A Chọn lựa gel
30
Cỡ hạt hay sử dụng 100-200 mesh (10-40 µm) hay 200-400 mesh (20- 80µm). Hạt nhỏ hơn cho kết quả tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện rất dài
B Chuẩn bị gel và dựng cột
Cân 5g gel “Biogel P-100” khô (chính xác cần dùng 4,4g nhưng vì thể tích gel bị mất trong suốt quá trình thao tác nên cần cân dư). Cho nước cất vào từ từ, lượng nước nhiều gấp hai lần so với thể tích lớn nền gel cần cho trong cột. Cụ thể ít nhất 53 2 = 106 ml nước cất
Đối với lượng gel từ Biogel P-30 đến Biogel P-100 cần 12 giờ ở 200C để hydrate hóa hoặc 4 giờ nếu bắt đầu ở 1000C. Sau khi thể huyền phù đồng nhất của các gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định trong quá trình hydrate hóa
Sau khi hydrate hóa xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt, chuyển dung dịch vào bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không. Khử khí của dung dịch trong khoảng 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình, không dùng đũa khuấy vì có thể làm hư gel
Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền (106 ml) và lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90-95% hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để tạo các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel
Gắn phễu đổ gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bọt khí
Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2-5cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel
Khi cột đã được nạp đầy gel, khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm gấp 2 lần thể tích của nền (106 ml) chảy qua cột đến lúc điều khiển tốc độ qua dòng chảy
31
Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào lớp nền gel qua flow adaptor. Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị
B Chuẩn bị mẫu:
Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không nhiễm bẩn và không có các hạt rắn), hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm
Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm độ phân tách, ít quá làm mẫu bị loãng. Để các nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột tới 10-25% thể tích cột để phân tích
Tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh ở mức độ thấp hơn một chút so với dòng chảy tự do ngang (15-25ml/giờ) còn đối với gel lỗ lớn 2-5 ml/cm2. (5-10 ml/giờ). Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc do bơm nén. Phương pháp lọc gel bằng cách chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel lỗ nhỏ. Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định nên phải dùng bơm nén. Thông thường là nén theo chiều trọng lực