để đánh giá mức độ thủy phân protein
3.3.6.1 Nguyên tắc:
Amino acid hòa tan trong nước có tinh chất nội phân tử, các nhóm amin và cacboxyl trung hòa lẫn nhau. Nhóm –COO- của amino acid bị cản trở bởi nhóm amin nên không thể chuẩn độ trực tiếp được. Trong formaldehyde, nhóm amin của amino acid phản ứng với nhóm aldehyd cho metylen, kết quả của phản ứng là nhóm amin mất tính chất cơ bản của nó, ngược lại nhóm cacboxyl trong amino acid tồn tại dạng metylen không bị cản trở và có thể chuẩn độ
45
Số nhóm cacboxyl tự do bằng nhóm amin liên kết với formaldehyde, khi chuẩn độ nhóm cacboxyl thì xác định được nhóm amin. Vì vậy cho phép định lượng được amino acid có trong dung dịch nghiên cứu
3.3.6.2 Hóa chất: Dung dịch NaOH 0,2N Dung dịch NaOH 0,2N
Dung dịch tymolphtalein 0,1% trong etanol 90%
Dung dịch formaldehyde trung hòa 30%: Lấy 50ml dung dịch formaldehyde 30% cho thêm vài giọt tymolphtalein và chỉnh bằng dung dịch NaOH 0,2N cho đến khi xuất hiện màu xanh lơ (dung dịch A)
3.3.6.3 Dụng cụ:
Bình tam giác Buret chuẩn độ 2 pipet 10ml
3.3.6.4 Tiến hành:
Cho vào bình 15ml dung dịch mẫu,thêm vào bình 10ml dung dịch A và vài giọt tymolphtalein
46
3.3.6.5 Tính kết quả
(V2 – V1).2,82.V.f
X =
V3.g
X: Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu (mg%) V2: số ml NaOH 0,2N để chuẩn độ mẫu thí nghiệm V1: số ml NaOH 0,2N để chuẩn độ mẫu kiểm tra V3: số ml dịch lọc đem đi chuẩn độ
V: số ml dung dịch mẫu
g: lượng mẫu mang đi phân tích
f: hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0,2N
2,82: số mg Nitơ amin tương ứng với 1ml NaOH 0,2N
3.3.7 Xác định protein hòa tan bằng phương pháp Biure 3.3.7.1 Nguyên tắc
Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu2+
tạo thành phức chất màu xanh tím có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 540nm. Cường độ màu phản ứng tỉ lệ với số lượng liên kết peptid trong chuỗi polypeptide
Phương pháp biure được sử dụng đối với các mẫu nghiên cứu khối lượng protein đối lớn
3.3.7.2 Thực hành:
Nguyên liệu và hóa chất
Dung dịch albumine tiêu chuẩn 0,1%
Pha thuốc thử Biure:
NaOH 10% (dung dịch A) - 300ml
CuSO4.5H2O 1,5g + Kalitarat 6g – 800ml ( dung dịch B) Pha theo tỷ lệ 3A : 5B : 2nước cất. Ta được thuốc thử Biuret
47
Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch mẫu nghiên cứu và 4ml thuốc thử biuret, lắc đều để yên 30 phút, ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu tím xanh. So màu ở bước sóng 540nm. Xác định độ quang học của dung dịch nghiên cứu
Lập đồ thị chuẩn, lấy 1 mẫu đối chứng và mẫu vào ống nghiệm từ 1-10 với khối lượng albumine từ 0,1mg-1mg
Lắc đều để yên ống nghiệm trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. So màu dung dịch các ống ở bước sóng 540nm
3.3.7.3 Tính kết quả:
Trị số mật quang ở những ống sau khi trừ đi trị số của mẫu đối chứng. Ta sẽ xây dựng đồ thị biểu diễn sự biến nhiệt mật quang ( ) theo nồng độ protein chuẩn. Tương tự như vậy, trị số mật quang ở mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối chứng, rồi chiếu vào đường cong mẫu để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm
3.3.8 Xác định lượng NH3 bằng chưng cất theo hơi nước
3.3.8.1 Nguyên tắc:
Trong nguyên liệu chứa nitơ thường có một lọai nitơ nằm dưới dạng vô cơ (muối ammonium hay những amin dễ bay hơi). Đây là dạng nitơ tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình khử carboxyl của amino acid), vì thế nếu đứng về khía cạnh dinh dưỡng thì loại nitơ này không cần cho cơ thể, nếu sự hiện diện của nó với hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là mất phẩm chất.
