THU NHẬN ENZYME AMYLASE TỪ VI SINH VẬT

THU NHẬN ENZYME AMYLASE TỪ VI SINH VẬT tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả cá...

THU NHẬN ENZYME AMYLASE 1) Nguồn enzyme amylase từ vi sinh vật: Trong thiên nhiên enzyme có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và vi sinh vật. Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài vi sinh vật mới là những đối tựợng có thể dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase, do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định. Những chủng VSV tạo nhiều amylase thường đựơc phn lập từ cc nguồn tự nhin, bởi vì cc lồi khc nhau v thậm chí cc chủng VSV khc nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ enzyme khc nhau. Để thu nhận amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus (Asp. Oryzae, Asp. Niger, Asp. Usamii, Asp. Awamo-ri, Asp. Batatae) v Rhizopus (Rh.Delemar, Rh. Lonnesis, Rh. Neveus, Rh. Japonicum, Rh. Fokinesis, Rh. Lopninen-sis) v một số lồi của Neurospora v Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ khơng những chỉ – amylase m cả glucoamylase. Nấm men v giả nấm men thuộc cc giống Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces cũng tạo amylas .Đặc biệt người ta đ tuyển chọn được chủng Endomycopsis specise 20-9 có khả năng tổng hợp mạnh mẽ glucoamylase, – amylase, glucoziltrans-ferase v invertase. Nhiều vi khuẩn cũng có khả năng tạo lượng lớn enzyme amylase như: Bac. Polymyxa, Phytomonas destructans, Bact.cassavanum, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas saccharophila… Các vi khuẩn ưa nhiệt (ưa ấm) có khả năng tăng trửơng nhanh (4-6lần vi khuẩn ưa ẩm) như: Bac. Diastaticus, Bac. Stearothermo-philus, Bac. Coagulans, Bac. Circulans, đặt biệt là Bac. Circulans được phân lập từ đất sinh trưởng tốt ở 65-70 o c v tạo amylase mạnh nhất ở 50 o C. và phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm VSV khác.Trong số vi khuẩn ưa ẩm tạo amylase mạnh, thì Bac. Subtilis đựơc nghiên cứu chu đáo hơn cả và được sử dụng rộng ri nhất. Nhiệt độ sinh trửơng tối thích của Bac. Subtilis là ở 37 o C. Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên, cũng có một số, chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vulgaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ – amylase hoạt động ở 65 o C cng với proteinase v cc enzyme khc. Trong công nghiệp, các biến chủng tạo đựơc bằng cách gây đột biến nhờ tác động của tác nhân lý hĩa hay hĩa học hoặc tc nhn phối hợp của hai loại tc nhân trên là những chủng hoạt động rất có khả năng sinh tổng hợp nhiều amylase. Đáng chú ý l những biến chủng của nấm mốc: Asp. Niger S, Asp.niger S-4,Asp.niger S-4-10; Asp. Usamii 3758-45 , Asp. Batatae 217-61; Asp. Awamori 78-2 ; Asp. Oryzase 3- 9-15 , Asp. Oryze N-475, Asp. Niger URRL-333 v Asp. Niger NRRR-337. Phức hệ amylase từ các nguồn khác nhau đều có đặc điểm riêng. Đối với nấm sợi Aspergillus, trong canh trường của chúng thường có các enzyme sau: – amylase, glucoamylase, glucoziltransferase. Đa số các chủng của loài Asp. Oryzae tạo nhiều – amylasesong tạo rất ít glucoziltransferase, ngoài amylase canh trường bề mặt của Asp. Orzyae cịn protease acid v trung tính. Trong canh trường các loài nấm sợi đen (Asp. Awamori, Asp. Niger) hàm lượng glucoamylase kh cao, hoạt lực transglucozilase kh mạnh, song lại cĩ ít – amylase. Ngồi cc enzyme trn Asp. Awamori cịn tạo protease acid v hemicellulose . Rhizopus v Endomyces khơng tạo transglucozilase, – amylase cĩ trong mọi chế phẩm trừ cc chế phẩm từ Endomyces. Trong các canh trường vi khuẩn thường không tạo thành một phức hệ enzyme amylase