THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER

THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập...

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

TP HỒ CHÍ MINH – 6/2009

MỤC LỤC

I TỔNG QUAN………2

I.1 Nguyên liệu………2

I.2 Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger……… 2

I.3 Giới thiệu về enzyme pectinase……….3

 Khái niệm……… 3

 Phân loại……….3

 Đặc điểm……….3

 Cơ chế tác động……… 4

II THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER ……… 6

II.1 Nguồn thu nhận enzyme pectinase……….6

II.2 Sơ đồ quy trình……… 11

II.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme pectinase từ nấm mốc Aspergillus niger……….14

III ỨNG DỤNG……….15

III.1 Làm trong các loại nước ép trái cây……….17

III.2 Ứng dụng trong sản xuất rượu vang……….18

III.3 Ứng dụng trong sản xuất cà phê……… 20

III.4 Một số ứng dụng khác ……… 20

I TỔNG QUAN

I.1 Nguyên liệu:

Nguyên liệu chính là nấm mốc Aspergillus

niger Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi sinh

vật để thu nhận enzyme pectinase thường là

cám gạo, hay cám mì bã củ cải, khoai tây, cà

rốt,vỏ bưởi hoặc thóc mầm… Nguồn dinh

dưỡng bổ sung thường là các muối amonium,

phosphric…

I.2 Giới thiệu vê nấm mốc Aspergillus niger

Đại thể của Aspergillus niger Vi thể của Aspergillus niger

Aspergillus niger thuộc giống Aspergillus, giống này rất đặc biệt do

chúng có hệ bào tử đính (conidiophore) Bào tử đính phát triển từ thành tế bào rất dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc (foot cell) Nó tạo thành

sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là

túi (vesicle) Xung quanh túi là một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tư hay thể bình ( sterigmata) Từ bộ cuống đính bào tử ngoài cùng, bào tử được sinh ra gọi là bào tử đính (conidia) Giống nấm này phát

triển rất nhiều trong các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới

Nhóm Aspergillus niger gồm khoảng 10 loài Chúng có màu đen khi

quan sát bằng mắt thường do chúng tạo bào tử đính màu đen, nhưng lại có màu nâu khi quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại thấp Đôi khi chúng sinh ra các giọt lỏng màu vàng sáng trên bề mặt khuẩn lạc chúng có hai bộ cuống đính bào tử và tạo bào tử đính màu nâu, hơi đen và có gai Túi và sợi cuống thường có màu nâu bóng Nhóm này không tạo mycotoxin, nhưng một số loài của nhóm này có khả năng gây bệnh

I.3 Giới thiệu về enzyme pectinase

 Khái niệm : Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân huỷ

các polyme pectin Dưới tác dụng của enzyme pectinase, pectin bị phân huỷ tạo thành các sản phẩm như: acid galacturonic, galactose, arabinose, metanol…

 Phân loại:

- Dựa vào tính đặc hiệu, cơ chế tác dụng kiểu phản ứng, pH tối ưu của enzyme Năm 1966, Koller và Neukom phân loại chia pectinase thành hai nhóm chính: hydrolase và transeliminase Cả hai nhóm này đều có đặc điểm chung là gỉam độ nhớt của dung dịch pectin và làm giảm khối lượng phân tử của các sản phẩm tạo thành

- Dựa vào cơ chế tác dụng của chúng gồm các loại như sau:

pectinesterase (PE ), Polymethylgalacturonic ( PMG), polygalacturonase

(PG ), Pectate lyase ( PEL) Ngoài ra còn có: pectin-transelimiase (còn gọi

là poly - α - 1,4 galacturonite- methylesteglucanoliase) là enzyme tác dụng trên pectin và trên pectinic acid Polygalacturonate- transelimiase ( còn gọi

là poly - α - 1,4 D- galacturonite- glucanoliase) là enzyme tác động trên pectic acid và pectinic acid Pectin lyase (PNL) xúc tác sự phân cách các đơn vị galacturonate đã bị ester hoá Tất cả các PNL đều là endo – enzyme

 Đặc điểm: Enzyme thuỷ phân pectinase là sản phẩm trong quá

trình sống của nấm mốc Aspergillus niger và một số nấm mốc khác Người

ta cấy các chủng nấm mốc này vào trong các môi trường khác nhau, sau đó

đem sấy khô, nghiền thành các sản phẩm khô Từ qúa trình sống của chủng nấm mốc này, người ta không những chỉ thu nhận được enzyme thuỷ phân pectin mà còn thu được nhiều enzyme khác như: cellulase, protease…

Các chế phẩm đều có một phức hệ enzyme pectinase như nhau, chỉ khác ở mức độ hoạt động và tỉ lệ của các enzyme Căn cứ vào đặc điểm này mà ta có thể mà có hướng sử dụng các chế phẩm khác nhau, chẳng hạn chế phẩm có hoạt độ PE và endo – PMG cao thì dùng để xử lý các nguyên liệu giàu pectin

 Cơ chế tác động:

Pectinesterase ( PE ): Enzyme này xúc tác sự thuỷ phân liên kết

ester phức tạp của pectin và protopectin, sản phẩm tạo thành là rượu methylic và acid pectinic hay acid polygalalacturonic Người ta nhận thấy rằng PE chỉ phân cách liên kết ester giữa các nhóm metoxyl và _COOH tự do

PE tách gốc methyl khỏi phân tử pectin làm lộ ra các nhóm carboxyl rất linh động, dễ kết hợp với các ion kim loại như Ca2+ để tạo thành các muối không hoà tan, kết lắng lại và có thể tách ra dễ dàng

PE của nấm mốc sẽ thuỷ phân trước tiên là nhóm methylester nằm giữa hai nhóm carboxyl tự do Và enzyme sẽ thuỷ phân lần lượt các liên kết ester dọc theo phân tử pectin Và PE của nấm cũng sẽ thuỷ phân pectin và các ester của acid polygalacturonic sâu sắc hơn PE của thực vật hoạt độ của PE phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hoá của pectin và tỉ lệ thuận với mức độ

ester hoá Chẳng hạn đối với tác dụng của PE từ nấm mốc Asp Niger cần

thiết có pectin ester hoá ở mức độ cao từ 70 % trở lên

pH tối ưu của PE từ nấm mốc là 4.5 -5.5, còn của chế phẩm đã loại bỏ enzymepolygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2.0 – 6.5 Trái lại, pH tối ưu của PE từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6.0 – 8.0

Nhiệt độ tối ưu của PE từ nấm mốc là 40 – 45 0C Từ 55- 62 0C thì vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của PE từ thực vật thượng đẳng cao hơn:

từ 55 – 60 0C

Các ion kim loại đặc biệt là Na+ và Ca2+ và các muối clorua của chúng

sẽ hoạt hoá PE từ nấm mốc Asp.niger Trái lại , các cation hoá trị 3 và 4

( thuỷ phân nitrat, FeCl2, Al2(SO4)3 ) sẽ kìm hãm tác dụng của PE

Ảnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme PE có thể có liên quan đến tương tác của nó với cơ chất Polygalacturonic acid là một chất ức chế cạnh tranh trong phản ứng thuỷ phân nhờ sự xúc tác của PE Sự liên kết của các ion kim loại và các nhóm carboxylate trong trường hợp này có khuynh trung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme Tuy nhiên lượng dư các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kim loại bị bao vây bởi các nhóm carboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cần thiết cho phản ứng thuỷ phân xảy ra

Polymethylgalacturonase ( PMG): Là enzyme tác động trên acid

polygalactyronic đã được metoxyl hoá ( tức là pectin) Enzyme này có tên

hệ thống là poly- α - 1,4 galacturonic – methylesterglucanohydrolase ( E.C.3.2.1.41), lại được chia thành hai nhóm nhỏ:

 Endo – glucosidase – polymethylgalacturonase kiểu

1 (Endo PMG I) : Là enzyme dịch hoá, pectin có mức độ metoxyl càng cao

thì bị thuỷ phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả cao Trong dung dịch khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này

thường bị giảm Enzyme này phổ biến ở một số nấm mốc như: Asp.niger,

glucoside ở đầu mạch nằm giữa hai gốc acid galacturonic có nhóm _COOCH3.

 Polygalacturonase ( PG) : Là enzyme tác dụng trên acid pectinic hoặc pectic PG lại được chia thành hai nhóm nhỏ:

 Endo – glocosidase – polygalacturonase kiểu II (Endo – PG II): Là enzyme dịch hoá, enzyme này có thể thuỷ phân acid pectinic hay acid

pectic và chỉ tác dụng khi có mặt nhóm _COOH tự do

Hoạt độ của Endo-PG II sẽ tăng lên nhiều khi cơ chất được xử lý sơ bộ bằng pectinesterase Đa số vi khuẩn và nấm mốc là những vi sinh vật tổng hợp được enzyme này

 Exo – glucosidase – polygalacturonase kiểu IV ( IV): Enzyme này thường có ái lực mạnh đối với các liên kết glucoside ở cuối

Exo-PG-mạch phân tử acid pectinic hay acid pectic nhưng bên cạnh đó không có nhóm methyl