Những loại nitơ này thường có tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với MgO thì những loại nitơ kể trên sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng sẽ được lôi cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa acid. Sau đó đem định lượng acid dư, cho phép chúng ta xác định được lượng nitơ này
2(NH4)+ +Mg(OH)2 2NH3 + 2H2O + Mg2+ 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4
48
3.3.8.2 Dụng cụ và hóa chất:
a) Dụng cụ:
Bộ chưng cất nitơ amoniac và bình cầu 500ml Bình định mức 200ml, 50ml Ống đong 50ml Pipet 5ml, 10ml Bình tam giác Ống chuẩn độ b) Hóa chất:
Magnesic khan (MgO) Dung dịch H2SO4 0,1N Dung dịch NaOH 0,1N Thuốc thử Alizarin
3.3.8.3 Thực hành :
Lấy 50 ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng 20 lần (độ pha loãng tùy theo nguyên liệu ) đổ trong một bình cầu 500ml, thêm vào đó 150 ml nước cất, tiếp tục thêm vào bình cầu 5g MgO. Đậy nút lại ngay để tránh amoniac bay ra. Lắc đều đun sôi và hơi nước được đưa sang bình tam giác chứa sẵn 10ml H2SO4 0,1N và vài giọt thuốc thử Alizarin
Chưng cất trong khoảng 15-20 phút kể từ khi dung dịch trong bình cầu bắt đầu sôi
Đầu ra của chưng cất phải được nhúng chìm trong dung dịch H2SO4 0,1N ở bình tam giác. Sau 15-20 phút chất nitơ amoniac phóng thích sẽ được hấp thu vào dung dịch H2SO4 . Lấy bình tam giác ra, trước khi lấy ra rửa đầu nhúng chìm của bộ chưng cất bằng tia nước của bình xịt
49
3.3.8.4 Cách tính kết quả:
1,7(N-n).100
Hàm lượng NH3 trong 100g mẫu
P.1000 1,7(N-n)
Hoặc trong 1000ml mẫu
P
Trong đó
N: số ml H2SO4 0,1N cho vào bình hứng
n: số ml H2SO4 0,1N dùng để chuẩn độ H2SO4 thừa P: số gam mẫu cần định lượng
CHƯƠNG IV
50
4.1 Kết quả các chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá Basa chưa thủy phân (nguyên liệu ban đầu)
Bảng 4.1 : Chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá Basa
Khoáng 4,277%
Canxi 0,63%
Photpho 1,59%
Đạm 9,835%
Độ ẩm 73,531%
4.2 Thu nhận enzyme trước tinh sạch
Lấy 400 g chế phẩm enzyme thô thêm 1200ml nước cất (tỷ lệ 1:3) khuấy trong 30 phút, lọc thô qua vải, lặp lại quá trình này 3 lần. Gom các dịch lọc mang ly tâm ở tốc độ 6000/ phút trong 15 phút, thu dịch chiết thô, bảo quản dịch chiết thô này trong tủ lạnh ở 40C
Bảng 4.2: Hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết
enzyme thô của nấm mốc Asp.awamori
Hoạt tính enzyme (U/g CP) Hàm lượng protein (mg/g CP) HTR (U/mg)
82,3 37,15 2,215
4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 4.3.1 Ảnh hưởng của pH 4.3.1 Ảnh hưởng của pH
Mỗi loại enzyme có một giới hạn nhất định về pH. Để thu được nhiều protein hòa tan ta phải tạo điều kiện thích hợp nhất cho quá trình thủy phân cơ chất. Chính vì vậy ta cần khảo sát pH tối ưu để thủy phân trong điều kiện ở nhiệt độ (370C)
51
Bảng 4.3: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của pH
pH 6 7 8 9 10
HT (u/g CP) 111,838 147,395 112,632 99,618 81,417
Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme
Nhận xét:
Enzyme rất nhạy với pH của môi trường. pH thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.
Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng enzyme. Mỗi enzyme thích hợp với một vùng pH nhất định.