như là ở nấm sợi mà chỉ có một – amylase. Hoạt lực protease của canh trường vi khuẩn cũng rất cao. 2) Đặt tính và cơ chế tác dụng của amylase: Amylase l hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Cc enzyme ny thuộc nhĩm enzym thủy phn, xúc tác sự phân giải các liên kết nội phân tử trong polysaccharide với sự tham gia của nước. R.R’ + H - OH RH + R’OH a) – amylase : ( – 1,4 glucan – 4 glucanhidrolase, 3.2.1.1) Về cơ chế tác dụng, người ta thấy rằng – amylase của nấm mốc cắt đứt được tất cả các liên kết – 1,4-glucoside trong mạch polysaccharide, trừ điểm phân nhánh trong amylopectin, để tạo thành maltose và dextrin giới hạn. Như vậy chúng có khả năng chuyển 80-82% tinh bột thành maltose. – amylase khơng chỉ thủy phn hồ tinh bột m cịn thủy phn cả hạt tinh bột nguyn lnh, song tốc độ rất chậm. Khi thủy phn tinh bột – amylase thường xảy ra 2 giai đoạn:  giai đoạn đầu: chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.  Giai đoạn hai: thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa tạo thành. Tính chất đực trưng của nó là khả năng dextrin hóa cao do đó làm cho phản ứng màu của tinh bột với iod bị biến đổi nhanh chóng. Vì vậy người ta dựa vào tính chất này để xác định hoạt độ của enzyme. pH tối ưu của –amylase của nấm mốc l 4,7-4,9. b) – amylase ( - 1,4 glucan – mantohidrolase 3.2.1.2) β - amylase xc tc sự thủy phn cc lin kết – 1,4glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccaric đồng loại,phân cắt tuần tự gốc maltose một từ đầu không khử của mạch. Maltose tạo thành có cấu hình , vì thế amylase ny được gọi là – amylase. Tc dụng của – amylase lên tinh bột có thể biểu diễn lên sơ đồ sau: Tinh bột 54 – 58% maltose + 42 – 46% – dextrin (Glucogen) Nếu cho cả – amylase v – amylase cùng đồng thời tác dụng lên tinh bột thì tinh bột bị thủy phn tới 95%. c) Glucoamylase ( - 1,4 glucan – mantohidrolase 3.2.1.3) hay – amylase Glucoamylase thủy phn lin kết - 1,4 glucan trong polysaccharide, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch. Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân đ lin kết - 1,4 lẫn - 1,6 glucan. Glucoamylase l enzym ngoại phân (exoenzym) nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose. Khi thủy phân tinh bột cùng với glucose cịn cĩ thể tạo thnh cc - oligosaccharide. Ngồi cc lin kết – 1,4 v – 1,6 glucoside, glucoamylase cịn cĩ khả năng thủy phân các lin kết – 1,2 v – 1,3 glucoside nửa. Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose v maltose tới glucose. Các cơ chất cấu tạo phân nhánh ( amylopectin, glucogen, - dextrin) bị glucoamylase tấn công với vận tốc khá lớn. So với tốc độ thủy phân các cơ chất khác nhau bằng glucoamylase tinh thể cho thấy rằng các polysaccharide phân tử lớn hơn thì bị thủy phn nhanh hơn là các phân tử thấp. Sơ đồ thủy phân glucid bởi enzym glucoamylase như sau: Glucoamlase kiểu Tinh bột hay oligosacarit 100% glucose Glucoamylase kiểu Tinh bột hay oligosacarit 80-85% glucose + oligosacarit d. Oligo-1,6-glucosilase hay dextrinnase tới hạn (dextrin-6-glucanhydrolase, 3.2.1.10) Enzyme ny thủy phn cc loại lin kết -1,6- glucoside trong izomaltose, panose và các dextrin tới hạn và có thể chuyển hóa các cơ chất này đến các đường lên men được. Các loài nấm sợi Asp. Awamori, Asp. Oryzae, Asp. Usamii sinh tổng hợp enzyme này mạnh hơn cả. Ngoài các enzyme được kể trên, trong họ hàng cuả amylase cịn cĩ cc enzyme đồng loại nư. Dưới đây sẽ điểm qua một vài enzyme đó. e. Pullulanase Ở vi khuẩn Aerobacter aerogenes người ta tìm thấy cc enzyme cĩ khả năng thủy phân lin kết -1,6 glucoside trong các polyose và oligosaccharide kiểu