Nghiên cứu thu nhận enzyme a-amylase từ trực khuẩn cỏ khô

Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và sinh enzyme amylase có hoạt tính mạnh từ đất vườn qua trung gian cỏ khô.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ------------------------------------ NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM α – AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN CỎ KHÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ------------------------------------ NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM α – AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN CỎ KHÔ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. LƯƠNG ĐỨC PHẨM Thành phố Hồ Chí Minh – 2009 MỞ ĐẦU Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú. Chúng có mặt khắp nơi: trong đất, trong nước, trong không khí,… kể cả trong cơ thể con người. Ngoài tác hại do vi sinh vật gây ra như: gây bệnh cho thực vật, động vật và con người; thì nguồn lợi mà chúng mang lại cho chúng ta vô cùng to lớn nếu ta hiểu, biết và sử dụng chúng hợp lý. Các chủng vi sinh vật nói chung và vi khuẩn Bacillus nói riêng đã và đang được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: rượu, bia, công nghiệp dệt, thuộc da, bổ sung vào thức ăn cho gia súc để dễ tiêu hoá, thức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản, trong y học và nghiên cứu,… là nhờ khả năng sinh các loại enzym thuỷ phân của các chủng vi sinh vật này. Enzym là những chất xúc tác sinh học, ngoài những tính chất của một chất xúc tác nó còn có những tính chất ưu việt hơn như: có hiệu suất xúc tác rất cao ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường, có tính đặc hiệu cao. Các tính chất này vẫn được bảo tồn khi tách enzym ra khỏi hệ thống sống, hoạt động trong điều kiện invitro. Vì vậy, enzym ngày càng được sử dụng rộng rãi trong thực tế, với quy mô ngày càng lớn, dẫn đến việc hình thành và phát triển ngành công nghệ sản xuất enzym. Việc sử dụng enzym trong thực tế không chỉ có ý nghóa về kinh tế mà còn giải quyết nhiều vấn đề xã hội, các vấn đề bức xúc về môi trường. Trước kia, enzym thường được thu nhận từ tế bào thực vật hoặc động vật (chẳng hạn amylase được lấy từ hạt nảy mầm, protease từ nhựa đu đủ, dạ dày,…). Tuy nhiên quá trình sinh tổng hợp enzym ở động vật và thực vật gắn liền với sự trao đổi chất và nhu cầu của tế bào. Ngoài ra, người ta còn phải phá bỏ các tổ chức tế bào để tách chiết và thu nhận enzym. Như vậy, việc dùng tế bào động vật, thực vật làm nguồn nguyên liệu để thu nhận enzym là khá hạn chế, thiếu tính kinh tế và không đáp ứng được nhu cầu về số lượng enzym cần thiết cho sản xuất. Trong khi đó, ở vi sinh vật hầu như chứa đầy đủ các loại enzym và việc sử dụng nguồn enzym từ vi sinh vật mang lại lợi ích lớn hơn, cụ thể như nguồn nguyên liệu dùng để nuôi cấy vi sinh vật thường rẻ tiền hơn vì chúng thường là phế phụ phẩm công nông nghiệp (như cám, trấu, bã mía, bã khoai mỳ,…) hoặc nguồn nguyên liệu tự nhiên như dầu mỏ, khí đốt,… Mặt khác, điều kiện nuôi cấy dễ dàng, và enzym có hoạt tính cao hơn. Vì thế, khoảng 50 năm gần đây các chế phẩm enzym từ vi sinh vật đã dần thay thế các enzym có nguồn gốc thực vật, động vật. Trong hàng loạt các loại enzym khác nhau thì amylase là enzym phân giải tinh bột tạo đường cho các sinh vật. Từ những năm đầu thế kỷ 18 các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu về amylase và đến nay đã biết khá rõ về loại enzym này. Amylase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lónh vực sản xuất như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt,…Sản xuất amylase công nghiệp đã được chú ý từ rất lâu và ngày càng phát triển ở nhiều nước trên thế giới. Việt Nam chúng ta là một trong nhiều nước đã và đang có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzym amylase, nhưng nền công nghiệp sản xuất enzym ở nước ta chưa thật sự phát triển. Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi chọn đề tài cho luận văn: “Nghiên cứu thu nhận enzym α-amylase từ trực khuẩn cỏ khô”. Nội dung của đề tài gồm một số vấn đề sau: 1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và sinh enzim amylase có hoạt tính mạnh từ đất vườn qua trung gian cỏ khô. 2. Nghiên cứu hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc, và các đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn. 3. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu được dòch enzym amylase có hoạt độ cao. 4. Đònh danh chủng được tuyển chọn bằng kỹ thuật di truyền phân tử. 5. Nuôi cấy chủng đã tuyển chọn trong thiết bò bình lên men tam giác 1 lít với các điều kiện nuôi cấy tối ưu. Nghiên cứu động học quá trình sinh tổng hợp amylase với 3 thông số là pH, sinh trưởng và hoạt độ enzym. 6. Tách chiết enzym amylase từ dòch lên men nhờ các tác nhân tủa. 7. So sánh hiệu suất thu nhận và hoạt độ chế phẩm enzym (CPE) amylase thu được từ các tác nhân tủa khác nhau. 8. Nghiên cứu độ bền nhiệt và độ bền pH của CPE amylase. Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giống vi khuẩn Bacillus [5], [16], [38], [39] Bacillus là vi khuẩn Gram dương, hình que có kích thước khác nhau (0,5 – 2,5) ×(1,2 - 10) μm. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí. Là vi khuẩn dò dưỡng hoá năng, thu năng lượng nhờ sự oxi hoá các hợp chất hữu cơ, có chùm tiên mao giúp chúng có khả năng di động, sống hiếu khí hoặc hiếu khí tuỳ tiện. Bacillus có khả năng sinh bào tử, bào tử được hình thành khi tế bào đã trải qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hoặc khi thiếu chất dinh dưỡng. Mỗi tế bào sinh dưỡng sinh ra một bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng tự phân giải giải phóng bào tử. Các tế bào Bacillus đặc trưng là sinh bào tử màø vẫn giữ hình dáng trực khuẩn khi mang bào tử, trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn chỉ phình to một ít khi chứa bào tử. Tuỳ loài mà bào tử có thể nằm chính tâm, lệch tâm hay gần đầu tế bào. Bào tử có khả năng chòu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì vậy chúng có khả năng giữ ở trạng thái bào tử nhiều năm. Bào tử không phải cơ quan sinh sản mà là một trạng thái bảo vệ nòi giống, nó được tạo ra để giúp tế bào chòu được các điều kiện bất lợi của môi trường. Đó là dạng nghỉ của tế bào. Bào tử ở dạng tự do không có quá trình trao đổi chất, khi gặp điều kiện thuận lợi mỗi bào tử cho ra một tế bào sinh dưỡng. Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như Bacillus alcalophillus, hoặc với pH = 2 – 6 như Bacillus- acidocaldrius. Về nhiệt độ, có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (45 0 C – 75 0 C), hoặc ưa lạnh (5 0 C –25 0 C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ tối ưu là 34 0 C – 37 0 C. Hầu hết Bacillus không gây bệnh cho người và động vật. Một số loại gây bệnh cho côn trùng như Bacillus thuringiensis, B. poplliae, B. lentimorbus, B. cereus, B. anthracis (trong đó B. cereus và B. anthracis có thể gây bệnh cho người)…đa số còn lại trong tự nhiên là có ích. Bacillus có khả năng sinh enzym ngoại bào: α-amylase, protease kiềm, cellulase… và các enzym này được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp… Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên 1.1.1 Bacillus subtilis Bacillus subtilis được phát hiện và đặt tên vào năm 1872, nó phân bố phổ biến trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô nên Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô. Là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3 -5) × 0,6 μm, nhiều khi tế bào nối lại với nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc tế bào đứng riêng rẽ. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mòn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch. Nhiệt độ thích hợp cho Bacillus subtilis sinh trưởng là 30 0 C – 50 0 C, thường nuôi cấy ở 37 0 C. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6 – 0,9 μm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống bào tử B. subtilis trong 200-300 năm. Vi khuẩn B. subtilis có màng nhày (giác mạc) giúp vi khuẩn có khả năng chòu được điều kiện khắc nghiệt vì màng nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh tổn thương khi khô hạn. Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm tiêu bản, qua kính hiển vi chúng ta có thể nhìn thấy màng nhày của B. subtilis là không màu, trong suốt, còn tế bào vi khuẩn bắt màu nâu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen. B. subtilis có khả năng sinh ra một số enzym như: α-amylase, protease kiềm có giá trò cao, đặc biệt có khả năng tổng hợp riboflavin (tiền vitamin B 2 ). Vì vậy, B. subtilis được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp. 1.1.2. Bacillus mesentericus Bacillus mesentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do chúng có mặt chủ yếu trên khoai tây. Chúng gần giống Bacillus subtilis khuẩn lạc ăn sâu và bám chặt vào môi trường thạch, bề mặt nhăn nhúm, khô, không mọc lan ra môi trường, màu xám nhạt-trắng, hoặc hơi vàng nâu, hoặc hồng như Bacillus mensentericus ruber hoặc đen như Bacillus mensentericus niger . Bacillus mensentericus sinh trưởng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 36 – 45 0 C, tối đa 50 – 55 0 C, pH = 4,5 – 5 thì ngừng phát triển. Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn Bacillus subtilis, nhưng lên men đường lại kém hơn. Bacillus mensentericus và Bacillus subtilis rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các loại thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường (bánh kẹo, hoa quả). Ngoài ra, chúng còn sinh ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng một số vi khuẩn khác gọi là bacterioxin, ở Bacillus subtilis gọi là subtilin. 1.1.3. Bacillus cereus Vi khuẩn này có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, B. mycoides, B. thuringiensis. Bào tử của chúng hình bầu dục, kích thước 0,9 × (1,2 – 1,5) μm, nằm lệch tâm, phát tán khắp nơi, trong đất, trong không khí…Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng và gây ngộ độc thực phẩm. Tế bào của B. cereus dày, kích thước (1 -1,5) × (3 – 5) μm có khi dài hơn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. Khuẩn lạc của B. cereus phẳng, hơi lõm, bề mặt hơi xù xì (dạng bột, hoặc dạng hạt nhỏ) trắng đục, mép lồi lõm. 1.1.4. Bacillus megaterium Megaterium có nghóa là “con thú lớn”, tế bào của nó khá lớn khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, kích thước (1,2 – 1,5) × (3 – 12) μm. ƠÛ các ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dự trữ (hạt mỡ, glycogen). Bào tử lớn, hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 × (0,7 – 1) μm, chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc chiều xiên của tế bào. Khuẩn lạc tròn đều, lồi nhẵn nhưng thường có vòng viền quanh khuẩn lạc hoặc các vòng đồng tâm trên bề mặt, không thuỳ, không nếp, mép tròn đều hay lượn sóng, màu trắng sữa hay đục, có khi có màu nâu nhạt. Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kỳ yếu tố dinh dưỡng nào khác. 1.1.5. Bacillus pumilus Bào tử phát tán rộng, có mặt trong đất nhiều hơn Bacillus subtilis. Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của nó gần giống tế bào B. subtilis. 1.1.6. Bacillus polymyxa Kích thước tế bào là (0,6 – 1) × (2 – 7) μm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào sẽ phồng lên hình quả chanh. Bào tử hình bầu dục kéo dài khoảng (1,7 – 2,6 μm), trên bề mặt cắt ngang như hình sao, nằm giữa tế bào, chúng phát tán rộng. Khuẩn lạc của B. polymyxa vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thuỳ. Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bò hỏng. Vì vậy, người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. 1.1.7. Bacillus simplex Tế bào B. simplex nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) × 0,6 μm, thường đứng riêng rẽ không gắn thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,6 × 0,9 μm, nằm lệch tâm. Khuẩn lạc của B. simplex giống khuẩn lạc B. cereus, chỉ khác là khuẩn lạc của B. simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường. 1.1.8. Bacillus brevis B. brevis là trực khuẩn có kích thước (0,7 – 1,0) × (3 – 5) μm, đứng riêng rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi. Bào tử có hình bầu dục nằm cuối tế bào làm cho tế bào có một đầu hơi phồng to. Khuẩn lạc của B. brevis màu trắng, đôi khi có màu vàng, lồi hoặc phẳng, lấp lánh, mép răng cưa giống như dạng mỡ đặc. 1.1.9. Bacillus aslersporus Tế bào dày (1,0–1,2) × (3 –7) μm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi. Bào tử hình trụ hay hình kéo dài, kích thước 1,0 × (1,5–2) μm, nằm giữa tế bào. Khi hình thành bào tử tế bào phồng lên một chút trông giống như dạng Clostridium. Khuẩn lạc của B. aslersporus nhỏ, màu trắng hay màu lục nhạt, phẳng, mềm, nhày, đồng chất. 1.2. Khái quát chung về enzym [1], [4], [15], [23], [49]. Sinh vật được xem như là một hệ thống mở có liên quan chặt chẽ đến quá trình trao đổi chất trong tế bào của cơ thể, và giữa cơ thể với môi trường ngoài. Quá trình trao đổi chất của sinh vật là biểu hiện sinh động nhất của sự sống. Khi cơ thể không còn khả năng trao đổi chất thì cơ thể sẽ chết. Quá trình trao đổi chất liên tục được xảy ra giữa trong và ngoài tế bào, tạo nên sự biến đổi liên tục [...]