Nghiên cứu thu nhận enzym α amylase từ trực khuẩn cỏ khô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM α – AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN CỎ KHÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM α – AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN CỎ KHÔ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LƯƠNG ĐỨC PHẨM Thành phố Hồ Chí Minh – 2009 MỞ ĐẦU Vi sinh vật tự nhiên đa dạng phong phú Chúng có mặt khắp nơi: đất, nước, không khí,… kể thể người Ngoài tác hại vi sinh vật gây như: gây bệnh cho thực vật, động vật người; nguồn lợi mà chúng mang lại cho vô to lớn ta hiểu, biết sử dụng chúng hợp lý Các chủng vi sinh vật nói chung vi khuẩn Bacillus nói riêng sử dụng phổ biến chế phẩm sinh học để phục vụ cho ngành sản xuất như: rượu, bia, công nghiệp dệt, thuộc da, bổ sung vào thức ăn cho gia súc để dễ tiêu hoá, thức ăn nuôi trồng thuỷ sản, y học nghiên cứu,… nhờ khả sinh loại enzym thuỷ phân chủng vi sinh vật Enzym chất xúc tác sinh học, tính chất chất xúc tác có tính chất ưu việt như: có hiệu suất xúc tác cao điều kiện nhiệt độ áp suất bình thường, có tính đặc hiệu cao Các tính chất bảo tồn tách enzym khỏi hệ thống sống, hoạt động điều kiện invitro Vì vậy, enzym ngày sử dụng rộng rãi thực tế, với quy mô ngày lớn, dẫn đến việc hình thành phát triển ngành công nghệ sản xuất enzym Việc sử dụng enzym thực tế ý nghóa kinh tế mà giải nhiều vấn đề xã hội, vấn đề xúc môi trường Trước kia, enzym thường thu nhận từ tế bào thực vật động vật (chẳng hạn amylase lấy từ hạt nảy mầm, protease từ nhựa đu đủ, dày,…) Tuy nhiên trình sinh tổng hợp enzym động vật thực vật gắn liền với trao đổi chất nhu cầu tế bào Ngoài ra, người ta phải phá bỏ tổ chức tế bào để tách chiết thu nhận enzym Như vậy, việc dùng tế bào động vật, thực vật làm nguồn nguyên liệu để thu nhận enzym hạn chế, thiếu tính kinh tế không đáp ứng nhu cầu số lượng enzym cần thiết cho sản xuất Trong đó, vi sinh vật chứa đầy đủ loại enzym việc sử dụng nguồn enzym từ vi sinh vật mang lại lợi ích lớn hơn, cụ thể nguồn nguyên liệu dùng để nuôi cấy vi sinh vật thường rẻ tiền chúng thường phế phụ phẩm công nông nghiệp (như cám, trấu, bã mía, bã khoai mỳ,…) nguồn nguyên liệu tự nhiên dầu mỏ, khí đốt,… Mặt khác, điều kiện nuôi cấy dễ dàng, enzym có hoạt tính cao Vì thế, khoảng 50 năm gần chế phẩm enzym từ vi sinh vật dần thay enzym có nguồn gốc thực vật, động vật Trong hàng loạt loại enzym khác amylase enzym phân giải tinh bột tạo đường cho sinh vật Từ năm đầu kỷ 18 nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu amylase đến biết rõ loại enzym Amylase ứng dụng rộng rãi nhiều lónh vực sản xuất công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt,…Sản xuất amylase công nghiệp ý từ lâu ngày phát triển nhiều nước giới Việt Nam nhiều nước có nhiều nghiên cứu ứng dụng enzym amylase, công nghiệp sản xuất enzym nước ta chưa thật phát triển Xuất phát từ sở chọn đề tài cho luận văn: “Nghiên cứu thu nhận enzym α-amylase từ trực khuẩn cỏ khô” Nội dung đề tài gồm số vấn đề sau: Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng sinh enzim amylase có hoạt tính mạnh từ đất vườn qua trung gian cỏ khô Nghiên cứu hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc, đặc điểm sinh học chủng tuyển chọn Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu dịch enzym amylase có