tinh bột và glucogen. Cơ chất đặc thù enzyme này là pullulan – một polysaccharide được tách ra từ giả nấm men Aureobasidium punllana sym. Pullulasia pullulans. Vì vậy m enzyme ny được gọi là pullulanase. Phân tử lượng của nó là 145.000. f. -glucosidase hay maltase (-D,glucoside-glucohydrolase, 3.2.1.20) Nhiều loại nấm sợi sản sinh enzyme này. Giống như glucoamylase, nó tác dụng được trên maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột. Nĩ cịn cĩ hoạt tính glucosyltransferase, tức l cĩ khả năng chuyển các gốc glucosyl sang đường và rượu. Khi nghiên cứu cặn kẽ về tính chất của maltose tách từ canh trường bề mặt của Asp. Oryzae cho biết rằng maltose và glucozyltransferase là một enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết -1,4, trong các glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu. g. Transglucosyldase Ở nhiều loại nấm sợi Aspergillus, transglucosyldase luôn luôn tương tác với glucoamylase. Nó có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phn. Vì thế sự cĩ mặt của nĩ trong dung dịch thường gây nên những nhầm lẫn về sự tồn tại của glucoamylase. Transglucosyldase thực hiện việc chuyển các gốc glucosyl sang các nhóm mono, di- và oligosaccharide, xúc tc tạo thnh cc lin kết -1,4 v -1,6 glucoside. Pazur (1961) đ tch được enzyme này từ Asp. niger bằng phương pháp sắc ký hấp thụ trn DEAE-cellulose v cho biết cơ chế tác dụng của nó. 3. Hoạt lực của cc enzyme amylase Khi sử dụng bất kì 1 chế phẩm enzyme no cũng cần biết r hoạt lực xua1c tc của nĩ. Cc chế phẩm cĩ hoạt tính phn giải tinh bột thường chứa 1 loại enzyme amylase. Vì vậy hoạt lực tổng hợp của chng phản nh tc dụng tất cả cc amylase cĩ trong chế phẩm. -amylase dễ dng thủy phn tinh bột thnh dextrin khơng cho mu với iodine, cịn glucoamylase lại phn giải tinh bột tới glucose v lm thay đổi màu với iodine chậm, vì lẽ trong dung dịch luơn cĩ một lượng nhỏ dextrin phân tử lớn. Do vậy mà người ta đánh giá sự có mặt của -amylase trong chế phẩm (hoặc canh trường vsv) bằng sự thay đổi màu với iodine, cịn đánh giá sự có mặt của glucoamylase bằng sự tích tụ glucose, mặc dù r rng l hiện diện đồng thời của cả 2 enzyme này đ lm tăng hiệu quả phân giải. Hoạt độ thật của từng enzyme một thấp hơn so với số liệu thu được. Cho nên, nếu như ta làm việc với chế phẩm phức hợp thì phải luơn luơn xc định hiệu lực tác dụng tổng hợp của mọi amylase lên cơ chất. Để xác định hoạt độ của các enzyme amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau:  Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên hồ tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt dung dịch giảm dần.  Đo mật độ quang của dung dịch sau khi thực hiện phản ứng màu với iodine. Khi có amylase tc dụng thì cc sản phẩm phn giải của tinh bột sẽ cho mu khc nhau đối với iodine.  Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng lên cơ chất. Đáng chú ý hệ enzyme amylase có các hoạt độ đặc trưng sau:  Hoạt độ amylase (HĐA) đặc trưng cho khả năng thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase (chủ yếu là của -amylase) tới dextrin cho màu với iodine khác với màu của tinh bột ban đầu. Hiện nay phương pháp so màu quang điện của Rukliadeva và Goriatreva (1985) được xem là phương pháp xác định hoạt độ amylase tiêu chuẩn.  Hoạt độ glucoamylase (HĐGI) đặc trưng cho khả năng của chết phẩm thủy phân tinh bột đến glucose. Muốn xác định HĐGI cần đo được lượng glucose tạo thành.  Hoạt độ đường hóa (HĐĐH) phản ánh khả năng của các enzyme amylase đường hóa tinh bột đến các đường khử.  Hoạt độ maltose (HĐM) đặc trưng cho khả năng thủy phân maltose tới glucose của chế phẩm enzyme.  