Có lẽ để tạo được phức enzyme - cơ chất thì trong phân tử cơ chất phải

có nhóm carboxyl tự do liền kề với liên kết bị đứt

 Pectate lyase ( PEL): Năm 1960, P Abershim lần đầu tiên đưa ra

thông báo về phân huỷ phân tử pectin không bằng con đường thuỷ phân Enzyme tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase Enzyme này xúc tác phá vỡ mối liên kết α - 1,4 glucoside, tiến tới làm mất hoạt tính nguyên tử hydro ở C5, tạo thành mối liên kết đôi giữa C4 và C5

Dựa trên cơ chế tác dụng của pectate lyase, người ta chia nó thành hai nhóm:

 Endo – pectatelyase: Tham gia thuỷ phân phân tử polygalacturonic

ở chỗ khác nhau của dãy tạo nên acid galacturonic

 Exo – pectatelyase: Tham gia phân huỷ thành phần mạch vòng của

acid digalacturonic

Pectate lyase (PEL ) là enzyme vi sinh vật ngoại bào

II THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC

ASPERGILLUS NIGER

II.1 Nguồn thu nhận enzyme pectinase

Thực vật: Enzyme pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong

chanh, cà chua, trong một số quả khác Thường là có nhiều enzyme pectinesterase (PE )

- Đặc điểm của pectinesterase thực vật: Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm Các cation kim loại

ở nồng độ thấp, như Ca2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình thành các khối pectin chứa các nhóm carboxylate dọc theo mạch pectin

Vi sinh vật: Nhiều vi sinh vật trong đất, trong nước có khả năng phân

giải pectin Chúng có ý nghĩa quan trọng không những đối với vòng tuần hoàn carbon trong tự nhiên mà còn đối với một số ngành sản xuất công nghiệp (ngâm đay, gai, làm bia, làm giấy…) Một số vi sinh vật có khả năng

phân giải pectin mạnh mẽ: Aspergillus ficcum, Aspergillus niger,

Aspergillus awamori, Clostridium roserum…

- Đặc điểm của E pectinase ở vi sinh vật: Tất cả các vi sinh vật để thu nhận enzyme pectinase đều là hiếu khí Sự phân bố các kiểu enzyme pectinase ở vi sinh vật không giống nhau: có cơ thể chỉ tạo được một enzyme song đa số cơ thể khác lại tạo ra được một phức hệ enzyme pectinase khác nhau, tuỳ theo loài

Ví dụ: Sac Fragilis chỉ tạo ra duy nhất một loại enzyme phân giải pectin là endopolygalaturonase Còn ở nấm mốc Aspergillus niger thường

tạo được một phức hệ enzyme pectinase khác nhau

Các enzyme pectinase ở vi sinh vật có thể là enzyme cảm ứng hoặc enzyme bản thể Ngoài ra enzyme pectinase ở vi sinh vật còn khác nhau ở một số tính chất

Aspergillus awamori Clostridium

Cơ chất pectin:

• Nguồn gốc và cấu tạo:

Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid galacturonic qua các liên kết 1,4- glucoside Tuỳ thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80.000 – 200.000 Da Pectin không hoà tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác mà hoà tan trong nước, amoniac, dung dịch kiềm, carbonateNatri và trong glycerin nóng Độ hoà tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hoá trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm

Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khác nhau, trong đó acid pectinic acid là thành phần chủ yếu các pectin tự nhiên định vị trong thành tế bào có thể liên kết với cấu trúc polysaccharide

và protein để tạo thành các protopectin không tan Có thể phân huỷ để cho

pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid Vì thế, các pectin tan thu nhận được là kết quả của sự phân huỷ phân tử pectin không tan và chúng không đồng dạng với nhau.

Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là chỉ số methoxyl

“MI” biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl –OCH3 có trong phân tử pectin và chỉ số este hóa “DE” thể hiện mức độ este hóa của các phân

tử acid galactoronic trong phân tử pectin

Dựa trên mức độ methoxy hóa và este hóa, trong thương mại chia pectin thành 2 loại: pectin có độ methoxyl hóa cao và pectin có độ methoxyl hóa thấp

Pectin methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin – HMP): DE >50 % hay MI > 7% Chất này có thể làm tăng độ nhớt cho sản phẩm Muốn tạo đông cần phải có điều kiện pH = 3,1 – 3,4 và nồng độ đường trên 60 %

Pectin methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin – LMP): DE < 50 % hay MI < 7% Được sản xuất bằng cách giảm nhóm methoxyl trong phân tử pectin Pectin methoxy thấp có thể tạo đông trong môi trường không có đường Chúng thường được dùng làm màng bao bọc các sản phẩm.

