3.2.1.1 Nguyên tắc
Nguyên tắc này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Commasie brilliant blue liên kết với protein trong dung dịch Trong dung dịch mang tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước song hấp thu cực đại ở 465nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595nm liên hệ trực tiếp với nồng độ protein
Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Commasie brilliant blue có màu da cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi
21
trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện, màu sẽ xuất hiện trong 2 phút và ổn định trong 1 giờ
3.2.1.2 Tiến hành thí nghiệm: A/ Hóa chất và thiết bị:
Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml: cân chính xác 100mg albumine dạng bột trên cân phân tích, định mức đến 100ml bằng nước cất
Dung dịch thuốc thử theo phương pháp Bradford Commasie brilliant blue: 0,001g
Ethanon tuyệt đối: 4,7g Acid phosphoric 85%: 8,5g
Phẩm màu Commasie brilliant blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung Acid phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất, lắc đều và giữ ở 4OC
Thiết bị máy quang phổ
B/ Lập đồ thị chuẩn: Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nồng độ Albumine (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dd Albumine chuẩn (µg) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Nước cất 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 Thuốc thử Coomasie (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
22
Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút. Thực hiện phản ứng ở các ống còn lại 2,3,4 các ống cách nhau 1 phút
Tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm trong các ống nghiệm ở bước sóng 595nm
Mẫu thí nghiệm được tiến hành tương tự mẫu trên. Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng cách đường chuẩn
3.2.1.3 Tính kết quả:
Trị số mật độ quang(OD) của những ống đối chứng (ống 2 đến ống 10) sau khi trừ đi trị số của các ống thử không (ống 1) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật quang (OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml). Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi , trị số mật độ quang của ống thử không, rồi chiếu vào đường cong để suy ra lượng protein có trong dịch mẫu
3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease 3.2.2.1 Nguyên tắc
Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme. Hoạt động của enzyme được biểu diễn bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme
3.2.2.2 Tiến hành thí nghiệm
A/ Dụng cụ và hóa chất:
Ống nghiệm, pipet, bình định mức, giấy lọc…
Bể ổn nhiệt, máy đo quang phổ, cân phân tích,máy khuấy từ, máy đo pH
B/ Hóa chất:
HCl 0,1M Na 2CO 3 0,4 M
23 Dung dịch TCA 0,4 M
Tyrosine tinh khiết Thuốc thử folin
Đệm Photphat pH=7, 0,1M
Dung dịch casein 1%: Cân 1g casein thêm vào 100ml dung dịch đệm Photphat 0,1M ở pH=7
C/ Dựng dường chuẩn tyrosine:
Thực hiện 1 loạt phản ứng theo bảng sau:
Ống số 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nồng độ (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dd tyrosine chuẩn (µg) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dd HCl (ml) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 Na 2CO 3 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử folin (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Bảng 3.3: Lập đường chuẩn tyrosine
Pha dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 µg tyrosine/ml HCl như bảng. Thêm 5ml dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1ml thuốc thử folin vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi lắc đều, để ổn định dung dịch ở 37 ± 0,50C trong 20 phút. Đo dịch hấp thu của dịch này ở bước sóng 660nm. Ghi nhận kết quả
Đối với ống đối chứng dùng 1 ml acid HCl 0,1 M thay cho tyrosine. Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bước sóng 660nm. Ghi nhận kết quả này
Trị số của mật độ quang của các ống từ ống 1 đến ống 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ được giá trị OD1 đến OD9. Vẽ đồ thị dựa vào bảng biến
24
thiên của OD theo nồng độ protein. Đồ thị này còn gọi là dường chuẩn tyrosine
D/ Xác định hoạt tính enzyme protease:
Hoạt tính enzyme dược khảo sát ở nhiệt độ 37± 0,50C và pH=7
Cho 1ml dung dịch cơ chât casein 1% vào ống nghiệm ủ ở 37± 0,50C trong 10-15 phút
Sau thời gian ủ, cho 1ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều. đem ủ hỗn hợp này ở 37 ± 0,50C trong 1 giờ
Cho vào 2ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme
Để ổn định dung dịch trong 25 phút. Sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại hết tủa
Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc Thêm 1ml thuốc thử folin