Hoạt độ dextrinase (HĐDEX) đặc trưng cho khả năng thủy phân “ các dextrin tới hạn “ tới đường khử của chế phẩm enzyme. 4. Thu nhận enzyme amylase từ VSV a. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase ở VSV Khi nuơi VSV tạo amylase cĩ hai qu trình lin quan mật thiết với nhau. Qa trình tổng hợp sinh khối VSV v qu trình tích tụ enzyme trong tế bo hay ngồi mơi trường. Ở một số VSV, qu trình sinh tổng hợp amylase tiến hnh song song với qu trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng khối. Sự tạo thành amylase cực đại thường xảy ra sau khi quần thể tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng. Sinh trưởng của VSV hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme amylase trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực lớn. Amylase ngoại bào được tổng hợp liên tục và độc lập với amylase nội bào. Sự tổng hợp cc enzyme amylase bắt đầu khi việc tạo protein của tế bào đ kết thc hoặc gần kết thc v cạnh tranh với qu trình ny. Nồng độ tinh bột và các nguồn cacbon khác cũng có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành các enzyme riêng biệt của hệ amylase khi nuôi chủng Asp. oryzea 3-0-15 đột biến thể hiện ở bảng sau: Nguồn cacbon Hoạt độ của enzyme, đv/100ml Nguồn Cacbon Hoạt độ của enzyme, đv/100ml -amylase Oligo-1,6 glucozidase -amylase Oligo-1,6 glucozidase Tinh bột % Bột 6 300 800 Ngơ 250 760 4 220 800 Mì 250 760 2 110 800 Mì đen 300 770 1 70 710 Đậu nành Vết 810 b) Các yếu tố ảnh hưởng của môi trường đến tổng hợp enzyme amylase  Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi VSV tạo amylase người ta dùng muối vô cơ. NaNO 3 l nguồn nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo amylase. Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các enzyme amylase: Nguồn nitơ Liều lượng muối, % theo N Hoạt độ enzyme sau 6 ngày nuôi đv/100ml -amylase glucoamylase NaNO 3 NaNO 3 (NH 4 ) 2 SO 4 NH 4 NO 3 NH 4 NO 3 NH 4 H 2 PO 4 0,30 0,15 0,15 0,15 0,30 0,30 145 26 98 45 5,5 8000 3300 4100 4900 8000 Ngồi ra cịn dng nhiều nguồn nitơ hữu cơ (gelatin, casein, nước chiết ngô) nhưng cho hiệu quả kém hơn nhiều so với nguồn nitơ vô cơ.  Ảnh hưởng của amino acid: Amino acid là những cấu tử hợp thành cấu tử enzyme. Mặt khác các amino acid lại không đồng nhất về giá trị dinh dưỡng nên sử dụng hỗn hợp amino acid sẽ có giá trị dinh dưỡng lớn hơn và cho những chất lượng mới. Amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của VSV cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase.  Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng Các nguyên tố đa lượng và vi lượng (Mg, P, Ca, S, Co, Zn, Mn,…) có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của VSV.  Ảnh hưởng của pH nguyn liệu Ảnh hưởng của PH cm ẩm tới sinh tổng hợp amylase Cc chất lm ẩm cm mì tới độ ẩm 60% pH Hoạt độ enzyme trong mốc thnh phẩm đv/g Mơi trường Mốc thnh phẩm α-amylase Oligo-1,6 glucosidase Maltase Trước thanh trng Sau thanh trng Nước my HCl (0,1 N) HCl (0,2N) HCl (0,25N) HCl (0,3N) 6,0 5,0 4,5 4,0 3,6 6,1 6,7 6,8 6,1 6,0 6,4 6,7 6,8 6,1 6,0 25,0 27,3 24,7 10,4 8,7 1008 1230 1172 1100 1130 130 134 127 134 133 c. Các phương pháp thu nhận enzyme amylase: Trong số những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hơp các enzym amylase trong quá trình nuơi VSV, thì thnh phần mơi trường, tính chất cơ lý của môi trường , độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí ,nhiệt độ nuôi và pH môi trường…là những yếu tố cơ bản tối quan trọng. Sơ đồ quy trình thu nhận enzyme amylase từ VSV: Chuẩn bị mơi trường Nuơi cấy VSV giống Có 2 phương pháp