Phương pháp nhuộm Gram [18]
Với mục đích chọn các chủng cĩ khả năng nhuộm màu Gram (+). Đây là phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu được sử dụng phổ biến để quan sát đặc điểm hình thái, đếm số lượng vi khuẩn. Những tiêu bản này cĩ thể giữ được lâu.
• Nguyên tắc: Khả năng bắt màu của VSV cĩ liên quan đến muối Magie của
acid Ribocleic. Khi nhuộm muối này cĩ phản ứng với thuốc nhuộm loại tryphenylmetan (gelatin violet, oryatan violet, metyl violet) và khơng bị mất màu dưới tác dụng của cồn. Những vi khuẩn như thế gọi là vi khuẩn Gram dương, ngược lại những vi khuẩn khơng giữ được màu khi nhuộm gọi là vi khuẩn Gram âm.
• Cách tiến hành: Cho một giọt nước cất lên phiến kính, dùng que cấy vơ
phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, chú ý khơng để phiến kính nĩng quá vì như thế tế bào vi khuẩn sẽ bị biến dạng. Khi giọt nước bay hơi dần vi khuẩn sẽ gắn chặt vào phiến kính.
Nhuộm màu nhờ tím Gentian bằng cách nhỏ thuốc nhuộm này lên vết bơi, giữ 1-2 phút rồi rửa bằng nước cất. Tiếp theo nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản để trong 1 phút, rồi đổ thuốc đi và tráng bằng nước cất. Sau đĩ rửa bằng cồn 96o trong thời gian khoảng 30-40 giây. Rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khơ vết bơi.
Sau đĩ nhuộm bổ sung bằng Fucshin lỗng khoảng 1-2 phút. Rửa lại bằng nước cất cho đến khi hết màu rồi đợi khơ.
Quan sát dưới kính hiển vi quang học, nếu vi khuẩn nhuộm màu tím là vi khuẩn Gram dương, ngược lại vi khuẩn nhuộm màu hồng là vi khuẩn Gram âm.
Phương pháp nhuộm bào tử [11]
Bào tử vi khuẩn khơng phải là cơ quan sinh sản và thường cĩ 2 dạng: hình cầu và hình bầu dục. Khi tế bào sống trong mơi trường khơng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển hoặc khi tế bào đã trải qua giai đoạn phát triển mạnh nhất thì bào tử được hình thành.
• Nguyên tắc: Khi tế bào được xử lý bằng nhiệt hay/và acid thì tế bào chất
của bào tử rất dễ bắt màu. Nhuộm cả tế bào chất của bào tử và tế bào với thuốc nhuộm cĩ hoạt tính nhuộm mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất của tế bào và nhuộm nĩ với một thuốc nhuộm phân biệt khác. Khi đĩ tế bào chất mang một màu và bào tử sẽ mang màu khác.
• Cách tiến hành: Nuơi vi khuẩn trên mơi trường MPA đặc trong tủ ấm
34oC, sau 5 ngày làm vết bơi trên một phiến kính sạch và để khơ tự nhiên.
Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bơi, hơ nĩng trên ngọn lửa đèn cồn cho bốc hơi trong 2 phút rồi rửa với nước.
cho đến bốc hơi trong vịng 5 phút. Rửa vết bơi bằng nước. Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút. Rửa vết bơi bằng nước.
Nhuộm vết bơi bằng xanh methylene trong 5-15 phút. Rửa lại với nước và để khơ tự nhiên.
Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (×100). Bào tử sẽ mang màu đỏ, tế bào sinh dưỡng mang màu xanh.
Phương pháp phát hiện hoạt tính catalase [19]
Phương pháp này dùng để xác định vi khuẩn hiếu khí. Trước khi thử hoạt tính catalase cần phải tiến hành cấy dàn vi khuẩn trên đĩa petri cĩ mơi trường MPA đặc, nuơi trong tủ ấm 340C. Sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì nhỏ một giọt dung dịch H2O2 10% lên khuẩn lạc. Nếu thấy cĩ bọt khí xuất hiện thì chứng tỏ cĩ catalase trong tế bào, và kết luận là chủng vi khuẩn hiếu khí.
