tâm tới peak 2 và peak 3
Bảng 4.9:Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein trong thang chuẩn
Rf Trọng lượng phân tử (Dalton) Log ( trọng lượng phân tử)
0,621 15000 4,176 Đồ thị 4.7: Sự tương quan giữa log của trọng lượng phân tử và giá trị Rf
Phương trình tuyến tính thu được
Y = -2.0597x + 5.4641 Trong đó: y=log (trọng lượng phân tử protein)
X=Rf Tỷ số khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol blue cuối cùng tính từ gel phân tích
Từ phương trình tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lượng phân tử của protein
Trọng lượng phân tử protein = 10 y Giá trị Rf từng vạch của mỗi ba peak và trong mẫu thô
Bảng 4.10: Giá trị Rf từng vạch của của mỗi peak trong mẫu
Vạch Peak 2 Peak 3 Mẫu thô Hãng Amano
4 Không có Không có 0,276 Không có
5 Không có Không có 0,448 Không có
Bảng 4.11: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Hãng Amano
Thứ tự vạch X=Rf Y Trọng lượng phân tử protein (Daltons)
Dựa vào bảng 4.10 ta thấy trọng lượng phân tử protein của hãng Amano nằm trong khoảng 85310-150660 Daltons
Bảng 4.12: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Peak 2
Thứ tự vạch X=Rf Y Trọng lượng phân tử protein (Daltons)
Bảng 4.13: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Peak 3
Thứ tự vạch X=Rf Y Trọng lượng phân tử protein (Daltons)
Dựa vào các bảng trọng lượng phân tử của từng peak ta có thể kết luận được trọng lượng phân tử protein nằm trong khoảng 44258 – 139636 Daltons
Bảng 4.14: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở mẫu thô
Thứ tự vạch X=Rf Y Trọng lượng phân tử protein (Daltons)
Trọng lượng phân tử protein của mẫu thô nằm trong khoảng 34753-151356 Daltons
Ta có thể so sánh trọng lượng phân tử protein của mẫu enzyme trước và sau khi tinh sạch
Mẫu enzyme thô hiển thị nhiều vạch và có màu sắc đậm, điều này cho thấy sự hiện diện của protein tạp trong mẫu Sự có mặt của các protein này đã tạo ra nhiều vạch trong giếng của mẫu enzyme thô, ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme.
Để xác định trọng lượng phân tử của protein chính xác, cần sử dụng mẫu protein đã được tinh sạch Điều này giúp loại bỏ các protein tạp, từ đó không làm ảnh hưởng đến kết quả trọng lượng phân tử của protein mà chúng ta đang nghiên cứu.
Kết quả thủy phân nội tạng cá
4.6.1.1 Hàm lượng protein phương pháp Biure
Bảng 4.15: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 40 0 C
64 Đồ thị 4.8: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở nhiệt độ 40 0 C
Nhận xét: Ở mốc thời gian 10h lượng protein của nồng độ 0,5% tăng 2,03 lần so với lượng protein ở mốc thời gian 0h
Nồng độ enzyme 0,7% ở 10h có lượng protein tăng 1,94 lần so với mốc thời gian ban đầu
Lượng protein ở mốc thời gian 10h của nồng độ 0,9% tăng 2,61 lần và tăng 2,49 lần của nồng độ 1,1% so với mốc thời gian 0h
Như vậy nồng độ enzyme thích hợp thủy phân nhất là 0,9%
Hàm lượng protein ở nhiệt độ 40 0 C
(% so với lượng ban đầu)
4.6.1.2 Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 40 0 C
Bảng 4.16: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 40 0 C
10h 8.45 9.15 10.46 10.58 Đồ thị 4.9: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 40 0 C
Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ
40 0 C (% so với lượng ban đầu)
Nhận xét: Đạm amin là thành phần quan trọng trong quá trình thủy phân Trong thủy phân người ta chỉ quan tâm đến hàm lượng đạm amin
Hàm lượng đạm amin đạt giá trị cao nhất ở nồng độ 1,1%, tuy nhiên, khi tiến hành thủy phân, cần chú ý đến tỷ lệ phần trăm của lượng amin sinh ra so với lượng đạm amin ban đầu Đặc biệt, đạm amin được sinh ra nhiều nhất ở nồng độ 0,9%.