hoạt độ cao Định danh chủng tuyển chọn kỹ thuật di truyền phân tử Nuôi cấy chủng tuyển chọn thiết bị bình lên men tam giác lít với điều kiện nuôi cấy tối ưu Nghiên cứu động học trình sinh tổng hợp amylase với thông số pH, sinh trưởng hoạt độ enzym Tách chiết enzym amylase từ dịch lên men nhờ tác nhân tủa So sánh hiệu suất thu nhận hoạt độ chế phẩm enzym (CPE) amylase thu từ tác nhân tủa khác Nghiên cứu độ bền nhiệt độ bền pH CPE amylase Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giống vi khuẩn Bacillus [5], [16], [38], [39] Bacillus vi khuẩn Gram dương, hình que có kích thước khác (0,5 – 2,5) ×(1,2 - 10) μm Chúng phân bố rộng rãi tự nhiên, đất, nước, không khí Là vi khuẩn dị dưỡng hoá năng, thu lượng nhờ oxi hoá hợp chất hữu cơ, có chùm tiên mao giúp chúng có khả di động, sống hiếu khí hiếu khí tuỳ tiện Bacillus có khả sinh bào tử, bào tử hình thành tế bào trải qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, thiếu chất dinh dưỡng Mỗi tế bào sinh dưỡng sinh bào tử Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng tự phân giải giải phóng bào tử Các tế bào Bacillus đặc trưng sinh bào tử màø giữ hình dáng trực khuẩn mang bào tử, số trường hợp tế bào vi khuẩn phình to chứa bào tử Tuỳ loài mà bào tử nằm tâm, lệch tâm hay gần đầu tế bào Bào tử có khả chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ nhiều độc tố, chúng có khả giữ trạng thái bào tử nhiều năm Bào tử quan sinh sản mà trạng thái bảo vệ nòi giống, tạo để giúp tế bào chịu điều kiện bất lợi môi trường Đó dạng nghỉ tế bào Bào tử dạng tự trình trao đổi chất, gặp điều kiện thuận lợi bào tử cho tế bào sinh dưỡng Đa số Bacillus sinh trưởng tốt pH = 7, số phù hợp với pH = – 10 Bacillus alcalophillus, với pH = – Bacillus- acidocaldrius Về nhiệt độ, có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (450C – 750C), ưa lạnh (50C –250C), thường gặp Bacillus sống nhiệt độ tối ưu 340C – 370C Hầu hết Bacillus không gây bệnh cho người động vật Một số loại gây bệnh cho côn trùng Bacillus thuringiensis, B poplliae, B lentimorbus, B cereus, B anthracis (trong B cereus B anthracis gây bệnh cho người)…đa số lại tự nhiên có ích Bacillus có khả sinh enzym ngoại bào: α-amylase, protease kiềm, cellulase… enzym ứng dụng nhiều công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp… Sau số loài Bacillus thường gặp tự nhiên 1.1.1 Bacillus subtilis Bacillus subtilis phát đặt tên vào năm 1872, phân bố phổ biến đất đặc biệt cỏ khô nên Bacillus subtilis gọi trực khuẩn cỏ khô Là vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3 -5) × 0,6 μm, nhiều tế bào nối lại với thành chuỗi dài ngắn khác tế bào đứng riêng rẽ Khuẩn lạc khô, không màu màu xám nhạt, nhăn tạo lớp màng mịn lan bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch Nhiệt độ thích hợp cho Bacillus subtilis sinh trưởng 300C – 500C, thường nuôi cấy 370C Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6 – 0,9 μm, phân bố lệch tâm, gần tâm không tâm Bào tử sống vài năm đến vài chục năm Đã có chứng việc trì sức sống bào tử B subtilis 200-300 năm Vi khuẩn B subtilis có màng nhày (giác mạc) giúp vi khuẩn có khả chịu điều kiện khắc nghiệt màng nhày dự trữ thức ăn bảo vệ vi khuẩn tránh tổn thương khô hạn Màng nhày quan sát nhuộm tiêu bản, qua kính hiển vi nhìn thấy màng nhày B subtilis không màu, suốt, tế bào vi khuẩn bắt màu nâu đỏ tiêu xanh đen B subtilis có khả sinh số enzym như: α-amylase, protease kiềm có giá trị cao, đặc biệt có khả tổng hợp riboflavin (tiền vitamin B2) Vì vậy, B subtilis ứng dụng nhiều ngành công nghiệp 1.1.2 Bacillus mesentericus Bacillus mesentericus gọi trực khuẩn khoai tây chúng có mặt chủ yếu khoai tây Chúng gần giống Bacillus subtilis khuẩn lạc ăn sâu bám chặt vào môi trường thạch, bề mặt nhăn nhúm, khô, không mọc lan môi trường, màu xám nhạt-trắng, vàng nâu, hồng Bacillus mensentericus ruber đen Bacillus mensentericus niger Bacillus mensentericus sinh trưởng phát triển tốt nhiệt độ 36 – 450C, tối đa 50 – 550C, pH = 4,5 – ngừng phát triển Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase protease lớn hẳn Bacillus subtilis, lên men đường lại Bacillus mensentericus Bacillus subtilis phổ biến tự nhiên, chúng lây nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, loại thực phẩm có chứa nitơ sản phẩm giàu đường (bánh kẹo, hoa quả) Ngoài ra, chúng sinh loại hợp chất có hoạt tính kháng số vi khuẩn khác gọi bacterioxin, Bacillus subtilis gọi subtilin 1.1.3 Bacillus cereus Vi khuẩn có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, B mycoides, B thuringiensis Bào tử chúng hình bầu dục, kích thước 0,9 × (1,2 – 1,5) μm, nằm lệch tâm, phát tán khắp nơi, đất, không khí…Chúng thường sinh sôi nảy nở thực phẩm cơm sinh độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng gây ngộ độc thực phẩm Tế bào B cereus dày, kích thước (1 -1,5) × (3 – 5) μm có dài hơn, đứng riêng rẽ xếp thành chuỗi Khuẩn lạc B cereus phẳng, lõm, bề mặt xù xì (dạng bột, dạng hạt nhỏ) trắng đục, mép lồi lõm 1.1.4 Bacillus megaterium Megaterium có nghóa “con thú lớn”, tế bào lớn khoảng gấp lần tế bào Bacillus subtilis, kích thước (1,2 – 1,5) × (3 – 12) μm Ở ống nuôi già tế bào ngắn hơn, tròn hơn, hình thoi với đầu hẹp lại Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ chất dự trữ (hạt mỡ, glycogen) Bào tử lớn, hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 × (0,7 – 1) μm, chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang chiều xiên tế bào Khuẩn lạc tròn đều, lồi nhẵn thường có vòng viền quanh khuẩn lạc vòng đồng tâm bề mặt, không thuỳ, không nếp, mép tròn hay lượn sóng, màu trắng sữa hay đục, có có màu nâu nhạt Sinh trưởng môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm yếu tố dinh dưỡng khác 1.1.5 Bacillus pumilus Bào tử phát tán rộng, có mặt đất nhiều Bacillus subtilis Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới Tế bào gần giống tế bào B subtilis 1.1.6 Bacillus polymyxa Kích thước tế bào (0,6 – 1) × (2 – 7) μm, đứng riêng rẽ xếp thành đôi, chuỗi ngắn Khi hình thành bào tử tế bào phồng lên hình chanh Bào tử hình bầu dục kéo dài khoảng (1,7 – 2,6 μm), bề mặt cắt ngang hình sao, nằm tế bào, chúng phát tán rộng Khuẩn lạc B polymyxa vô màu, phẳng lồi, trơn, lan dần xung quanh, mép có thuỳ Chúng thường sinh trưởng phát triển thực vật bị hỏng Vì vậy, người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm Chúng nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin 1.1.7 Bacillus simplex Tế bào B simplex nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) × 0,6 μm, thường đứng riêng rẽ không gắn thành chuỗi Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,6 × 0,9 μm, nằm lệch tâm Khuẩn lạc B simplex giống khuẩn lạc B cereus, khác