Từ đồ thị 4.1 cho thấy pH tối ưu cho hoạt động của protease là pH=7( 147,395 U/g CP). Ở pH thấp hay cao hơn pH tối ưu, hoạt tính enzyme đều giảm 111.838 147.395 112.632 99.618 81.417 0 20 40 60 80 100 120 140 160 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease
52
4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Khảo sát nhiệt độ tối ưu từ 30-700C trong cùng điều kiện pH tối ưu ở trên
Bảng 4.4: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của nhiệt độ
0C 30 40 50 60 70
HT (U/g CP) 156,15 213,152 169,098 135,047 130,048
Đồ thị 4.2 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme
Nhận xét:
Nhiệt độ là một yếu tố vật lý có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme, chúng liên quan đế khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất. Thông thường tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt qua giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm 156.15 213.152 169.098 135.047 130.048 0 50 100 150 200 250 30C 40C 50C 60C 70C
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease
53
Enzyme là một protein do vậy enzyme chỉ hoạt động trong một khoảng nhiệt độ nhất định, khoảng nhiệt độ này không làm cho protein bị biến tính, mất hoạt tính sinh học. Khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng enzyme xúc tác tăng. Nếu cứ tiếp tục tăng nhiệt độ đến mức nào đó thì một mặt vận tốc phản ứng tăng theo nhiệt độ thông thường, một mặt ở nhiệt độ cao thì protein của enzyme bắt đầu bị biến tính mạnh mẽ, hoạt tính xúc tác sẽ giảm nhanh, lúc này vận tốc phản ứng cũng tiến dần đến 0. Do vậy trong trường hợp này khi hoạt độ của enzyme đạt giá trị cao nhất thì lúc này nhiệt độ đạt giá trị tối ưu
Từ đồ thị 4.2 cho thấy enzyme protease hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 400C (213,152U/g CP). Vượt quá nhiệt độ này hoạt tính enzyme giảm và đặc biệt giảm mạnh ở 700C do sự biến tính protein
4.3.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt
Bảng 4.5: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của độ bền nhiệt
Độ bền nhiệt ( phút) Hoạt tính(U/g CP) Phần trăm theo hoạt tính (%)
0 phút 237,234 100 10 phút 205,249 86,52 20 phút 191,932 80,9 30 phút 174,064 73,37 40 phút 163,741 69,02 50 phút 153,642 64,76 60 phút 150,798 63,57
54
Đồ thị 4.3 : Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme
Nhận xét:
Trong quá trính thủy phân thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Trong đó thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme cắt các liên kết trong cơ chất. Khi cơ chất cần thủy phân đã hết thì quá trình thủy phân kết thúc.
Thời gian thủy phân phải thích hợp để bảo đảm hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng tốt
Nhìn vào đồ thị 4.3 ta có thể thấy thời gian thủy phân (độ bền nhiệt) ở 0 phút có hoạt tính cao hơn những mốc thời gian khác. Những mốc thời gian sau thì có hoạt tính không cao bằng mốc 0 phút
Khi thủy phân ở độ bền nhiệt 10 phút thì hoạt tính giảm 13,86 % so với khi thủy phân ở độ bền nhiệt 0 phút
Nếu cho thời gian thủy phân kéo dài thêm 20 phút thì hoạt tính giảm 19,1% so với độ bền nhiệt 0 phút 0 50 100 150 200 250 0 phút 10 phút 20 phút 30 phút 40 phút 50 phút 60 phút
Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme protease
55
Giảm 26,63% hoạt tính ở độ bền nhiệt 30 phút và giảm 30,98% hoạt tính so với thủy phân với độ bền nhiệt 0 phút
Nếu cứ kéo dài thời gian thủy phân thì hoạt tính enzyme giảm 35,24% ở độ bền nhiệt 50 phút và giảm 36,43% ở độ bền nhiệt 60 phút so với độ bền nhiệt 0 phút
Vì thế khi thủy phân ta chọn độ bền nhiệt 0 phút
4.4 Kết quả tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel: 4.4.1 Kết quả tinh sạch enzyme của hãng Amano 4.4.1 Kết quả tinh sạch enzyme của hãng Amano
Đồ thị 4.4 : Sắc ký của hãng Amano
Nhìn vào đồ thị ta thấy enzyme của hãng Amano có 3 peak Peak 1 từ ống 15-ống 20
Peak 2 từ ống 22-ống 28 Peak 3 từ ống 29-ống 52
56
Theo đồ thị thì ta nhận thấy rằng peak 3 khá cao nên có thể chứa protease mà ta quan tâm
Bảng 4.6: Tổng hoạt tính và tỏng hàm lượng enzyme của hãng Amano
Enzyme hãng Amano
Hoạt tính (U) Hàm lượng (mg) Hoạt tính riêng (U/mg) 58,87 8,977 6,55
4.4.1 Kết quả tinh sạch enzyme của mẫu enzyme
Đồ thị 4.5 :Đồ thị sắc ký lọc gel Qua sắc kí ta thu được 3 peak Peak 1: từ ống 15- ống 21 Peak 2: từ ống 21- ống 25 Peak 3: từ ống 30- ống 52
57
Xác định hàm lượng và hoạt tính cho từng peak. Tuy nhiên hoạt tính và hàm lượng protein của peak 3 là cao nhất nên có thể dự đoán peak 3 có chứa protease quan tâm
Bảng 4.7: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính sau khi tinh sạch
Hoạt tính enzyme (U/g CP) Hàm lượng protein (mg/g CP) HTR (U/mg)
56,76 9,62 5,9
Nhận xét:
Sau khi tinh sạch enzyme qua sắc ký lọc gel ta có thể nhận thấy hàm lượng protein khi sau khi khi tinh sạch thấp hơn hàm lượng protein trước khi tinh sạch. Hoạt tính của enzyme sau khi tinh sạch cũng giảm so với mẫu enzyme trước tinh sạch.