4.6.1.3 Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 40 0 C
Bảng 4.17: Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 40 0 C
67 Đồ thị 4.10: Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 40 0 C
Theo đồ thị 4.10, hàm lượng NH3 đạt mức cao nhất ở nồng độ 0,5%, trong khi đó, ở nồng độ enzyme này, cơ chất chưa bị thủy phân, dẫn đến việc không có mùi hôi Thời gian cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân; cần phải có thời gian phù hợp để enzyme có thể thủy phân hoàn toàn cơ chất Ở các nồng độ enzyme cao như 0,7%, 0,9% và 1,1%, cơ chất bị thủy phân nhanh hơn, do đó lượng NH3 sinh ra thấp hơn so với nồng độ 0,5%.
Lượng NH 3 tăng nhanh trong khỏang thời gian 8h-10h
Vì thế khi tiến hành thủy phân nên tránh kéo dài thời gian thủy phân từ 8h
Hàm lượng NH 3 nhiệt độ 40 0 C (% so với lượng ban đầu)
4.6.2.1 Hàm lượng protein theo phương pháp Biure
Bảng 4.18 : Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở nhiệt độ 50 0 C Thời gian thủy phân
69 Đồ thị 4.11: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 50 0 C
Nồng độ enzyme 0,9% có hàm lượng protein cao nhất
Nồng độ enzyme ảnh hưởng đến lượng protein được tạo ra trong quá trình thủy phân Ở nồng độ 0,5%, enzyme có mức thấp không thể thủy phân hoàn toàn cơ chất ban đầu, dẫn đến hàm lượng protein sinh ra thấp hơn so với các nồng độ khác.
Lượng protein ở nồng độ 0,9% tương đương với nồng độ 1,1% Việc thủy phân ở nồng độ 1,1% cũng cho ra lượng protein tương tự, nhưng lại đòi hỏi thêm enzyme, dẫn đến lãng phí không cần thiết.
Vì thế khi thủy phân thì ta nên chọn nồng độ enzyme 0,9%
Hàm lượng protein ở nhiệt độ 50 0 C
(% so với lượng ban đầu)
Bảng 4.19: Hàm lượng đạm amin ở 50 0 C
71 Đồ thị 4.12: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 50 0 C
Bảng 4.19 cho thấy rằng nồng độ 1,1% tạo ra lượng đạm amin cao nhất Ở nồng độ 0,5%, lượng đạm amin tăng 2,12 lần so với thời điểm 0h Đặc biệt, với nồng độ enzyme 0,7%, lượng đạm amin sinh ra tăng đến 2,76 lần so với mốc thời gian 0h.
Lượng đạm amin tăng 2,98 lần ở nồng độ 0,9% so với lượng amin ban đầu và tăng 2,46 lần ở nồng độ 1,1% so với mốc thời gian 0h
Như vậy khi tiến hành thủy phân ta nên chọn nồng độ enzyme 0,9%
Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 50 0 C
(% so với lượng ban đầu)
Bảng 4.20: Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 50 0 C
10h 4.98 3.97 3.54 2.73 Đồ thị 4.13: Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 50 0 C
Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 50 0 C
NH 3 gây ra mùi hôi thối nên khi thủy phân hay các quá trình liên quan đến mùi hôi này thì nên hạn chế Nó có ảnh hưởng không tốt đến sản phẩm tạo thành
Theo đồ thị, nồng độ NH3 tăng mạnh từ 8h đến 10h Ở nhiệt độ 50°C, vi sinh vật đang thích nghi và chưa hoạt động mạnh trước 8h Tuy nhiên, sau thời điểm này, vi sinh vật bắt đầu hoạt động mạnh mẽ, dẫn đến quá trình thủy phân diễn ra mạnh và gây ra mùi hôi khó chịu.