khuẩn lạc B simplex có khả sinh sắc tố lục nhạt, vàng tiết vào môi trường 1.1.8 Bacillus brevis B brevis trực khuẩn có kích thước (0,7 – 1,0) × (3 – 5) μm, đứng riêng rẽ, xếp thành chuỗi Bào tử có hình bầu dục nằm cuối tế bào làm cho tế bào có đầu phồng to Khuẩn lạc B brevis màu trắng, có màu vàng, lồi phẳng, lấp lánh, mép cưa giống dạng mỡ đặc 1.1.9 Bacillus aslersporus Tế bào dày (1,0–1,2) × (3 –7) μm, đứng riêng rẽ xếp thành đôi Bào tử hình trụ hay hình kéo dài, kích thước 1,0 × (1,5–2) μm, nằm tế bào Khi hình thành bào tử tế bào phồng lên chút trông giống dạng Clostridium Khuẩn lạc B aslersporus nhỏ, màu trắng hay màu lục nhạt, phẳng, mềm, nhày, đồng chất 1.2 Khái quát chung enzym [1], [4], [15], [23], [49] Sinh vật xem hệ thống mở có liên quan chặt chẽ đến trình trao đổi chất tế bào thể, thể với môi trường Quá trình trao đổi chất sinh vật biểu sinh động sống Khi thể không khả trao đổi chất thể chết Quá trình trao đổi chất liên tục xảy tế bào, tạo nên biến đổi liên tục Bảng3.8 Ảnh hưởng độ hiếu khí đến hoạt độ amylase Thể tích dịch nuôi cấy (ml) 50 75 100 150 200 250 300 Số lần đo Trung bình Sai số Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD 0,327 0,324 0,324 7,859 7,787 7,787 16,505 16,353 16,353 0,440 0,443 0,444 10,575 10,648 10,672 22,208 22,360 22,410 0,558 0,560 0,558 0,325 7,811 0,001 0,024 16,404 0,442 10,631 0,050 0,001 0,029 22,326 0,559 0,061 0,001 Lượng tinh bột(mg/ml) 13,412 13,460 13,412 13,428 0,016 Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) 28,164 0,329 7,908 16,606 0,264 6,345 13,325 0,215 5,168 10,852 0,182 4,374 9,186 28,198 0,328 7,875 0,034 0,001 0,021 16,538 0,265 6,361 0,045 0,001 0,016 13,359 0,213 5,111 0,034 0,001 0,035 10,734 0,183 4,406 0,073 0,001 0,016 9,253 0,034 28,265 0,328 7,883 16,555 0,264 6,345 13,325 0,210 5,047 10,599 0,184 4,422 9,287 28,164 0,326 7,835 16,454 0,266 6,393 13,426 0,213 5,119 10,751 0,184 4,422 9,287 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nồng độ NaCl NaCl (%) 0,03 0,05 0,08 0,1 0,12 Trung Số lần đo bình Delta OD 0,081 0,085 0,084 0,083 Lượng tinh bột(mg/ml) 1,947 2,043 2,019 2,003 Hoạt độ amylase (UI/ml) 4,088 4,290 4,240 4,206 Delta OD 0,231 0,234 0,234 0,233 Lượng tinh bột(mg/ml) 5,552 5,624 5,624 5,600 Hoạt độ amylase (UI/ml) 11,659 11,811 11,811 11,760 Delta OD 0,388 0,385 0,388 0,387 Lượng tinh bột(mg/ml) 9,326 9,253 9,326 9,302 Hoạt độ amylase (UI/ml) 19,584 19,432 19,584 19,533 Delta OD 0,806 0,805 0,806 0,806 Lượng tinh bột(mg/ml) Sai số 0,001 0,029 0,061 0,001 0,024 0,050 0,001 0,024 0,050 0,000 19,372 19,348 19,372 19,364 0,008 Hoạt độ amylase (UI/ml) 40,682 40,631 40,682 40,665 0,017 Delta OD 0,662 0,664 0,001 Lượng tinh bột(mg/ml) 15,911 16,007 15,935 15,951 0,029 Hoạt độ amylase (UI/ml) 33,413 33,615 33,464 33,498 0,061 Delta OD 0,526 0,001 Lượng tinh bột(mg/ml) 12,618 12,666 12,618 12,634 Hoạt độ amylase (UI/ml) 26,499 26,600 26,499 26,532 0,016 0,525 0,666 0,527 0,663 0,525 0,034 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ CaCl2 %CaCl2 Số lần đo Trung Sai bình số Delta OD 0,481 0,485 0,483 0,483 0,001 Lượng tinh bột(mg/ml) 11,561 11,657 11,609 11,609 0,028 Hoạt độ amylase (UI/ml) 24,278 24,480 24,379 24,379 0,058 Delta OD 0,568 0,565 0,565 0,566 0,001 0,01 Lượng tinh bột(mg/ml) 0,015 Hoạt độ amylase (UI/ml) 28,669 28,518 28,518 28,568 