Có nhiều phương pháp khác nhau để tinh sạch enzyme, nhưng phương pháp thường dùng hiện nay là tinh sạch enzyme bằng phương pháp rây phân tử hay phương pháp lọc gel
28
Hình 3.2 : Hệ thống sắc ký
3.2.6.1 Bản chất phương pháp
Là sự tách riêng biệt các phân tử protein dựa trên sự khác biệt về hình dạng và MW khi hỗn hợp protein di chuyển dọc theo nền chất mang có kích thước lỗ quy định. Kích thước lỗ được tạo bởi liên kết ngang nối mạch dextran,tạo các
29
lỗ to nhỏ khác nhau. Khi di chuyển dọc theo nền chất mang xốp nói trên, những phân tử protein có kích thước lớn hơn lỗ sẽ nhanh chóng ra khỏi chất nền.
Trong khi những phân tử protein có kích thước nhỏ hơn lỗ sẽ ra khỏi cột chậm hơn, vì bị giữ lại trong các lỗ ở các mức độ khác nhau do quá trình khuếch tán. Còn những phân tử protein có kích thước lớn sẽ đi bên ngoài các hạt gel, nên sẽ di chuyển nhanh hơn và giải phóng ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ 3.2.6.2 Hóa chất và dụng cụ A/ Dụng cụ: Hệ thống sắc ký cột- Hãng Bio-Rad, Mỹ Phễu đổ gel Bình hút chân không Flow adaptor 1,5cm Cột sắc ký Bio –Rad, thể tích 60ml Biogel P-100 Bình đựng dung dịch đệm Ống nghiệm 50 cái
Vòi hút chân không để khử bọt khí của các dung dịch
B/ Hóa chất:
Gel “Biogel P-100”, hãng Bio –Rad có đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90µm, khả năng ngậm nước:12ml/g gel khô, phạm vi phân tách 5000- 150000 Daltons
Đệm photphat 0,1M, pH 7, khử bọt khí trước khi dùng