Với các điều kiện tối ưu đã xác định được ở mục 2.3.7 sẽ tiến hành nuơi cấy chủng sản – chủng đã tuyển chọn cĩ hoạt độ enzym α - amylase cao nhất - trong bình lên men tam giác 1lít. Chúng tơi sẽ nghiên cứu động học quá trình sinh tổng hợp α – amylase với 3 thơng số là pH, sinh trưởng và hoạt độ amylase. Qua các mốc thời gian: 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70h tiến hành đo pH, đo
OD620 khả năng sinh trưởng, và ly tâm tách sinh khối để đo hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel.
2.3.10. Phương pháp thu dịch chiết α – amylase thơ từ mơi trường nuơi cấy [7],[11].
Sau khi thu nhận được dịch nuơi cấy vi khuẩn, đem ly tâm 5000 vịng/ phút trong 15 phút để loại bỏ sinh khối, thu nhận phần dịch bên trên, dung dịch này được sử dụng như dịch enzym α – amylase thơ và được bảo quản ở 40C.
2.3.11. Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym (CPE) α - amylase từ dịch chiết enzym thơ bằng các tác nhân tủa [4], [11]
Các tác nhân tạo tủa enzym thường được sử dụng là các dung mơi hữu cơ: etanol, aceton; muối trung tính (NH4)2SO4 để thu nhận chế phẩm enzym từ dịch chiết enzym thơ. Từ đĩ so sánh và chọn tác nhân gây tủa thích hợp.
Nguyên tắc: dựa vào tính hồ tan của protein. Trong phân tử protein cĩ
đồng thời các nhĩm kỵ nước (gốc alkyl) làm cho protein khơng tan trong nước, và nhĩm ưa nước (-COOH, -OH,…) làm cho protein tan trong nước. Các tác nhân tủa enzym cĩ thể ảnh hưởng đến tính hồ tan của protein như sau:
• Dung mơi hữu cơ: chúng cĩ thể hồ tan hoặc gây tủa protein. Ví dụ khi thêm những chất làm tăng hằng số điện mơi của nước như glycin, làm tăng khả năng ion hố từ đĩ tăng độ hồ tan của protein. Ngược lại, nếu thêm chất làm giảm hằng số điện mơi của nước như etanol, aceton,…sẽ làm giảm tính hồ tan của protein.
• Muối trung tính: nồng độ muối quá cao sẽ làm giảm độ hồ tan của protein. Tĩm lại, nguyên nhân gây tủa protein là do lớp hydrate bao phủ protein bị tác nhân gây tủa giành lấy. Các protein bị mất vỏ hydrate sẽ kết hợp với nhau và kết tủa xuống. Do đĩ, đưa tác nhân tủa dần dần vào dung dịch enzym thơ theo từng nồng độ khác nhau để thu nhận từng loại protein.
Cách tiến hành
• Đối với các tác nhân tủa là etanol 96o, aceton
Dùng 600 ml dịch enzym thơ, chia làm hai phần bằng nhau, một phần tủa với etanol, phần cịn lại tủa với aceton. Dịch chiết enzym và các dung mơi hữu cơ đều được giữ lạnh khoảng 4oC. Cho từ từ etanol 96o hoặc aceton vào dịch chiết enzym với tỉ lệ thể tích dung mơi và dịch chiết enzym là 3:1. Khuấy đều hỗn hợp và để yên trong điều kiện lạnh khoảng 1h, sau đĩ đem ly tâm với 5000 vịng/phút trong 15 phút. Thu lấy phần cặn tủa, sấy khơ bằng cách thổi quạt giĩ ở < 40oC (vì nước tồn tại trong đĩ sẽ làm giảm hoạt độ enzym), cân trọng lượng chế phẩm enzym, và bảo quản trong điều kiện lạnh.