0,050 Delta OD 0,455 0,458 0,456 0,456 0,001 Lượng tinh bột(mg/ml) 10,936 11,008 10,960 10,968 0,021 Hoạt độ amylase (UI/ml) 22,965 23,117 23,016 23,033 0,045 Delta OD 0,404 0,405 0,408 0,406 0,001 0,02 Lượng tinh bột(mg/ml) 13,652 13,580 13,580 13,604 0,024 9,710 9,734 9,806 9,750 0,029 Hoạt độ amylase (UI/ml) 20,391 20,442 20,593 20,475 0,061 Delta OD 0,378 0,373 0,375 0,375 0,001 0,025 Lượng tinh bột(mg/ml) 9,085 8,965 9,013 9,021 0,035 Hoạt độ amylase (UI/ml) 19,079 18,827 18,928 18,944 0,073 Nghiên cứu động học trình lên men chủng CK2 bình tam giác lít Bảng Hoạt độ amylase trình nghiên cứu động học Thời gian (h) 20 30 35 40 45 50 55 60 70 Số lần đo 0,388 0,387 9,326 9,302 19,584 19,533 0,425 0,424 10,215 10,191 21,451 21,401 0,508 0,505 12,210 12,138 25,641 25,489 0,640 0,644 15,382 15,479 32,303 32,505 0,885 0,885 Trung bình Sai số 0,387 9,294 0,001 0,021 19,516 0,423 10,175 0,045 0,001 0,029 21,367 0,506 12,154 0,061 0,001 0,029 25,523 0,641 15,406 0,061 0,002 0,037 32,354 0,883 0,077 0,002 Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD 0,385 9,253 19,432 0,421 10,119 21,249 0,504 12,114 25,439 0,639 15,358 32,253 0,880 Lượng tinh bột(mg/ml) 21,151 21,271 21,271 21,231 0,040 Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/ml) Delta OD Lượng tinh bột(mg/ml) Hoạt ñoä amylase (UI/ml) 44,417 0,871 20,934 43,962 0,849 20,406 42,852 0,797 19,156 40,227 0,751 18,050 37,906 44,669 0,878 21,103 44,316 0,855 20,550 43,155 0,808 19,420 40,783 0,757 18,194 38,208 44,585 0,875 21,023 0,084 0,002 0,049 44,147 0,852 20,486 0,102 0,002 0,042 43,020 0,803 19,292 0,089 0,003 0,076 40,513 0,755 18,138 0,160 0,002 0,045 38,091 0,094 44,669 0,875 21,031 44,164 0,853 20,502 43,054 0,803 19,300 40,530 0,756 18,170 38,158 Hoaït độ CPE amylase thu tác nhân tủa Bảng Hoạt độ CPE amylase (UI/g CPE) thu tác nhân tủa Tác nhân tủa Delta OD Lượng tinh bột etanol (mg/ml) 960C Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột aceton (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột sulphate (mg/ml) amon Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Số lần ño Trung bình 0,861 0,867 0,864 0,864 0,002 20,694 20,838 20,766 20,766 0,042 10864 10940 10902 10902,28 21,86 0,678 0,675 0,674 0,676 0,001 16,296 16,224 16,200 16,240 0,029 8555,3 8517,4 8504,8 8525,82 15,17 0,314 0,318 0,313 0,315 0,002 7,547 7,6431 7,523 7,571 0,037 3962,2 4012,6 3949,6 3974,79 19,27 Sai số Độ bền nhiệt CPE amylase Bảng Độ bền nhiệt CPE amylase Nhiệt độ (0C) 30 40 50 60 70 Số lần đo Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột Trung bình 0,876 0,879 0,868 0,874 0,003 21,055 21,127 20,862 21,015 0,079 11053,70 11091,55 10952,75 11032,67 Sai soá 41,43 0,873 0,872 0,876 0,874 0,001 20,983 20,959 21,055 20,999 0,029 11015,84 11003,22 11053,70 11024,25 15,17 0,848 0,849 0,845 0,847 0,001 20,382 20,406 20,310 20,366 0,029 10700,38 10713,00 10662,53 10691,97 15,17 0,809 0,812 0,81 0,810 0,001 19,444 19,516 19,468 19,476 0,021 10208,27 10246,12 10220,88 10225,09 11,13 0,766 0,769 0,771 0,769 0,001 18,411 18,483 18,531 18,475 0,035 9665,68 9703,53 9728,77 9699,32 18,33 0,696 0,698 0,696 0,697 0,001 16,728 16,776 16,728 16,744 0,016 (mg/ml) 80 90 100 Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD 8782,39 8807,63 8782,39 8790,80 8,41 0,313 0,318 0,314 0,315 0,002 7,523 7,6431 