VSV là phương pháp bề mặt (pp nổi) và phương php bề su (pp chìm). Phương pháp nuôi quyết định sơ đồ công nghệ nuôi: Nuôi VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt Hầu hết VSV tạo amylase đều hấp thụ carbon chủ yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin…) hydro ở dạng H 2 O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tạo cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử. Enzym ngoại bo Enzym nội bo Ph vỡ tế bo Lọc hoặc ly tm enzyme thơ Cơ dặc Tinh chế Enzym tinh khiết Sấy Cấu tử chính của môi trường VSV tạo amylase bằng pp bề mặt l cm mì, cm gạo. Cm mì, cm gạo l nguyên liêụ hoàn hảo và có thể là 1 cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi VSV không cần bổ sung thm cc chất khc nữa. Cm mì 16-22% tinh bột, 10-12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như methionine (0,19%), cystine (0,3%), arginine(1%), lysine (6%), tryptophan(0,3%), 3-4% chất béo, 10,3% cellulose, các nguyên tố tro (Na-0,09%, K-1%,Ca-0,16%,P-0,94% ) và nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột 10-15% chất béo ,10-14% protein ,8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37- 59%). Chất lượng của cám gạo, cm mì cĩ ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của các enzym amylase .cám gạo không được chứa tinh bột dưới 20-30%, cám không có dư vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc không quá 0.05% Cấu tử bổ sung được đưa vào có thể là chất làm xốp môi trường hoặc làm giàu thêm các chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng mà cám không có đủ. Các cấu tử này thường là mầm mạch (15-20%) , trấu(2-25%), mùn cưa (5- 10%)…. Có thể dùng cặn b canh trường rắn (sau khi trích ly enzym ) làm cấu tử chính của môi, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải thanh trùng để bảo đảm chúng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai.Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1-1,5 atm trong vịng 6-8 giờ, cĩ thể thanh trng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 120 o C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin (40%0 và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường. -Độ ẩm tối thích của môi trường: Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích (đối với Asp. Niger, Asp. Awamort, Asp. Flavus, Asp. Oryzae )của môi trường là 58-60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuơi. Độ ẩm mà tăng quá 55-70% sẽ làm giảm độ thoáng khí , cịn thấp hơn 50- 55% thì kìm hm sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như sự tạo enzym amylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường hình tam gic, trong tủ ấm phịng thí nghiệm hoạt lực amylase cao nhất thu được ở độ ẩm 65-68%). Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến sinh tổng hợp enzym amylase được trình by trong bảng sau: Phương án thí nghiệm 20 giờ 34 giờ 42 giờ Độ ẩm (%) Hoạt động amylase đv/g canh trường khô Độ ẩm (%) Hoạt động amylase đv/g canh trường khô Độ ẩm (%) Hoạt động amylase đv/g canh trường khô Khay để hở 27,8 15,0 23,8 18,0 22,0 20,5 Khay đậy nắp 46,4 20,4 42,4 32,9 42,4 36,7 Cần thơng khí lin tục suốt thời kì sinh trưởng của VSV. Trong quá trình sinh trưởng của mình VSV tiu thụ 25-35% chất dinh dưỡng của môi trường và thải ra 1 lượng lớn nhiệt sinh lý v CO 2 .Vì vậy cần phải thải nhiệt ny bằng thơng giĩ với khơng khí vơ trng cĩ độ ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ thông khí có thể liên tục , gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên )tuỳ thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi , vào khoảng cách giữa các tầng