3.2.7.1 Thiết bị và dụng cụ Bộ nguồn điện di Hộp điện di Dụng cụ làm gel (tấm kính, lược, kẹp) Pipettman các loại
Cấu tạo của một khung gel:
Gel được chuẩn bị trong một khoảng hẹp được tạo thành bởi hai tấm kính phân cách nhau bởi một tấm đệm làm bằng chất dẻo hay nguyên liệu thích hợp. Miếng đệm dài hơn tấm kiếng khoảng 1cm chiều rộng và có độ dày 0,75mm. Các giếng nơi mẫu cho vào được tạo thành từ một mẫu lược chạy dài ngang đỉnh gel có cùng chiều dày với miếng đệm, các răng cưa lược có chiều dày với
32
miếng đệm, các răng cưa lược có chiều dài khoảng 1cm, rộng từ 2-10mm và khoảng cách giữa các răng khoảng 3mm
3.2.7.2 Hóa chất:
Thang phân tử lượng nhỏ (sigma) gồm các protein chuẩn có kích thước (Dalton) xác định như nhau:
Myosin 200.000 Beta-galactosidase 116.250 Phosphorylase b97.400 Senim albumin 66.200 Carbonic anhydrase 31.000 Trypsin inhibitor 21.500 Lysozyme 14.400 A protinin 6500
Sodium Dodecyl sulfate (SDS) 10%: Cân chính xác 10g SDS cho vào cốc 100ml, thêm vào đó 80ml nước cất, khuấy đều và chuyển vào bình định mức thêm nước cất tới vạch và lắc đều
+ Dung dịch đệm gel phân tách (aparating gel buffer) Tris HCl 1.5M, pH
8.8-0,4% SDS: Cân 36,3 Tris pha trong 100ml nước cất thêm dần HCl 6N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 8.8. Hút 8ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 200ml, lắc đều và giữ ở 40C
+ Dung dịch đệm gel gom (Stacking gel buffer) Tris-Cl 0.5M, pH 6.8- 0,4SDS : Cân 6,05 gTris pha trong 100ml nước cất thêm dần HCl 6N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 6.8. Hút 4ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 100ml, lắc đều giữ ở 40C
+ Amoniumpersulfate 10% ( chỉ pha trước khi dùng): Cân 0,1g cho vào một eppandorf 1000µl thêm 1ml nước cất, lắc đều giữ ở nhiệt độ phòng
+ Dung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8.3: Pha dung dịch (10X) 30g Tris, 144g Glycine và 10g SDS hòa trong 1000ml nước cất
33
+ Dung dịch nạp mẫu 2X (2X treatment buffer) có thành phần như sau: 2,5ml dung dịch đệm Tris-Cl 0,5ml, pH 6.8 , 4ml dung dịch SDS 10%, 2ml Glycerol, 2ml Bromophenol Blue, 0,2ml mecaptoethanol, thêm nước đủ 10ml
+ Dung dịch nhuộm gel: Chuẩn bị 250ml dung dịch nhuộm gel chứa
0,625g Coomasie Blue G250: 112,5 ml ethanol tuyệt đối, 112,5ml nước cất và 25ml acid acetic, lắc đều giữ trong chai màu tối
+ Dung dịch giải nhuộm 30ml ethnol, 10ml acid acetic, 60ml nước cất
A/ Chuẩn bị gel: + Đổ gel
Chú ý: Polyacrylamide là chất độc cho thần kinh. Vì vậy không được hít và uống. Khi dính vào nên rửa tay ngay
Chuẩn bị đổ một lớp gel có kích thước 100 100 0,75 mm có nồng độ acrlamide là 10%
+ Gel phân tách:
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 50ml sạch 40% acrlamide :2,5ml Tris-HCl 1.5M 8.8-0,4% SDS 2,5ml Nước cất 4,445ml TEMED 5µl Amonium persulfate 10%: 50µl Tổng thể tích 10ml