7,547 7,571 0,037 3949,55 4012,64 3962,17 3974,79 19,27 0,009 0,006 0,006 0,007 0,001 0,216 0,1442 0,1442 0,168 0,024 113,57 75,71 75,71 88,33 12,62 0 0 0,00 Độ bền pH CPE amylase Bảng Độ bền pH CPE amylase Số lần đo pH 4,0 4,5 5,0 Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Trung bình Sai số 0,057 0,001 0,056 0,056 0,058 1,346 1,346 1,394 1,362 0,016 706,63 706,63 731,87 715,04 8,41 0,333 0,332 0,335 0,333 0,001 8,004 7,980 8,052 8,012 0,021 4201,92 4189,30 4227,16 4206,13 11,13 0,662 0,664 0,662 0,663 0,001 15,911 15,959 15,911 15,927 0,016 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) Delta OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ amylase (UI/g CPE) 8353,36 8378,60 8353,36 8361,78 8,41 0,805 0,809 0,807 0,807 0,001 19,348 19,444 19,396 19,396 0,028 10157,7 0,903 10208,2 0,905 10183,0 0,903 10183,03 14,57 0,904 0,001 21,704 21,752 21,704 21,720 0,016 11394,3 0,848 11419,6 0,845 11394,3 0,844 11402,81 8,41 0,846 0,001 20,382 20,310 20,286 20,326 0,029 10700,3 0,736 10662,5 0,738 10649,9 0,735 10670,94 15,17 0,736 0,001 17,690 17,738 17,666 17,698 0,021 9287,12 9312,36 9274,51 9291,33 11,13 0,664 0,668 0,667 0,666 0,001 15,959 16,055 16,031 16,015 0,029 8378,60 8429,07 8416,46 8408,04 15,17 0,464 0,461 0,466 0,464 0,001 11,152 11,080 11,200 11,144 0,035 5854,93 5817,07 5880,16 5850,72 18,33 Lời Cảm Ơn დ Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS Lương Đức Phẩm tận tình hướng dẫn, động viên tạo điều kiện tốt cho hoàn thành luận văn დ Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: TS Trần Thanh Thuỷ Cán phòng thí nghiệm Vi sinh Sinh hoá – Trường Đại học Sư phạm TP HCM Quý Thầy, Cô trực tiếp giảng dạy Phòng Khoa học Công nghệ Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm TP HCM Ban Giám hiệu – Trường THPT Nguyễn Trãi Trường THPT chuyên Lê Quý Đôn – tỉnh Ninh Thuận Các Cán phòng thí nghiệm Sinh hoá – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Và bạn bè, đồng nghiệp Đã truyền đạt kiến thức, chia sẻ, động viên tinh thần tạo điều kiện giúp đỡ thời gian học tập thực đề tài დ Cuối xin ghi nhận tình cảm yêu thương người thân gia đình, ủng hộ, động viên vượt qua khó khăn sống công tác NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN B subtilis : Bacillus subtilis CPE : Chế phẩm enzym ĐVHĐ : Đơn vị hoạt độ OD : Giá trị mật độ quang Delta OD : Hiệu số giá trị mật độ quang VSV : Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Độ bền nhiệt α-amylase từ nguồn khác nhau………………………… 17 Bảng 3.1 Đường kính phân giải tinh bột chủng CK…………….…………………………44 Bảng 3.2 Sự sinh trưởng chủng CK………………………………………………………….……… 45 Bảng 3.3 So sánh hoạt độ amylase chủng CK…………………………………………………46 Bảng 3.4 Một số đặc điểm sinh học chủng CK2…………………………………………………49 Bảng 3.5 Ảnh hưởng loại chất đến hoạt độ amylase…………………………………… ……50 Bảng 3.6 Nồng độ tinh bột tan ảnh hưởng đến hoạt độ amylase………………… …….52 Bảng 3.7 Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt độ amylase………………………………………….………53 Bảng 3.8 Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ amylase………………………………….….……54 Bảng 3.9 Ảnh hưởng độ hiếu khí đến hoạt độ amylase……………………….……… 55 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến hoạt độ amylase…….……… 57 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ CaCl2 đến hoạt tính amylase……………………………….58 Bảng 3.12 Nồng độ NaCl cao ức chế sinh trưởng…………………………………….