Trong quá trình bảo quản có thể bị tách nước hoặc lão hóa Quá trình tạo đông phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nguồn pectin, mức độ methoxy hóa càng cao thì khả năng tạo đông càng cao Khi sử dụng cần phải hòa tan pectin vào nước, khi pectin hút đủ nước thì mới sử dụng ở công đoạn cuối chế biến

Các pectin đều là những chất keo háo nước nên có khả năng hydrat hóa cao nhờ sự gắn các phân tử nước vào nhóm hydroxyl của chuỗi polymethyl galacturonic Ngoài ra, trong phân tử pectin có mang điện tích âm nên chúng

có khả năng đẩy lẫn nhau có khả năng làm giãn mạch và làm tăng độ nhớt của dung dịch Khi làm giảm độ tích điện và hydrat hóa sẽ làm cho sợi pectin xích lại gần nhau và tương tác với nhau tạo nên một mạng lưới ba chiều rắn chứa pha lỏng ở bên trong

• Ứng dụng:

Pectin là chất tạo gel quan trọng nhất được sử dụng để tạo ra cấu trúc gel cho thực phẩm Khả năng tạo gel của nó được sử dụng trong những thực phẩm cần có sự ổn định của nhiều pha Tác dụng tạo gel của pectin được sử dụng chủ yếu trong các sản phẩm mứt trái cây và mứt đông

Tác dụng của pectin là tạo ra cấu trúc mứt đông và mứt trái cây không

bị thay đổi trong quá trình vận chuyển, tạo ra mùi vị thơm ngon cho sản phẩm

và giảm sự phá vở cấu trúc Trong một số trường hợp, pectin còn được sử dụng với carageenan để tăng hiệu quả tạo gel

II.2 Sơ đồ quy trình:

Nguyên liệu

Xử lý nguyên liệu

Aspergillus niger

( pHopt = 4.5 )( Topt = 50 0C )

( Tỉ lệ: 5 nước : 1 khối lượng canh trường )

Ly tâm

( Độ ẩm 50-60%,thông khí 90-100%, t 0 30-32 0 C)

Nhân giống: giống Asp Niger sẽ được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

ở độ ẩm 50- 60%, độ thông khí 90- 100% và nhiệt độ 30- 32 0C

* Cấy giống: sau khi xử lý nguyên liệu, ta bổ sung lượng nước phù hợp

để đạt độ ẩm 55 % Ta tiến hành hấp khử trùng ở 1atm, 121 0C trong 15 phút, sau đó để ở nhiệt độ phòng và tiến hành cấy giống vào

*Nghiền:

Chế phẩm enzyme thô từ canh trường nuôi cấy theo phương pháp bề mặt được nghiền mịn trong máy nghiền bi Nếu không có máy nghiền bi có thể dã bằng cối, chày sứ với sự trợ giúp của cát thạch anh hoặc bột thuỷ tinh Cát thạch anh hoặc bột thuỷ tinh được rửa sạch và sấy khô trước khi sử dụng, cho vào giã cùng với canh trường nuôi cấy bề mặt Cát hay bột thuỷ tinh làm tăng khả năng phá vỡ tế bào của vi sinh vật mà không làm thay dổi bản chất enzyme nên thường sử dụng trong các thí nghiệm thu nhận enzyme từ canh trường nấm sợi

* Trích ly:

Thực hiện bằng dung môi thích hợp Đa số enzyme thuỷ phân tan tốt trong nước, nên nước là dung môi tốt nhất để chiết rút enzyme Những tế bào nấm mốc đã trưởng thành quá trình trao dổi chất gần như ngừng hẳn, độ thẩm thấu của hệ sợi tăng, enzyme dễ tiết ra môi trường và dễ hoà tan vào nước Theo phương pháp khuếch tán bằng nước hiệu suất chiết có thể đạt 90-95% Trong nước chiết thường chứa một số lớn các chất phân tử thấp do sự hoà tan các sản phẩm thuỷ phân của một tinh bột, cellulose, pectin trong quá trình sinh trưởng của nấm mốc

Nhiệt độ nước thường dùng 25-28 0C Sự hiện diện của một vài chất sát trùng như formalin có thể ngăn ngừa hiện tượng nhiễm trùng Dung dịch sau khi chiết phải được làm lạnh ngay xuống 10-12 0C để tránh nhiễm trùng và bảo toàn hoạt tính enzyme

Sau khi nghiền môi trường nuôi cấy bề mặt, cho vào đó lượng nước gấp

5 lần khối lượng canh trường trên để hoà tan protein – enzyme từ khối canh