Sau khi cho Amonium persulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí) dùng pipettman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20-30 phút)
+ Gel gom (Staking gel)
34 40% acrlamide 0,5ml Tris-HCl 0.5M 6.8-0,4% SDS 1ml Nước cất 2,476ml Amonium persulfate 10%: 20µl Tổng thể tích 4ml
Sau khi gel phân tích đã trùng ngưng hoàn toàn, đổ hết nước bên trên. Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipettman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào gel để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau khi gel trùng ngưng thì tháo được, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di, cho dung dịch điện di đi vào buồng điện di
3.2.7.3 Chuẩn bị mẫu và chạy điện di:
+ Xử lý mẫu:
Hút 30µl dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) và 30µl dung dịch mẫu protein vào một eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thủy 5-10 phút ly tâm 10000 vòng/ phút trong 1-5 giây
Chú ý nồng độ protein trong mẫu vừa đủ sao cho hàm lượng protein trong một giếng không vượt quá 20-40µl và hàm lượng protein /band không vượt quá 0,1µl
Đối với thang chuẩn protein (Biorad) hút 2µl vào eppendorf 1ml chứa 8µl nước cất và 10µl dung dịch nạp mẫu
+ Tiến hành chạy điện di:
Dùng pipettman 10µl nạp mẫu vào các giếng (20µl/giếng) Tiến hành chạy điện di ổn định dòng 100V
Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã được chuẩn bị trước 1 giờ. Sau đó, tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Sau khi nhuộm xong, protein được phát hiện nhờ các vạch xanh lam trên nền gel trong suốt
35
3.2.7.4 Xác định trọng lượng phân tử protein
Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách tới các band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng
Tính giá trị Rf
Rf= á á ạ à
3.3 Thủy phân nội tạng cá 3.3.1 Xác định độ ẩm 3.3.1 Xác định độ ẩm
3.3.1.1 Nguyên tắc
Dùng sức nóng làm bay hơi hết nước trong mẫu thử. Cân trọng lượng thực phẩm trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm lượng nước có trong mẫu thử
Hình 3.3: Nội tạng cá trước khi sấy
3.3.1.2 Dụng cụ và vật liệu
Tủ sấy được điều chỉnh nhiệt độ (100-1050) Cân phân tích chính xác đến 0,001g
Nồi cách thủy
Bình hút ẩm, phía dưới để chất hút ẩm Cốc cân thủy tinh đáy bẹt
36
3.3.1.3 Cách tiến hành
Cân chính xác 10g mẫu đã được nghiền nhỏ vào một cái cốc sứ. Cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác 0,001g
Cho tất cả vào tủ sấy 100-1050C ,sấy khô cho đến trọng lượng không đổi, thường tối thiểu trong 6 giờ. Trong thời gian sấy cứ sau 1 giờ lấy đũa thủy tinh nghiền nhỏ phần mẫu bị vón cục, sau đó lại dàn đều và tiếp tục sấy
Sấy xong, đem làm nguội ở bình hút ẩm (25-30 phút) và đem cân ở cân phân tích với độ chính xác như trên
Cho vào tủ sấy 100-1050C trong 30 phút, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm và cân như trên cho tới trọng lượng không đổi. Kết quả giữa hai lần cân liên tiếp không được cách nhau quá 0,5mg cho mỗi g chất thử
3.3.1.4 Tính kết quả