………59 Bảng 3.13 Nghiên cứu động học trình lên men Bacillus subtilis CK2……….61 Bảng 3.14 Thu nhận chế phẩm enzym (CPE) amylase từ tác nhân tủa…….62 Bảng 3.15 Hoạt độ CPE amylase dùng tác nhân tủa……….………….…63 Bảng 3.16 Độ bền nhiệt amylase………………………………………………………….………… … 64 Bảng 3.17 Độ bền pH amylase……………………… ………………………………………………………66 DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ VÀ BIỂU ĐỒ Trang Hình 1.1 Cấu trúc phân tử α-amylase…………………………………………………………………………… 16 Hình 3.1 Vòng phân giải tinh bột chủng CK……………………….………………………… 44 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc chủng CK2…………………………………………………………………… 47 Hình 3.3 Hình thái tế bào chủng CK2…………………………………………………………………………….48 Hình 3.4 Bào tử chủng CK2……………………………………………………………………………………….48 Hình 3.5 Trình tự 16S-rARN chủng CK2…………………………………………………………… 60 Đồ thị 3.1 So sánh sinh trưởng chủng CK…………………………………………………….45 Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng loại chất đến hoạt độ amylase……………………………… 51 Đồ thị 3.3 Động học trình nuôi cấy B subtilis CK2 sinh α-amylase…….…….61 Biểu đồ 3.1 So sánh hoạt độ amylase chủng CK…………………………………….…….46 Biểu đồ 3.2 Nồng độ tinh bột tan ảnh hưởng đến hoạt độ amylase………… ………53 Biểu đồ 3.3 Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt độ amylase……………………………… ….………54 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ amylase…………………………….…….…55 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng độ hiếu khí đến hoạt độ amylase………………….….…… 56 Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hoạt độ amylase……………………… 57 Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng nồng độ CaCl2 đến hoạt tính amylase…………………………….58 Biểu đồ 3.8 Nồng độ NaCl cao ức chế sinh trưởng…………………………………….……59 Biểu đồ 3.9 Hiệu suất thu nhận CPE amylase tác nhân tủa khác nhau……….62 Biểu đồ 3.10 Hoạt độ CPE amylase dùng tác nhân tủa…………….….…63 Biểu đồ 3.11 Độ bền nhiệt amylase…………………………………………………………………………64 Biểu đồ 3.12 Độ bền pH amylase………………………….…………………………………………………66 MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cám ơn Mục lục Các chữ viết tắt luận văn Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị biểu đồ Mở đầu…………………… …………………………………………………………………………………………………….……………1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………………………….……………….4 1.1 Giống vi khuẩn Bacillus ………………………………………………………………………………….…………… 1.2 Khái quát chung enzym ………………………………………………………………………….……………… 1.2.1 Enzym cảm ứng ………………………………………………………………………….………………….………9 1.2.2 Bản chất sinh học enzym ……………………………………………………………….….………9 1.2.3 Bản chất hoá học enzym……………………………………………………….………….……….10 1.2.4 Tính chất hoá học enzym……………………………………………………….………….………11 1.2.5 Cấu trúc enzym ……………………………………………………………….….……………………………….11 1.2.6 Cơ chế tác dụng enzym…………………………………………….…………….……….…………11 1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzym…………………………… 12 1.3 Hệ enzym amylase………………………………………………………………………….………………………………15 1.3.1 Giới thiệu enzym α – amylase ……………………………………………………………………….15 1.3.2 Nguồn thu nhận enzym amylase……………………………………………………………………….18 1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase VSV……….…19 1.3.4 Tách chiết enzym từ nguồn nguyên liệu…………………….……………………….22 1.3.5 Ứng dụng amylase thực tế sản xuất đời sống …………….