Kết quả như vậy là do trong protein của ta có chứa protein tạp nên hàm lượng sau tinh sạch thấp hơn hàm lượng trước tinh sạch. Sau khi tinh sạch thì protein tạp bị loại bỏ, nên hoạt tính riêng của enzyme sau tinh sạch tăng hơn nhiều so với hoạt tính riêng của enzyme trước tinh sạch
Bảng 4.8: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính của enzyme
Mẫu enzyme ⅀ Hoạt tính (U) ⅀ Hàm lượng (mg) Hoạt tính riêng (U/mg) Độ tinh sạch (lần) Hiệu suất (%) Enzyme thô 82,3 37,15 2,215 1 100 Enzyme sau tinh sạch 56,76 9,62 5,9 2,66 68,96 Enzyme hãng Amano 58,87 8,977 6,55 2,95 71,53
58
Đồ thị 4.6 : Độ tinh sạch trước và sau sắc ký
Nhận xét:
Sau qui trình sắc ký lọc gel độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch tăng lên 2,66 lần so với enzyme trước tinh sạch
Enzyme của hãng Amano tăng lên 2,95 lần so với enzyme thô
Enzyme của hãng Amano tăng 1,11 lần so với enzyme sau khi tinh sạch
1.00 2.66 2.95 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50
Enzyme thô Enzyme sau sắc ký Enzyme hãng Amano
Độ tinh sạch trước và sau sắc ký
59
4.5 Kết quả tinh sạch enzyme bằng phương pháp điện di:
Hình 4.1: Kết quả chạy điện di của mẫu protein Giếng 1: Thang chuẩn
Giếng 2: Peak 2 Giếng 3: Peak 3 Giếng 4: Enzyme thô
Giếng 5: Enzyme của hãng Amano
Vì hoạt tính peak 1 quá thấp nên ta không xác định trọng lượng phân tử của protein enzyme của peak 1. Ta chỉ quan tâm tới peak 2 và peak 3
60
Bảng 4.9:Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein trong thang chuẩn
Rf Trọng lượng phân tử (Dalton) Log ( trọng lượng phân tử)
0,147 150000 5,176 0,258 100000 5,00 0,276 75000 4,875 0,345 50000 4,699 0,414 35000 4,544 0,552 25000 4,398 0,621 15000 4,176
Đồ thị 4.7: Sự tương quan giữa log của trọng lượng phân tử và giá trị Rf Phương trình tuyến tính thu được
Y = -2.0597x + 5.4641
Trong đó: y=log (trọng lượng phân tử protein)
X=Rf Tỷ số khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol blue cuối cùng tính từ gel phân tích
0.621, 4.176 y = -2.0597x + 5.4641 R² = 0.9756 0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 lo g M w Rf
61
Từ phương trình tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lượng phân tử của protein
Trọng lượng phân tử protein = 10y
Giá trị Rf từng vạch của mỗi ba peak và trong mẫu thô
Bảng 4.10: Giá trị Rf từng vạch của của mỗi peak trong mẫu
Vạch Peak 2 Peak 3 Mẫu thô Hãng Amano
1 0,155 0,158 0,138 0,138
2 0,224 0,379 0,19 0,259
3 0,259 Không có 0,224 Không có
4 Không có Không có 0,276 Không có
5 Không có Không có 0,448 Không có
Bảng 4.11: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Hãng Amano
Thứ tự vạch X=Rf Y Trọng lượng phân tử protein (Daltons) Vạch 1 0,139 5,178 150660
Vạch 2 0,259 4,931 85310
Dựa vào bảng 4.10 ta thấy trọng lượng phân tử protein của hãng Amano nằm trong khoảng 85310-150660 Daltons
Bảng 4.12: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Peak 2
Thứ tự vạch X=Rf Y Trọng lượng phân tử protein (Daltons) Vạch 1 0,155 5,145 139636
Vạch 2 0,224 5,003 100693 Vạch 3 0,259 4,931 85310
62
Bảng 4.13: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Peak 3
Thứ tự vạch X=Rf Y Trọng lượng phân tử protein (Daltons) Vạch 1 0,158 5,139 137720
Vạch 2 0,397 4,646 44258
Dựa vào các bảng trọng lượng phân tử của từng peak ta có thể kết luận được trọng lượng phân tử protein nằm trong khoảng 44258 – 139636 Daltons
Bảng 4.14: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở mẫu thô