khay và dy khay. Thường là ở giai đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thong khí vào phịng nuơi koảng 4-5 lần thể tích khơng khí trn 1 thể tích phịng nuơi/1 giờ, cịn ở giai đoạn thứ 3 giảm đi chỉ cịn 10- 12 thể tích khơng khí. Nhiệt độ nuôi:tồn bộ chu kì sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3 thời kỳ: -Thời kì trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10-11 giờ đầu tiên, đối với vi khuẩn 3-4 giờ).Trong thời kì ny phải đốt nóng không khí phịng nuơi v giữ cho nhiệt độ phịng nuơi khơng thấp hơn 23-30 o C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ 32-38 o C cho vi khuẩn . Độ ẩm tuơng đối của không khí là 96-100%. -Thời kì sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vịng 4-18 giờ). Ở giai đoạn này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra 1 lượng nhiệt sinh lý rất lớn.Kết quả l trong lớp sợi nấm đang mọc nhiệt độ tăng lên đến 37-40 o C , đôi khi cao hơn tới 47 o C.Vì vậy cần ohải hạ nhiệt độ phịng nuơi gip cho sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở nhà máy người ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28-29 o C và độ ẩm cao vào phịng nuơi. -Thời kì tạo enzym amylase mạnh mẽ (ko di từ 10-20 giờ). Trang thời kì ny cc qu trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự toả nhiệt giảm mạnh. Các enzym amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Đối với đa số VSV ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3-4 o C so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28-30 o C , cho Bac. Subtilis l 35-37 o C. Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn : thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Tuỳ thuộc vo tính chất sinh lý của chủng sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzym mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kì lc no thấy cần thiết. sự tạo bo tử l hiện tượng không mong muốn vì thường là làm giảm hoạt lực của enzyme. Đối với đa ssố nấm mốc Aspergillus, sự tạo enzym amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mmốc bắt đầu sinh đính bào tử . Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuơi để có tích luỹ amylase cực đại đối với từng loại sợi nấm và vi khuẩn như sau: Chủng Thời gian nuơi (giờ) Asp. oryzae – 476 24-25 Asp. oryzae –KC 30-36 Asp. oryzae 8F 1 24-30 Asp. awamori 22 36 Bac. Subtilis 68-72 (ở 30 o C ) [...]... trường để nuôi vi khuẩn Bac.subtilis nhằm thu -amylase thích hợp nhất l 6,8-7,5, cịn để tổng hợp protease lại là 7,0-7,8 pH ban đầu tối thích cho sinh tổng hợp các enzyme là 7,0-7,8 Nên pH ban đầu cao hơn 7,5 hay thấp hơn 7,0 đều làm giảm vận tốc sinh tổng hợp enzyme, cịn nếu pH bằng 8,8-9,0 thì vi khuẩn hầu như không phát triển Nhiệt độ nuôi: nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng... thành các enzyme amylase Không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ dẫn đến làm giảm hoạt lực các enzyme amylase Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm sợi thu c giống Aspergillus là 30-32oC (trong đó có Asp.oryzae 3-9-15 và Asp.awamori 22), Bacillus subtilis Môi trường thích hợp nhất và tạo nhiều amylase ở nhiệt độ 37oC Một số vi khuẩn khác lại có nhiệt độ sinh trưởng tối thích cao hơn Bac.diastaticus sinh. .. nhau Khi giữ ở 90oC trong 1 giờ thì amylase của chủng sinh trưởng ở nhiệt độ 35oC bị mất 90-94% hoạt độ ban đầu; trong lúc đó amylase của chủng được nuôi ở nhiệt độ 55oC chỉ bị vơ hoạt cĩ 10-12% Sục khí v khuấy trộn Phần lớn VSV tạo amylase l những VSV hiếu khí Vì vậy sinh trưởng của chúng phụ thu c vào lượng oxy phân tử hịa tan trong dịch nuơi cấy trong