……23 Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………….27 2.1 Vật liệu……………………………………………………………………………………………………………………………….27 2.2 Các môi trường sử dụng.………………………………………………………………………………28 2.3 Các phương pháp nghiên cứu………………………………………………………………………………….28 2.3.1 Phương pháp phân lập chủng Bacillus từ đất vườn qua cỏ khô….28 2.3.2 Phương pháp giữ giống cấy chuyền……………………………………….….……………… 29 2.3.3 Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học Bacillus…….29 2.3.4 Phương pháp xác định sinh trưởng theo mật độ quang…………………… 32 2.3.5 Phương pháp nghiên cứu khả phân huỷ tinh bột……………………………32 2.3.6 Phương pháp xác định hoạt độ α- amylase theo Heinkel, 1956………….33 2.3.7 Các phương pháp nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy………………….35 2.3.8 Phương pháp phân loại để xác định loài ……………………………………….….……….37 2.3.9 Phương pháp nghiên cứu động học……………………………………….….………………….38 2.3.10 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzym amylase từ môi trường…….39 2.3.11 Phương pháp thu nhận CPE α – amylase……………………………………………………39 2.3.12 Xác định hoạt độ CPE amylase thu từ tác nhân tủa……………41 2.3.13 Xác định độ bền CPE amylase……………………………………….….…………………41 2.3.14 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm……………………………………….……………42 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………………………… 46 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng có hoạt tính amylase cao………………… ….44 3.2 Xác định sinh trưởng hoạt độ amylase chủng CK…………… …45 3.3 Một số đặc điểm sinh học chủng CK2………………………………………………… ……47 3.4 Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp amylase…………….……………………………49 3.4.1 Loại chất ………………………………………………………………………………………………………… 49 3.4.2 Ảnh hưởng nồng độ tinh bột tan………………………………………………………………………52 3.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ ………………………………………………………………………………… 53 3.4.4 Ảnh hưởng pH ban đầu.……………………………………….…………………………………….54 3.4.5 Ảnh hưởng độ hiếu khí……………………………………………………………………………….55 3.4.6 Ảnh hưởng loại muối……………………………………………………………………………56 3.4.7 Nồng độ NaCl cao ức chế sinh trưởng……………………………………………… 59 3.5 Xác định tên chủng CK2 tuyển chọn……………………………………………………60 3.6 Nghiên cứu động học trình lên men………………………………………………… 60 3.7 Tách enzym từ dịch nuôi cấy, xác định hoạt độ độ bền enzym…62 3.7.1 Tách enzym từ dịch nuôi cấy với tác nhân tủa khác nhau…………….62 3.7.2 Hoạt độ CPE amylase thu tác nhân tủa…………………….63 3.7.3 Xác định độ bền nhiệt CPE amylase………………………………………… ……….64 3.7.4 Xác định độ bền pH CPE amylase…………………………………………………… …65 Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………….… 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………………………………….… 69 PHỤ LỤC…………………………………………………………………………………………………………………………………73 ... văn: ? ?Nghiên cứu thu nhận enzym α- amylase từ trực khuẩn cỏ khô? ?? Nội dung đề tài gồm số vấn đề sau: Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng sinh enzim amylase có hoạt tính mạnh từ đất... động enzym 1.3 Hệ enzym amylase [4], [8], [13], [16], [27], [44] Amylase thu? ??c hệ enzym thu? ?? phân (hydrolase) chúng thu? ?? phân liên kết α- 1,4 α- 1,6 glucoside tinh bột Từ xưa chủ yếu người ta thu nhận. .. trưởng hoạt độ enzym Tách chiết enzym amylase từ dịch lên men nhờ tác nhân tủa So sánh hiệu suất thu nhận hoạt độ chế phẩm enzym (CPE) amylase thu từ tác nhân tủa khác Nghiên cứu độ bền nhiệt