Độ ẩm theo phần trăm được tính bằng công thức: (G1-G2).100
X =
G1-G
Trong đó
G : là trọng lượng của cốc sứ
G1: trọng lượng của mẫu trước khi sấy G2: trong lượng của mẫu sau khi sấy
3.3.2 Xác định hàm lượng tro 3.3.2.1 Nguyên tắc
Dùng sức nóng (500-5500) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính phần trăm tro có trong mẫu
3.3.2.2 Dụng cụ và vật liệu
Chén nung bằng sứ chịu nhiệt Cân phân tích có độ chính xác cao
37 Lò nung được điều chỉnh nhiệt độ Bình hút ẩm có chứa các hạt hút ẩm Bếp điện
3.3.2.3 Tiến hành
Cho chén nung vào lò và nung trong 3 giờ nhiệt độ 500-5500C. Sau đó lấy chén nung ra và làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân để xác định khối lượng với độ chính xác 0,001g. Lặp lại quá trình trên cho tới khi khối lượng chén nung không đổi (m2). Cân mg mẫu thử ở trạng thái khô không khí và cho chén nung đã biết khối lượng với độ chính xác 0,001g
Dàn đều mẫu trên đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện chho đến khi mẫu bốc hết khói, sau đó đặt chén mẫu vào lò nung và nung ở nhiệt độ 500-5500C trong khoảng 1-2 giờ. Sau đó lấy ra và làm nguội trong bình hút ẩm, đem mẫu đi cân ta được khối lượng m1, làm lại quá trình nung mẫu cho đến khi không đổi
3.3.2.4 Tính kết quả
Hàm lượng tro thô của mẫu
X = 1 2 100%
Trong đó:
X hàm lượng tro thô của mẫu (%)
m1 khối lượng chén với mẫu thử sau khi nung (g) m2 khối lượng mẫu thử trước khi nung (g)
3.3.3 Xác định hàm lượng Canxi a) Nguyên tắc :
Dùng Trilon B xác định Canxi trong dung dịch với chỉ thị là murexid (C8H5O6N5) trong môi trường có pH =12. Ký hiệu chất chỉ thị là H3I- trong môi trường có pH=12, H3I- có màu tím và khi kết hợp với canxi tạo thành chất phức hợp có màu hồng
38
H3I- + Ca2+ CaH3I+
Chất phức tạp của Ca với murexid không bền bằng chất phức tạp tạo bởi Canxi và trilon B. Vì vậy, trilon B đẩy chỉ thị murexid ra khỏi chất phức tạp dưới dạng tự do có màu tím CaH3I+ + H2Y2- CaY2+ + H3I- + 2H+ b) Dụng cụ và hóa chất: Dụng cụ: Bình tam giác 100ml Ống chuẩn độ 25ml Ống hút 2,5,10 ml Hóa chất: Dung dịch NaOH 10% Dung dịch KCN 10%
Chỉ thị murexid: Cân 0,1g murexid + 50g NaCl tinh khiết. Nghiền nhuyễn bằng cối, cho vào chai thủy tinh có đậy nút kín
Dung dịch Trilon B
c) Cách tiến hành:
Hút 20ml dung dịch A, cho vào bình tam giác 100ml. Cho thêm 2ml dung dịch NaOH 10% cho 5 giọt KCN 3% và khoảng nửa hạt gạo chỉ thị murexid. Chuẩn độ bằng dung dịch trilon B 0,02N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím, cần thực hiện song song một sự thử không
39
d) Kết quả:
Kết quả được tính theo công thức sau: Thể tích trilon B cần chuẩn độ Canxi
v1.C
V1 = 20,04 100
a
Trong đó:
v1 : là thể tích trilon B 0,02 N dùng để chuẩn độ C: độ nguyên chuẩn của dung dịch Trilon B
A: là trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch lấy để chuẩn độ
20,04 : Đương lượng của Canxi
V1: Thể tích Trilon B cần để chuẩn độ khi xác định lượng canxi trong dung dịch mẫu tương đương với 100g mẫu khô