• Đối với tác nhân tủa là muối sunphat amon
Lấy 300 ml dịch enzym thơ đem tủa với muối sunphat amon (47,2g/100ml dịch enzym). Muối sunphat amon được cho từ từ lượng nhỏ vào dịch chiết enzym và khuấy đều ở nhiệt độ phịng. Thời gian tủa là 2 giờ, sau đĩ đem ly tâm 5000 vịng/phút trong 15 phút để lấy tủa. Tủa được sấy khơ ở < 400C, cân trọng lượng rồi cho vào túi dialise thẩm tích để loại muối trong nước cất ở điều kiện lạnh. Thu lấy phần cịn lại trong túi đem sấy khơ, thổi giĩ < 400C, cân chế phẩm enzym và bảo quản lạnh.
- Cách tiến hành thẩm tích bằng túi dialise: cân trọng lượng túi bán thấm dialise, và cân lượng CPE được tủa bằng muối (NH4)2SO4 cho CPE vào túi bán thấm. Tiếp tục cho túi này vào một cốc thuỷ tinh cĩ đựng nước cất để lạnh. Khuấy và thay nước lạnh thường xuyên (5-6 lần trong một ngày đêm, túi này chỉ cho chất cĩ phân tử lượng nhỏ thẩm tích qua túi mà giữ lại những chất cĩ phân tử lượng lớn như protein, enzym). Sấy quạt giĩ làm khơ túi ở < 400C, cân lại trọng lượng túi.
Những vấn đề cần lưu ý khi tủa enzym
- Chúng ta phải cho từ từ tác nhân tủa vào dung dịch enzym thơ bằng cách sử dụng pipet nhỏ từng giọt, mục đích là tránh hiện tượng tủa cục bộ. Vì nếu thêm vào một lượng lớn tác nhân tủa sẽ tạo ra nồng độ quá cao ngay tại vùng tiếp xúc trong dung dịch enzym, điều đĩ sẽ dẫn đến tủa cục bộ tại một vị trí đĩ, và cĩ thể làm biến tính bất thuận nghịch.
- Khi thêm tác nhân tủa vào cần phải lắc đều để tăng độ khuếch tán vào dung dịch enzym thơ.
2.3.12. Xác định hoạt độ chế phẩm enzym (CPE) amylase thu được từ các tác nhân tủa [4]
Cân 0,1g CPE amylase từ mỗi tác nhân tủa pha với 50ml nước cất, rồi tiếp tục pha lỗng tới nồng độ thích hợp. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel.
2.3.13. Xác định độ bền của CPE amylase [12], [20], [33] 2.3.13.1. Độ bền nhiệt của amylase 2.3.13.1. Độ bền nhiệt của amylase
Amylase được giữ trong dung dịch đệm cĩ pH 6, ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-1000C (mỗi bước nhảy 100C) trong 1 giờ. Sau đĩ xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Độ bền của dịch enzym được đánh giá bằng số phần trăm hoạt độ cịn lại trong các dịch đã xử lý nhiệt độ, mẫu đối chứng là hoạt độ amylase của dịch enzym khơng xử lý nhiệt độ và giữ ở 40C.
2.3.13.2. Độ bền pH của amylase
Dịch amylase được giữ trong dung dịch đệm cĩ pH khác nhau từ 4,0-8,0 (mỗi bước nhảy là 0,5) trong 1 giờ ở 300C theo tỉ lệ 1:1. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Độ bền của dịch enzym được đánh giá bằng số phần trăm hoạt độ cịn lại trong các dịch đã xử lý pH, mẫu đối chứng là hoạt độ amylase của dịch enzym khơng xử lý pH và giữ ở pH 6.
2.3.14. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm [4].
Sử dụng cách tính tốn thống kê để xử lý các số liệu thực nghiệm thu được.
• Xác định giá trị trung bình
Giá trị trung bình của các số liệu là tổng giá trị thực của mỗi lần đo chia cho số lần đo: n x x n i =
Trong đĩ: x : giá trị trung bình
i (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
x : giá trị của một lần đo n : số lần đo
Nếu thực hiện sự đo đạc lặp lại nhiều lần trên một mẫu thí nghiệm thì chúng ta cĩ thể tiệm cận đến một giá trị trung bình thật. Để giá trị trung bình của các lần đo như là một giá trị gần đúng với giá trị trung bình thật, ta phải dùng phương pháp thống kê để đánh giá mức độ chính xác của các lần đo.