Quan sát đặc điểm khuẩn lạc [17]
Quan sát một số chỉ tiêu của chủng nghiên cứu trên mơi trường nuơi
Bacillus: - Khả năng phát triển của khuẩn lạc. - Bề mặt khuẩn lạc.
- Màu sắc khuẩn lạc.
Làm tiêu bản tế bào sống [5]
Loại tiêu bản này dùng để xem hình dạng, kích thước và sự sắp xếp các tế bào, khả năng hình thành bào tử.
• Cách tiến hành: Lấy một phiến kính khơ và sạch đặt lên giá đỡ, nhỏ một
giọt nước cất lên giữa phiến kính. Dùng que cấy lấy một ít VSV mọc trên mơi trường đặc MPA hồ nhẹ vào giọt nước trên phiến kính để tạo huyền phù. Đậy nhẹ lá kính để tránh tạo thành bọt khí. Dùng giấy thấm hút lượng nước thừa ở quanh lá kính. Mọi thao tác phải ở cạnh ngọn lửa đèn cồn, và mọi dụng cụ phải được làm sạch, vơ trùng. Sau đĩ đặt tiêu bản lên bàn kính và quan sát với vật kính 40X.
2.3.4. Phương pháp xác định sự sinh trưởng của vi khuẩn theo mật độ quang [11], [25]
• Nguyên tắc: Phương pháp xác định nồng độ tế bào bằng máy so màu quang (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
học được sử dụng rộng rãi. Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch cĩ vật chất lơ lửng. Để đánh giá tốc độ phát triển của vi khuẩn ta cĩ thể đo sự tăng sinh khối qua giá trị OD (Optical Density) ở bước sĩng 620nm (OD620).
• Cách tiến hành: Sau khi nuơi cấy vi khuẩn trong mơi trường lỏng với các
điều kiện phù hợp với mục đích thí nghiệm trên máy lắc, thì lấy dịch sau nuơi cấy đo OD bằng máy so màu ở bước sĩng 620nm. Tất cả dịch nuơi cấy đều được pha lỗng 10 lần trước khi đo OD620.
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu khả năng phân huỷ tinh bột [17], [20]
Sử dụng phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch.
• Nguyên tắc: Enzym ngoại bào α-amylase cĩ khả năng phân huỷ tinh bột
tạo ra đường, mà tinh bột là một polysaccharide cĩ cấu trúc khơng gian tương đối phức tạp. Khi mơi trường chứa tinh bột được nhuộm bằng iod, iod được giữ lại trong cấu trúc mạng khơng gian của tinh bột và làm cho mơi trường cĩ màu xanh đậm. Nếu VSV cĩ khả năng phân giải tinh bột thì cấu trúc khơng gian của tinh bột bị phá vỡ, nên xuất hiện vịng phân giải trong suốt.
• Cách tiến hành: Nuơi vi khuẩn trên mơi trường cảm ứng sinh tổng hợp
amylase dạng lỏng ở 37oC trên máy lắc với chế độ lắc 200 vịng/phút. Sau 36- 40h lấy các dịch nuơi đĩ đem ly tâm với chế độ 5000 vịng/phút trong 15 phút để thu dịch enzym.
Tiếp theo, đổ mơi trường đặc thử hoạt tính amylase cĩ chứa 1% tinh bột đã được khử trùng vào đĩa petri, chờ cho mơi trường nguội và đơng lại. Sau đĩ dùng khuyên đục lỗ (đường kính khoảng 1cm) đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt mơi trường tạo thành các giếng.
Dùng pipet Man hút dịch enzym nhỏ vào các giếng trong đĩa petri. Gĩi đĩa lại và đặt vào tủ lạnh 3-4h để dịch trong giếng khuếch tán đều, sau đĩ đặt vào tủ ấm 34oC.
Sau 24h dùng dung dịch Lugol đổ lên mơi trường cĩ chứa tinh bột. Nếu cĩ enzym amylase thì xuất hiện vùng chưa bị phân giải cĩ màu xanh mực, và vùng trong suốt xung quanh giếng là do tinh bột bị phân giải bởi amylase. Tiến hành đánh giá khả năng sinh amylase bằng cách đo đường kính vịng phân giải tinh bột của amylase.