3.3.4 Xác định hàm lượng Photpho
Xác định hàm lượng photphotrong giới hạn nồng độ từ 1-20 mg/cm3
a) Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào khả năng ion orthophotphat phản ứng với ammonium molybdate tạo thành phosphomolybdate phức chất có màu xanh lơ
2MoO2.4MoO3 + H3PO4 (MoO2.4MoO3)2H3PO4.4H2O
Hàm lượng photpho phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu đo ở bước sóng hấp thụ cực đại 650 nm với cuvet có chiều dài 10mm. Dung dịch đối chứng là dung dịch không
b) Dụng cụ và hóa chất:
Dụng cụ:
40 Bình định mức 50ml, 100ml Ống nghiệm
Máy quang phổ kế và cuvet
Hóa chất:
Tất cả các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm này phải đạt độ tinh khiết phân tích
HCl đậm đặc HNO3 đậm đặc Amoni molybdate
Hydroquinone [C6H4(OH)2], pha khi sử dụng Kali dihydrophotphate (KH2PO4)
Sodium sunphic (NaSO3)
c) Tiến hành:
Lấy mẫu thử và chuẩn bị mẫu thử
Nếu mẫu tươi, xử lý sơ bộ, cô cạn, sấy ở 600C, sấy ở 1050C, nghiền lấy mẫu trung bình
Chuẩn bị dung dịch thuốc thử
+Dung dịch 1: dung dịch chuẩn gốc (chứa 100µg photpho /ml). Hòa tan 0,2197g KH2PO4 trong bình định mức 500ml bằng nước cất và định đúng mức 500ml. Chuẩn bị dung dịch chuẩn để lập thang chuẩn (chứa 25µg photpho /ml). Lấy 25ml dung dịch cho vào bình định mức 100ml và định mức bằng nước cất đúng 100ml, ta có dung dịch A
+Dung dịch HCL 10%: 250 ml HCl đậm đặc cộng với 750ml nước cất
+Dung dịch 2: Dung dịch Na2SO3 20%: Cân 10g Na2SO3 hòa vào trong 50ml nước cất, dung dịch chuẩn bị khi sử dụng
+Dung dịch 3: Dung dịch hydroquinone 0,5% :Hòa tan 0,25g
hydroquinone trong một ít nước và 3 giọt H2SO3 thêm vào nước cho đủ 50ml. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng
41
+Dung dịch 4: Thuốc thử Briggs hay dung dịch amoni molybdate 5% : Hòa tan 2,5g amoni molybdate trong 30ml nước cất. Cho 7,5ml H2SO4 đậm đặc vào trong 5ml nước. Để nguội thêm tiếp dung dịch amoni molybdate 5% đã chuẩn bị vào hỗn hợp để nguội thêm nước cho đủ 500ml
+Hỗn hợp thuốc thử: trộn các dung dịch 2,3,4 theo tỷ lệ 1:1:1
Chuẩn bị dung dịch tro phân tích:
Cân chích xác 1-5g mẫu (tùy theo mẫu có photpho nhiều hay ít) Vô cơ mẫu ở 5500
C trong 4 giờ. Để nguội, thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất và thêm 10ml dung dịch HCl 10% và 0,5ml HNO3 đậm đặc
Đun nhẹ trong 5 phút (đến khi thấy bay hơi) để nguội đến nhiệt độ phòng. Rửa sạch chén nung và định mức thể tích dung dịch tro đến 250ml bằng nước cất
Lấy 10ml dung dịch tro cho vào bình hình nón dung tích 100ml định mức cho đủ 100ml ta có dung dịch thứ 2
Lấy 1ml dung dịch 2 cho vào trong ống nghiệm
Thêm 3ml hỗn hợp thuốc thử + nước cất cho đủ 10ml. Trộn đều hỗn hợp, để 30 phút. Đo ở bước sóng 650nm
Tiến hành dựng đồ thị đường chuẩn
Nồng độ photpho (dung dịch 1) dịch thử được ước tính theo phương trình
X (mgP) = (Abs 0,0057)/ 0,0109
Abs : là giá trị mật độ quang của dịch thử đo ở bước sóng 650nm