• Tính tốn độ lệch mẫu và độ lệch chuẩn
o Độ lệch mẫu (Sample deviation): Là sự khác biệt giữa giá trị của một lần
đo với giá trị trung bình.
Độ lệch mẫu = xi - x
Trong đĩ: xi : giá trị của một lần đo. x : giá trị trung bình.
o Độ lệch chuẩn (Standard deviation): sự sai số cĩ thể cĩ trong một lần đo
S ( )2 i 1 n x x − − = Với S : độ lệch chuẩn i
x : giá trị của một lần đo x : giá trị trung bình n : số lần đo
Vậy giá trị trung bình cĩ thể diễn đạt như sau: x±S
Độ lệch chuẩn cĩ thể chuyển đổi thành độ lệch chuẩn của giá trị trung bình hay cịn gọi là sai số chuẩn được ký hiệu là Sm.
Sm
n S
= S: độ lệch chuẩn; n: số lần đo.
Cơng thức trên cho thấy, số lần đo càng lớn (n càng lớn) thì độ lệch chuẩn của giá trị trung bình (Sm) càng nhỏ, hay mức độ chính xác của lần đo đạc càng cao.
Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng trực khuẩn cĩ hoạt tính amylase cao
Từ mẫu cỏ khơ và đất vườn chúng tơi tiến hành phân lập theo phương pháp ở mục 2.3.1, thu được 17 chủng thuần. Tiếp tục xác định hoạt tính amylase theo phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch như ở mục 2.3.5. Từ kết quả đo đường kính vịng phân giải tinh bột chúng tơi chọn 3 chủng cĩ hoạt tính amylase cao, ký hiệu: CK1, CK2, CK3. Kết quả trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1
Bảng 3.1. Đường kính vịng phân giải tinh bột của 3 chủng CK
Chủng D-d (mm)
CK1 20
CK2 22
CK3 25
Hình 3.1. Vịng phân giải tinh bột của 3 chủng CK
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 20 30 35 40 45 50 55 60 70 Thời gian (h) OD 62 0 CK1 CK2 CK3
3.2. Xác định sự sinh trưởng và hoạt độ amylase của 3 chủng CK đã chọn 3.2.1. Xác định sự sinh trưởng của 3 chủng CK 3.2.1. Xác định sự sinh trưởng của 3 chủng CK
Chúng tơi tiến hành nuơi mỗi chủng trong mơi trường MPA lỏng trên máy lắc 200 vịng/phút ở 370C. Tiến hành đo OD620 xác định khả năng sinh trưởng của mỗi chủng theo mỗi mốc thời gian: 20,30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70 giờ. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 và đồ thị 3.1.
Bảng 3.2. Sự sinh trưởng của 3 chủng CK OD620 Thời gian (h) CK 1 CK 2 CK 3 20 0,575 0,711 0,637 30 0,679 0,868 0,855 35 0,808 1,242 1,128 40 0,955 1,483 1,320 45 1,126 1,468 1,284 50 1,104 1,436 1,217 55 1,051 1,355 1,149 60 0,985 1,224 0,986 70 0,847 1,113 0,829
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 CK1 CK2 CK3 Chủng Hoạ t đ ộ am yl as e (U I/ m l)
Từ kết quả trên cho thấy cả 3 chủng CK đều sinh trưởng tốt, tuy nhiên chủng CK2 cĩ khả năng sinh trưởng cao hơn, và thời gian sinh trưởng cao nhất của CK2 vào lúc 40h. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.2. Xác định hoạt độ amylase của 3 chủng CK
Chúng tơi tiến hành nuơi mỗi chủng trong mơi trường cảm ứng sinh amylase dạng lỏng trên máy lắc 200 vịng/phút ở 370C. Sau thời gian khoảng 45- 50 giờ chúng tơi tiến hành thí nghiệm đo hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Kết quả như sau:
Bảng 3.3. So sánhhoạt độ amylase của 3 chủng CK
Chủng Hoạt độ amylase (UI/ml)
CK1 10,398 ± 0,239
CK2 16,168 ± 0,147
CK3 9,119 ± 0,089
Biểu đồ 3.1. So sánhhoạt độ amylase của 3 chủng CK
Qua kết quả trên thì chủng CK2 cho hoạt độ amylase cao nhất. Vậy từ 3 chủng trên chúng tơi chọn chủng CK2 cĩ khả năng sinh trưởng và tạo amylase cĩ hoạt độ cao để tiếp tục nghiên cứu.