2.3.6. Phương pháp xác định hoạt độ α- amylase theo Heinkel, 1956 [7]
• Nguyên tắc
Amylase xúc tác phản ứng thuỷ giải tinh bột thành đường (đường đơn, đường đơi, hay dextrin phân tử lớn). Lượng tinh bột cịn lại phản ứng màu với iod. Xác định lượng tinh bột bị thuỷ giải, từ đĩ suy ra hoạt độ amylase theo định nghĩa:
Hoạt độ amylase được biểu thị là số mg tinh bột bị thuỷ giải bởi 1ml dịch enzym (hay 1mg nguyên liệu chứa enzym) trong 1 phút ở điều kiện chuẩn là 500C, pH=6.
• Hố chất
Dung dịch NaH2PO4 0,05M Dung dịch Na2HPO4 0,05M
Dung dịch đệm phosphate 0,05M pH 6: trộn 87,7ml dung dịch NaH2PO4 0,05M và 12,3ml dung dịch Na2HPO4 0,05M thêm 100ml nước cất, đo lại pH.
Dung dịch tinh bột 1% pha trong pH 6: lấy 50ml dung dịch đệm phosphate 0,05M pH 6 đem đun sơi. Cân 1g tinh bột tan, hồ vào một ít đệm, khuấy đều, đổ vào dung dịch đệm đang sơi, vừa khuấy vừa đun sơi trong 3 phút cho đến khi dung dịch trong suốt. Định mức tới 100ml bằng dung dịch đệm.
dùng pha lỗng 500 lần.
Dung dịch HCl 1N: 8,4ml HCl đậm đặc pha thành 100ml. Dung dịch HCl 0,1N: pha lỗng từ dung dịch HCl 1N.
• Tiến hành thí nghiệm
Dựng đường chuẩn tinh bột
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Tinh bột 1% (ml) 0 1 2 3 4 5
Dung dịch đệm (ml) 10 9 8 7 6 5
Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 0 1 2 3 4 5
- Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 5ml dung dịch I2KI đã pha lỗng 500 lần. Đem so màu ở bước sĩng 560nm.
-Vẽ đồ thị tương quan giữa hàm lượng tinh bột và giá trị ΔOD. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng enzym Thử thật (3 ống) Thử khơng (3 ống) Tinh bột 1% (ml) 5 5 Dung dịch enzym (ml) 0,5 0 Để ổn nhiệt ở 500C, 10 phút Dung dịch HCl 0,1N (ml) 5 5 Dung dịch enzym (ml) 0 0,5
- Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm trên, thêm vào mỗi ống 5ml dung dịch I2KI đã pha lỗng.
- Lắc đều, đem đo OD tại bước sĩng 560nm.
• Cơng thức tính: hoạt độ α-amylase trong 1ml dịch enzym
HđA v t K V X * * * =
Trong đĩ: X: số mg tinh bột suy ra từ đường chuẩn.
V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzym (10,5ml). t: thời gian enzym phản ứng (10 phút).
v: thể tích enzym cho vào hỗn hợp phản ứng enzym (0,5ml).
K: hệ số pha lỗng.
2.3.7. Các phương pháp nghiên cứu xác định điều kiện nuơi cấy tối ưu [5], [12], [14], [20], [21], [45]. [12], [14], [20], [21], [45].
Khả năng sinh trưởng và sinh amylase khơng chỉ phụ thuộc vào chủng giống VSV mà điều kiện nuơi cấy cũng ảnh hưởng rất nhiều. Do đĩ chúng tơi tiến hành các thí nghiệm sau để xác định các điều kiện nuơi cấy tối ưu để chủng nghiên cứu sinh trưởng và sinh amylase tốt nhất.