Lắc đều ống nghiệm để yên ở 37±0,50C trong 20 phút
Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bước sóng 660nm( ghi nhận kết quả này là Am)
Mẫu đối chứng: Lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ hấp thụ là A0
Hàm lượng tyrosine được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng cách lấy kết quả này so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt độ protease theo tính toán sau:
Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100µg tyrosine trong 1ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm
25
Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = ( ) F =
Am: Độ hấp thu của mẫu
A0: Độ hấp thu của ống đối chứng
F: Hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thu ở bước sóng 660nm trên đường chuẩn
n: Hệ số pha loãng của enzyme 1/100: Hệ số chuyển đổi
V: Thể tích của dung dịch enzyme m: Khối lượng chế phẩm enzyme thô
Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease
Từ kết quả hàm lượng protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (UI/ml) tính được hoạt tính riêng của enzyme
HTR (UI/mg) = ốđơ ạ
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme
Khảo sát hoạt tính enzyme protease ở các giá trị pH=6, 7, 8, 9, 10 trong cùng điều kiện nhiệt độ 37 0,50C. Ở giá trị nào cho hoạt động của protease mạnh nhất (hoạt tính cao nhất) thì đó là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme
26
3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme
Thực hiện tương tự như trên, nhưng ta cho phản ứng xúc tác ở các nhiệt độ khác nhau là 300C, 400C, 500C, 600C, 700C trong cùng một pH (pH tối ưu xác định ở thí nghiệm trên). Ở nhiệt độ nào hoạt tính của enzyme cao nhất thì đó là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme
27
`3.2.5 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính của enzyme
Tại pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu đã tìm được áp dụng tìm độ bền nhiệt của enzyme ở 0-60 phút, mỗi thời điểm khảo sát cách nhau 10 phút
Phương pháp: cho casein 1% vào enzyme ủ trước 60 phút. Tiếp tục bố trí các thí nghiệm cách nhau 10 phút. Tính từ mốc 60 phút là 0 phút, 70 phút là 10 phút, cứ tính như vậy để xác định độ bền nhiệt
3.2.6 Tinh sạch enzyme protease bằng sắc ký lọc gel
Có nhiều phương pháp khác nhau để tinh sạch enzyme, nhưng phương pháp thường dùng hiện nay là tinh sạch enzyme bằng phương pháp rây phân tử hay phương pháp lọc gel
28
Hình 3.2 : Hệ thống sắc ký
3.2.6.1 Bản chất phương pháp
Là sự tách riêng biệt các phân tử protein dựa trên sự khác biệt về hình dạng và MW khi hỗn hợp protein di chuyển dọc theo nền chất mang có kích thước lỗ quy định. Kích thước lỗ được tạo bởi liên kết ngang nối mạch dextran,tạo các
29
lỗ to nhỏ khác nhau. Khi di chuyển dọc theo nền chất mang xốp nói trên, những phân tử protein có kích thước lớn hơn lỗ sẽ nhanh chóng ra khỏi chất nền.
Trong khi những phân tử protein có kích thước nhỏ hơn lỗ sẽ ra khỏi cột chậm hơn, vì bị giữ lại trong các lỗ ở các mức độ khác nhau do quá trình khuếch tán. Còn những phân tử protein có kích thước lớn sẽ đi bên ngoài các hạt gel, nên sẽ di chuyển nhanh hơn và giải phóng ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ 3.2.6.2 Hóa chất và dụng cụ A/ Dụng cụ: Hệ thống sắc ký cột- Hãng Bio-Rad, Mỹ Phễu đổ gel Bình hút chân không Flow adaptor 1,5cm Cột sắc ký Bio –Rad, thể tích 60ml Biogel P-100 Bình đựng dung dịch đệm Ống nghiệm 50 cái
Vòi hút chân không để khử bọt khí của các dung dịch
B/ Hóa chất:
Gel “Biogel P-100”, hãng Bio –Rad có đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90µm, khả năng ngậm nước:12ml/g gel khô, phạm vi phân tách 5000- 150000 Daltons
Đệm photphat 0,1M, pH 7, khử bọt khí trước khi dùng
3.2.6.3 Tiến hành chạy sắc ký A Chọn lựa gel A Chọn lựa gel
30
Cỡ hạt hay sử dụng 100-200 mesh (10-40 µm) hay 200-400 mesh (20- 80µm). Hạt nhỏ hơn cho kết quả tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện rất dài
B Chuẩn bị gel và dựng cột
Cân 5g gel “Biogel P-100” khô (chính xác cần dùng 4,4g nhưng vì thể tích gel bị mất trong suốt quá trình thao tác nên cần cân dư). Cho nước cất vào từ từ, lượng nước nhiều gấp hai lần so với thể tích lớn nền gel cần cho trong cột. Cụ thể ít nhất 53 2 = 106 ml nước cất
Đối với lượng gel từ Biogel P-30 đến Biogel P-100 cần 12 giờ ở 200C để hydrate hóa hoặc 4 giờ nếu bắt đầu ở 1000C. Sau khi thể huyền phù đồng nhất của các gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định trong quá trình hydrate hóa
Sau khi hydrate hóa xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt, chuyển dung dịch vào bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không. Khử khí của dung dịch trong khoảng 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình, không dùng đũa khuấy vì có thể làm hư gel
Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền (106 ml) và lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90-95% hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để tạo các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel
Gắn phễu đổ gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bọt khí
Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2-5cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel
Khi cột đã được nạp đầy gel, khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm gấp 2 lần thể tích của nền (106 ml) chảy qua cột đến lúc điều khiển tốc độ qua dòng chảy
31
Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào lớp nền gel qua flow adaptor. Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị
B Chuẩn bị mẫu:
Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không nhiễm bẩn và không có các hạt rắn), hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm
Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm độ phân tách, ít quá làm mẫu bị loãng. Để các nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột tới 10-25% thể tích cột để phân tích
Tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh ở mức độ thấp hơn một chút so với dòng chảy tự do ngang (15-25ml/giờ) còn đối với gel lỗ lớn 2-5 ml/cm2. (5-10 ml/giờ). Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc do bơm nén. Phương pháp lọc gel bằng cách chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel lỗ nhỏ. Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định nên phải dùng bơm nén. Thông thường là nén theo chiều trọng lực
3.2.7 Phương pháp điện di 3.2.7.1 Thiết bị và dụng cụ 3.2.7.1 Thiết bị và dụng cụ Bộ nguồn điện di Hộp điện di Dụng cụ làm gel (tấm kính, lược, kẹp) Pipettman các loại
Cấu tạo của một khung gel:
Gel được chuẩn bị trong một khoảng hẹp được tạo thành bởi hai tấm kính phân cách nhau bởi một tấm đệm làm bằng chất dẻo hay nguyên liệu thích hợp. Miếng đệm dài hơn tấm kiếng khoảng 1cm chiều rộng và có độ dày 0,75mm. Các giếng nơi mẫu cho vào được tạo thành từ một mẫu lược chạy dài ngang đỉnh gel có cùng chiều dày với miếng đệm, các răng cưa lược có chiều dày với
32
miếng đệm, các răng cưa lược có chiều dài khoảng 1cm, rộng từ 2-10mm và khoảng cách giữa các răng khoảng 3mm
3.2.7.2 Hóa chất:
Thang phân tử lượng nhỏ (sigma) gồm các protein chuẩn có kích thước (Dalton) xác định như nhau:
Myosin 200.000 Beta-galactosidase 116.250 Phosphorylase b97.400 Senim albumin 66.200 Carbonic anhydrase 31.000 Trypsin inhibitor 21.500 Lysozyme 14.400 A protinin 6500
Sodium Dodecyl sulfate (SDS) 10%: Cân chính xác 10g SDS cho vào cốc 100ml, thêm vào đó 80ml nước cất, khuấy đều và chuyển vào bình định mức thêm nước cất tới vạch và lắc đều
+ Dung dịch đệm gel phân tách (aparating gel buffer) Tris HCl 1.5M, pH
8.8-0,4% SDS: Cân 36,3 Tris pha trong 100ml nước cất thêm dần HCl 6N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 8.8. Hút 8ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 200ml, lắc đều và giữ ở 40C
+ Dung dịch đệm gel gom (Stacking gel buffer) Tris-Cl 0.5M, pH 6.8- 0,4SDS : Cân 6,05 gTris pha trong 100ml nước cất thêm dần HCl 6N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 6.8. Hút 4ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 100ml, lắc đều giữ ở 40C
+ Amoniumpersulfate 10% ( chỉ pha trước khi dùng): Cân 0,1g cho vào một eppandorf 1000µl thêm 1ml nước cất, lắc đều giữ ở nhiệt độ phòng
+ Dung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8.3: Pha dung dịch (10X) 30g Tris, 144g Glycine và 10g SDS hòa trong 1000ml nước cất
33
+ Dung dịch nạp mẫu 2X (2X treatment buffer) có thành phần như sau: 2,5ml dung dịch đệm Tris-Cl 0,5ml, pH 6.8 , 4ml dung dịch SDS 10%, 2ml Glycerol, 2ml Bromophenol Blue, 0,2ml mecaptoethanol, thêm nước đủ 10ml
+ Dung dịch nhuộm gel: Chuẩn bị 250ml dung dịch nhuộm gel chứa
0,625g Coomasie Blue G250: 112,5 ml ethanol tuyệt đối, 112,5ml nước cất và 25ml acid acetic, lắc đều giữ trong chai màu tối
+ Dung dịch giải nhuộm 30ml ethnol, 10ml acid acetic, 60ml nước cất
A/ Chuẩn bị gel: + Đổ gel
Chú ý: Polyacrylamide là chất độc cho thần kinh. Vì vậy không được hít và uống. Khi dính vào nên rửa tay ngay
Chuẩn bị đổ một lớp gel có kích thước 100 100 0,75 mm có nồng độ acrlamide là 10%
+ Gel phân tách:
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 50ml sạch 40% acrlamide :2,5ml Tris-HCl 1.5M 8.8-0,4% SDS 2,5ml Nước cất 4,445ml TEMED 5µl Amonium persulfate 10%: 50µl Tổng thể tích 10ml
Sau khi cho Amonium persulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí) dùng pipettman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20-30 phút)
+ Gel gom (Staking gel)