3.3. Một số đặc điểm sinh học của chủng CK2 3.3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 3.3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Chúng tơi tiến hành cấy dàn chủng CK2 lên bề mặt thạch mơi trường MPA của đĩa petri. Sau đĩ để vào tủ ấm 340C trong 24 giờ để thu các khuẩn lạc riêng biệt. Kết quả được nêu trong hình 3.2
Qua quan sát chúng tơi nhận thấy khuẩn lạc chủng CK2 cĩ đặc điểm là: khuẩn lạc khơ, màu trắng đục, mặt khuẩn lạc mịn, mép nhăn, bám vào mơi trường thạch.
3.3.2. Đặc điểm hình thái tế bào chủng CK2
Sau 24 giờ nuơi cấy chúng tơi tiến hành làm tiêu bản sống chủng CK2 và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, nhận thấy chủng CK2 cĩ tế bào hình que, ngắn, nhỏ, đứng riêng rẽ. Nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi với độ phĩng đại 100X, chúng tơi nhận thấy chủng CK2 bắt màu tím. Điều đĩ chứng tỏ chủng này là vi khuẩn Gram dương. Kết quả thu được ở hình 3.3
Hình 3.3. Hình thái tế bào chủng CK2
3.3.3. Khả năng hình thành bào tử của chủng CK2
Nuơi chủng CK2 trên mơi trường MPA ở tủ ấm 340C, sau 5 ngày nhuộm bào tử theo phương pháp như đã trình bày ở mục 2.3.3. Kết qủa quan sát dưới kính hiển vi chúng tơi nhận được hình 3.4
Hình 3.4. Bào tử của chủng CK2
3.3.4. Nghiên cứu khả năng sinh enzym catalase
Chúng tơi tiến hành nuơi cấy chủng CK2 trên bề mặt thạch mơi trường MPA, trong tủ ấm ở 340C. Sau 24 giờ khi thấy xuất hiện khuẩn lạc nhỏ lên khuẩn lạc 1 giọt H2O2 10% thì thấy xuất hiện bọt khí, chứng tỏ chủng CK2 cĩ khả năng sinh enzym catalase: H2O2 H2O + O2↑. Phân tử oxy sinh ra làm phản ứng tạo ra bọt khí, vậy chủng CK2 là vi khuẩn hiếu khí.
Tĩm tắt một số đặc điểm sinh học của chủng CK2
Bảng 3.4. Một số đặc điểm sinh học của chủng CK2
Đặc điểm Chủng CK2
Hình thái khuẩn lạc Khơ, màu trắng đục, mặt khuẩn lạc mịn,
mép hơi nhăn, bám vào mơi trường thạch.
Hình thái tế bào Hình que, ngắn, nhỏ, đứng riêng rẽ
Phân giải tinh bột + (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gram +
Hình thành nội bào tử +
Khả năng phân giải H2O2 +
Nhu cầu về oxy +
3.4. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp α – amylase của chủng CK2.