qu trình sinh trưởng của mình, VSV sử dụng oxy... maltase và oligo-1,6-gluco amylase hoạt động lại rất cần có Mg trong môi trường Để tạo điều kiện cho VSV phát triển tốt và sinh nhiều amylase người ta cho thêm vào môi trường các loại nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước chiết đậu nành,… đó là nguồn bổ sung amino acid , vitamin và các tạp chất sinh trưởng Dưới đây là 1 số môi trường lỏng dung để nuôi VSV tạo thành các enzym amylase Đối với Aspergillus,... Chính vì lẽ đó, vi c sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tới sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp enzym của VSV Vi c khuấy đảo môi trường dinh dưỡng trong quá trình nuơi VSV cĩ thể thực hiện bằng nhiều cch khc nhau: Sục khơng khí vơ trng vo thiết bị nuơi Bằng my cc kiểu chuyn dng Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy Bằng tc dụng của cc khí sinh ra khi ln men... (pH=6) thì hoạt lực -amylase cũng giảm đi nhiều (gần bằng 23%) Khi dùng các muối ammonium phosphate làn nguồn nitơ để nuôi chủng mốc này thì pH tối thích của mơi trường phải nằm trong vùng 6-7 Để thu glucoamylase người ta nuôi Asp.awamori 22 trong môi trường Sapeck có 6% tinh bột Glucoamylase tích lũy cực đại trong canh trường ở ngày thứ 3 tại pH=8 pH tối thích bn đầu cho chủng này sinh trưởng là 7,0-7,2...Nuôi VSV tạo amylase bằng phương pháp bề su Môi trường dinh dưỡng : Đặc điểm chung cho mọi môi trường nuôi VSV tạo amylase là có chất cảm ứng: tinh bột, dextrin hay maltose Nguồn Nitơ dinh dưỡng thường dùng là nitơ vô cơ (NaNO3) Sinh tổng hợp -amylase hoạt động ở các chủng Aspergillus thường chỉ thấy trong các môi trường có các muối của acid sulfuric Đối với sinh trưởng của 1 số nấm sợi... quan trọng có ảnh hưởng lớn tới sinh tổng hợp các enzyme amylase ở các chủng VSV nuôi chìm l nồng độ ion hydro trong môi trường và sự biến đổi của nó trong quá trình sinh tổng hợp của chủng nuơi Độ acid của canh trường được xác định bởi thành phần và tính chất của các muối vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi VSV Trước hết, pH của canh trường phụ thu c vào tính chất của nguồn... vào để trung hịa mơi trường hoặc duy trì tự động giá trị pH thích hợp cho vi c tổng hợp enzyme amylase Khi nguồn nitơ vô cơ được dùng là các muối nitrate, thì trong qu trình VSV tiu thụ anion (NO3-) sẽ giải phóng ra các ion kim loại và môi trường bị kiềm hóa pH tăng lên pH ban đầu của môi trường để nuôi Asp.oryzae 3-9-15 nhằm thu -amylase là 5,5-5,7 (môi trường sapeck cải tiến có 6% tinh bột, nước chiết... trường bị kiềm hóa dần dần và tới cuối kì sinh trưởng canh trường có pH 7,8-8,2 Trong trường hợp này, sự kiềm hóa tự nhiên môi trường khi VSV sử dụng NaNO3 làm nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng tốt tới sinh tổng hợp -amylase Không cần có một sự điều chỉnh pH nào cả Ở đây giá trị pH tối thích cho tổng hợp -amylase (7-8) khác hẳn giá trị pH tối thích đối với hoạt động của enzyme (pH 4,7-4,9) Khi điều chỉnh giá . THU NHẬN ENZYME AMYLASE 1) Nguồn enzyme amylase từ vi sinh vật: Trong thiên nhiên enzyme có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và vi sinh vật. Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài vi. phẩm enzyme. 4. Thu nhận enzyme amylase từ VSV a. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase ở VSV Khi nuơi VSV tạo amylase cĩ hai qu trình lin quan mật thiết với nhau. Qa trình tổng hợp sinh khối. Usamii sinh tổng hợp enzyme này mạnh hơn cả. Ngoài các enzyme được kể trên, trong họ hàng cuả amylase cịn cĩ cc enzyme đồng loại nư. Dưới đây sẽ điểm qua một vài enzyme đó. e. Pullulanase Ở vi