d) Tính toán kết quả:
Trong đó:
X : số µg P có trong dịch thử
Vdd tro : thể tích dung dịch sau khi tro hóa
6 ( ) * % *100% *10 * ddtro X gP V P V m
42 m: khối lượng mẫu thử (g)
106: hệ số chuyển đổi từ g sang µg V: thể tích thử
Sai số giữa hai lần phân tích song song với độ tin cậy p=0,95 không vượt qua
d=28.(0,05 + 0,031X)%
3.3.5 Xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl 3.3.5.1 Nguyên tắc: 3.3.5.1 Nguyên tắc:
Tất cả Nitơ có trong cơ thể được goi là nitơ tổng số . Nitơ có trong thành phần axit amin của protein là nitơ protein.Nitơ không có thành phần protein như của muối vô cơ, axit nitric, các axit tự do, các peptit ure và các dẫn xuất ure…được gọi là nitơ phi protein
Nitơ tổng số= nitơ protein+ nitơ phi protein
Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao và các chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:
2H2SO4 2H2O + 2SO2+ O2
Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Ví dụ protein bị thủy phân thành axit amin, cacbon,và hydro của axit amin tạo thành CO2 và H2O còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch
2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4
Các nguyên tố P, K, Ca, Mg… chuyển thành dạng oxit: P2O5, K2O, CaO, MgO… đuổi amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH:
(NH4)2SO4 + 2NaOH =Na2SO4+2H2O+2NH3
NH3 bay ra cùng với nước sang bình hứng , bình hứng chứa H3BO3
Sự vô cơ hóa mẫu là sự biến đổi chất đạm dù dưới dạng nào (hữu cơ hoặc vô cơ) thành hợp chất vô cơ là ammonium sunlfate (NH4)SO4 bằng cách đun sôi với H2SO4
43
3.3.5.2 Hóa chất và dụng cụ:
Máy Kjeldahl NaOH 32% HCl 0,25N
Chất xúc tác là hỗn hợp của 60g Se, 75g CuSO, 865g K2SO4
Hợp chất chỉ thị màu:
Hòa tan 0,264g methyl đỏ trong 250ml cồn tuyệt đối Hòa tan 1,28g bromocresol blue trong 50 ml cồn tuyệt đối
Trộn đều hai dung dịch trên, bổ sung 96 ml HCl 0,25N rồi định mức tới 1000ml bằng cồn tuyệt đối
Dung dịch acid boric 4% với chất chỉ thị màu: hòa tan 80g acid boric trong 1000ml nước cất, đun nóng một chút. Để nguội và bổ sung 25 ml hỗn hợp chất chỉ thị màu rồi thêm nước cất đủ 2000ml
3.3.5.3 Tiến hành :
a) Vô cơ hóa nguyên liệu
Cân 1g mẫu khô đã được nghiền nhỏ, 1g chất xúc tác (selenium 60g, K2SO4 865g, CuSO4 75g) cho vào bình Kjeldahl. Sau đó cho thêm 5ml H2SO4 đậm đặc, đun nhẹ hỗn hợp tránh làm sôi trào, chỉ đun mạnh khi dung dịch chuyển sang dạng lỏng. Trong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ, để vô cơ hóa hoàn toàn mẫu. Đun cho tới khi dung dịch trong bình hoàn tòan trắng. Khi thời gian phá hủy mẫu kết thúc khoảng 3-4 giờ, để nguội rồi chuyển tất cả vào bình chưng cất
Để bình Kjeldahl nguội, sau đó chuyển dung dịch sang bình định mức 100ml, dùng nước cất 2 lần tráng lại bình Kjeldahl và dẫn dung dịch đến mức 100ml
b) Cách tiến hành:
Cho dung dịch đã vô cơ hóa ở trên vào bình chưng cất, lắp bộ chưng cất vào bộ chưng cất bán tự động, bơm 30ml NaOH 32% vào bình chưng cất. Khởi