... chế hoạt động của enzym 1.3 Hệ enzym amylase [4], [8], [13], [16], [27], [44] Amylase thu c hệ enzym thu phân (hydrolase) chúng thu phân các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside của tinh bột Từ xưa chủ yếu người ta thu nhận amylase từ malt, nhưng ngày nay việc thu nhận chủ yếu từ nuôi cấy VSV Cũng như nhiều VSV khác, vi khuẩn Bacillus tạo ra rất nhiều enzym ngoại bào như: amylase, protease, celullase,... vòng thu phân tinh bột 2.3 Các phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phân lập các chủng Bacillus từ đất vườn qua trung gian cỏ khô [5], [17] Lấy một ít đất vườn (10g) cho vào bình tam giác và thêm 90ml nước cất vô trùng lắc đều để tạo huyền phù, gia nhiệt tới 850C trong 20 – 25 phút Cắt nhỏ một ít cỏ khô, rắc xung quanh cỏ ít bột CaCO3 rồi cho vào bình tam giác trên sao cho nước vừa ngập cỏ, để từ. .. giá thành cao Hiện nay phần lớn enzym đều được thu nhận từ vi sinh vật, vì có những điểm nổi bật sau: - VSV có tốc độ sinh trưởng, phát triển và sinh sản cực kỳ nhanh, từ đó tổng hợp enzym với cường độ rất mạnh, nên trong một thời gian ngắn có thể thu được một lượng enzym rất lớn - Hệ enzym của VSV rất phong phú, từ các chủng VSV khác nhau ta có thể thu nhận được nhiều loại enzym khác nhau, trong đó... hiện khuẩn lạc thì nhỏ một giọt dung dòch H2O2 10% lên khuẩn lạc Nếu thấy có bọt khí xuất hiện thì chứng tỏ có catalase trong tế bào, và kết luận là chủng vi khuẩn hiếu khí  Quan sát đặc điểm khuẩn lạc [17] Quan sát một số chỉ tiêu của chủng nghiên cứu trên môi trường nuôi Bacillus: - Khả năng phát triển của khuẩn lạc - Bề mặt khuẩn lạc - Màu sắc khuẩn lạc  Làm tiêu bản tế bào sống [5] Loại tiêu bản... và tăng hiệu suất do khả năng thu phân sâu sắc của phức hệ enzym VSV Vai trò của α-amylase trong sản xuất rượu là làm dòch hoá nhanh ở giai đoạn nấu và ở cả giai đoạn đầu của sự đường hoá, dextrin hoá và tích tụ đường Enzym amylase được thu nhận từ nấm mốc Aspergillus usamii, A awamori, A oryzae và từ vi khuẩn Bacillus subtilis, B diastaticus Sản phẩm cuối cùng của sự thu phân tinh bột nhờ amylase... dung dòch bền vững chứa α-amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy rất cao Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng Là các chủng trực khuẩn được phân lập từ đất vườn qua trung gian cỏ khô 2.1.2 Dụng cụ Các dụng cụ, thiết bò của phòng thí nghiệm Vi sinh – sinh hoá Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh Thiết bò gồm có: Tủ cấy... phẩm chủ yếu là dextrin phân tử lượng thấp (phản ứng không màu với iod), ngoài ra còn có maltose, và một ít glucose Vì vậy, người ta gọi α-amylase là amylase dextrin hoá hay amylase dòch hoá 1.3.2 Nguồn thu nhận enzym amylase Enzym có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật, vi sinh vật (VSV) Tuy nhiên việc khai thác enzym từ thực vật, động vật thường gặp khó khăn vì nguồn nguyên... thái, đếm số lượng vi khuẩn Những tiêu bản này có thể giữ được lâu • Nguyên tắc: Khả năng bắt màu của VSV có liên quan đến muối Magie của acid Ribocleic Khi nhuộm muối này có phản ứng với thu c nhuộm loại tryphenylmetan (gelatin violet, oryatan violet, metyl violet) và không bò mất màu dưới tác dụng của cồn Những vi khuẩn như thế gọi là vi khuẩn Gram dương, ngược lại những vi khuẩn không giữ được màu... phút, rồi đổ thu c đi và tráng bằng nước cất Sau đó rửa bằng cồn 96o trong thời gian khoảng 30-40 giây Rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi Sau đó nhuộm bổ sung bằng Fucshin loãng khoảng 1-2 phút Rửa lại bằng nước cất cho đến khi hết màu rồi đợi khô Quan sát dưới kính hiển vi quang học, nếu vi khuẩn nhuộm màu tím là vi khuẩn Gram dương, ngược lại vi khuẩn nhuộm màu hồng là vi khuẩn Gram... protease của vi khuẩn, vì các loại enzym thu nhận từ vi khuẩn thường có hoạt tính cao và khả năng chòu nhiệt độ cao rất tốt mà nhiệt độ cao thường làm biến tính enzym trong malt Người ta sử dụng rộng rãi chế phẩm enzym amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae, A niger, A awamori,…và của vi khuẩn Bacillus subtilis, B diastaticus,…để đường hoá thay malt Dùng amylase VSV có thể thay thế từ 50100% malt bằng . phát triển. Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi chọn đề tài cho luận văn: Nghiên cứu thu nhận enzym α-amylase từ trực khuẩn cỏ khô . Nội dung của đề. ------------------------------------ NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM α – AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN CỎ KHÔ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60