Vậy NH 3 tăng mạnh ở nồng độ 0,5%, không nên để quá trình thủy phân kéo dài hơn 8h
4.6.3.1 Hàm lượng protein theo phương pháp Biure
Bảng 4.21 : Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở nhiệt độ 60 0 C Thời gian thủy phân
74 Đồ thị 4.14: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở nhiệt độ 60 0 C
Hàm lượng protein của các nồng độ enzyme tăng đều theo từng mốc thời gian
Lượng protein tăng đáng kể theo thời gian và nồng độ enzyme Cụ thể, ở nồng độ 0,5%, lượng protein tại mốc 10 giờ tăng 3,26 lần so với thời điểm 0 giờ Tương tự, ở nồng độ 0,7%, lượng protein tăng 3,35 lần tại mốc 10 giờ so với 0 giờ Đặc biệt, ở nồng độ 0,9%, lượng protein tăng 3,54 lần tại mốc 10 giờ, và tăng 3,44 lần so với lượng protein ban đầu.
Mặc dù cùng một mốc thời gian, nhưng hàm lượng protein tăng lên khác nhau, vì vậy chúng ta sẽ lựa chọn nồng độ enzyme có sự gia tăng cao nhất để tiến hành quá trình thủy phân.
Vì vậy ta chọn nồng độ 0,9% trong quá trình thủy phân
Hàm lượng protein ở nhiệt độ 60 0 C
Bảng 4.22: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 60 0 C
10h 10.94 13.24 17.61 17.88 Đồ thị 4.14: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 60 0 C
Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 60 0 C
Trong quá trình thủy phân, việc chú trọng đến lượng đạm amin sinh ra là rất quan trọng Mục tiêu chính của thủy phân là xác định nồng độ enzyme tối ưu nhằm đạt được hàm lượng amin cao nhất có thể.
Hàm lượng đạm amin tăng đều theo từng mốc thời gian
Hàm lượng đạm amin ở nồng độ enzyme 1,1% và nồng độ 0,9% chênh lệnh nhau không đáng kể
Sau 10 giờ, nồng độ 0,9% dẫn đến sự gia tăng 3,47 lần lượng đạm amin so với mức ban đầu Tương tự, ở nồng độ 1,1%, lượng đạm amin tăng gần 3 lần so với lượng amin được sản sinh ở thời điểm 0 giờ.
Ta chọn nồng độ thủy phân 0,9%
Bảng 4.23: Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 60 0 C
77 Đồ thị 4.15: Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 60 0 C
Nhận xét cho thấy rằng tại thời điểm 0h, lượng NH3 có giá trị tương đương, nhưng sau một thời gian, sự sinh ra của NH3 có sự khác biệt rõ rệt Nồng độ enzyme 0,5% thấp dẫn đến thời gian thủy phân kéo dài, làm tăng lượng NH3 Trong khi đó, giữa nồng độ enzyme 0,7% và 0,9%, lượng NH3 sinh ra ở nồng độ 0,9% lại thấp hơn Điều này cho thấy nồng độ enzyme có ảnh hưởng lớn đến tốc độ thủy phân của cơ chất; do đó, nồng độ enzyme càng thấp, lượng NH3 sinh ra càng nhiều.
Lượng NH 3 tăng mạnh từ mốc thời gian 8h
Khi thực hiện quá trình thủy phân, cần chú ý không kéo dài thời gian quá lâu để tránh phát sinh mùi hôi thối, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Nồng độ NH3 đạt giá trị cao nhất ở mức 0,5%.
Hàm lượng NH 3 ở nhiệt độ 60 0 C
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