3.4.1. Loại cơ chất
Chúng tơi tiến hành nuơi cấy chủng CK2 trong mơi trường lỏng sinh tổng hợp enzym α – amylase cĩ chất cảm ứng khác nhau: bột gạo, bột mỳ, bột bắp, tinh bột tan ở nhiệt độ 37oC với chế độ lắc 200 vịng/phút. Sau mỗi mốc thời gian: 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70 giờ đo OD620 xác định khả năng sinh trưởng, và ly tâm loại bỏ sinh khối ở 5000 v/p trong 15 phút để xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và đồ thị 3.2.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng loại cơ chất đến hoạt độ amylase Thời gian
(h) Cơ chất OD620 Hoạt độ amylase (UI/ml)
Bột gạo 0,672 2,221 ± 0,05 Bột mỳ 0,655 3,819 ± 0,045 Bột bắp 0,798 3,920 ± 0,034 20 Tinh bột tan 0,841 4,913 ± 0,034 Bột gạo 0,734 4,172 ± 0,017 Bột mỳ 0,711 5,131 ± 0,073 Bột bắp 0,943 6,326 ± 0,089 30 Tinh bột tan 1,055 7,403 ± 0,067 Bột gạo 1,203 6,477 ± 0,045 Bột mỳ 1,121 6,545 ± 0,034 Bột bắp 1,286 8,059 ± 0,061 40 Tinh bột tan 1,502 10,263 ± 0,045 Bột gạo 1,155 8,311± 0,045 Bột mỳ 1,100 7,672 ± 0,077 Bột bắp 1,206 10,212 ± 0,073 45 Tinh bột tan 1,488 14,890 ± 0,058 Bột gạo 1,045 8,227 ± 0,077 Bột mỳ 0,962 7,537 ± 0,034 Bột bắp 1,131 10,128 ± 0,061 50 Tinh bột tan 1,374 14,654 ± 0,073
0 2 4 6 8 10 12 14 16 20 30 40 45 50 55 60 70 Thời gian (h) Ho ạ t độ am yl a se ( U I/ m l) Bột gạo Bột mỳ Bột bắp Tinh bột tan Bột gạo 0,964 8,008 ± 0,034 Bột mỳ 0,902 7,453 ± 0,017 Bột bắp 1,067 9,960 ± 0,045 55 Tinh bột tan 1,228 14,419 ± 0,034 Bột gạo 0,876 7,722 ± 0,077 Bột mỳ 0,844 7,319 ± 0,058 Bột bắp 0,981 9,186 ± 0,058 60 Tinh bột tan 1,163 13,796 ± 0,089 Bột gạo 0,711 7,134 ± 0,089 Bột mỳ 0,689 6,578 ± 0,045 Bột bắp 0,843 8,446 ± 0,017 70 Tinh bột tan 0,936 12,517 ± 0,050
Bảng 3.5. Ảnh hưởng loại cơ chất đến hoạt độ amylase (tiếp theo)
Chủng CK2 đã chọn khi nuơi cấy với các loại cơ chất khác nhau đều sinh trưởng tốt nhất vào thời gian là 40h. Tuy nhiên với cơ chất là tinh bột tan thì chủng CK2 sinh trưởng cao hơn hẳn là 1,502, và cũng loại cơ chất này thì hoạt độ amylase cũng cao nhất khi thời gian nuơi cấy được 45 - 50h. Từ kết quả trên cĩ thể thấy nguồn cơ chất thích hợp cho chủng CK2 sinh trưởng và sinh enzym amylase được sắp xếp theo thứ tự như sau: Tinh bột tan > bột bắp > bột gạo > bột mỳ. Vậy chủng CK2 cĩ thời gian sinh trưởng cao nhất lúc nuơi cấy được 40h và hoạt độ amylase cao nhất lúc 45-50h.
3.4.2. Ảnh hưởng nồng độ tinh bột tan
Từ kết quả trên cho thấy tinh bột tan là nguồn cơ chất thích hợp nhất để chủng CK2 sinh amylase cĩ hoạt độ cao. Tuy nhiên nồng độ khác nhau của cơ