2.3.7.1. Loại cơ chất
Tiến hành nuơi cấy chủng đã chọn trong mơi trường sinh tổng hợp amylase cĩ chất cảm ứng khác nhau: bột gạo, bột mỳ, bột bắp, tinh bột tan ở nhiệt độ 37oC với chế độ lắc 200 vịng/phút. Sau mỗi mốc thời gian: 20h, 30h, 40h, 45h, 50h, 55h, 60h, 70h đo OD620 xác định khả năng sinh trưởng, và ly tâm loại bỏ sinh khối ở 5000 v/p trong 15 phút lấy dịch enzym để xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Chọn loại cơ chất và thời gian nuơi cấy thích hợp thu amylase cĩ hoạt độ cao nhất.
2.3.7.2. Nồng độ cơ chất
Nuơi chủng đã chọn trong mơi trường sinh tổng hợp amylase cĩ chứa loại cơ chất thích hợp như đã xác định ở thí nghiệm 2.3.7.1 với nồng độ khác nhau: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5% trên máy lắc với chế độ lắc 200 vịng/phút ở nhiệt độ 37oC. Sau thời gian tối ưu được xác định ở mục 2.3.7.1 đo OD620 xác định khả năng sinh trưởng và đo hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Từ đĩ xác định được nồng độ cơ chất tối ưu cho khả năng sinh amylase của chủng đang
nghiên cứu .
2.3.7.3. Nhiệt độ
Chủng đã chọn được nuơi trong mơi trường sinh tổng hợp amylase cĩ chứa loại cơ chất với nồng độ thích hợp như đã xác định ở mục 2.3.7.1 và 2.3.7.2 ở nhiệt độ khác nhau: 25 – 280C; 30 – 330C; 35 – 370C; 40 – 420C trên máy lắc 200 vịng/phút. Sau thời gian thích hợp đo OD620 xác định sự sinh trưởng và đo hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel. Từ đĩ suy ra nhiệt độ tối ưu cho chủng đang nghiên cứu sinh amylase.
2.3.7.4. pH ban đầu
Nuơi chủng đã chọn trên mơi trường sinh tổng hợp amylase cĩ các điều kiện nuơi cấy tối ưu như đã xác định ở các thí nghiệm trên, với pH ban đầu khác nhau: từ 5,0 đến 8,5 (mỗi bước nhảy là 0,5) trên máy lắc với chế độ 200 vịng/phút với thời gian thích hợp. Tiến hành xác định sự sinh trưởng và hoạt độ amylase. Từ đĩ vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hoạt độ amylase theo pH. Suy ra pH ban đầu tối ưu cho chủng đã chọn sinh amylase.
2.3.7.5. Độ hiếu khí
Chủng vi khuẩn đã chọn được nuơi trong mơi trường sinh tổng hợp amylase với các điều kiện nuơi cấy tối ưu như đã xác định ở các thí nghiệm trên trong các bình tam giác 500ml với dịch lên men cĩ thể tích khác nhau : 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300ml trên cùng máy lắc với chế độ 200 vịng/phút, cùng thời gian thích hợp. Xác định sự sinh trưởng và hoạt độ amylase, kết quả thí nghiệm này cho phép xác định được tỉ lệ thể tích dịch lên men và thể tích bình nuơi cấy tối ưu để thu được hoạt độ amylase cao nhất.
2.3.7.6. Ảnh hưởng của các loại muối
• Nồng độ NaCl
Nuơi chủng đã chọn trong mơi trường cảm ứng sinh amylase với các điều kiện tối ưu, cĩ nồng độ muối NaCl thay đổi: 0; 0,03; 0,05; 0,08; 0,1; 0,12% trên cùng máy lắc với chế độ 200 vịng/phút . Sau thời gian thích hợp xác định khả năng sinh trưởng và hoạt độ amylase. Suy ra nồng độ NaCl tối ưu cho khả năng sinh amylase.
• Nồng độ CaCl2
Chủng nghiên cứu được nuơi trong mơi trường cảm ứng cĩ nồng độ muối CaCl2 khác nhau: 0; 0,01; 0,015; 0,02; 0,025% trên máy lắc 200 vịng/phút và các điều kiện nuơi cấy tối ưu đã xác định ở các thí nghiệm trên. Sau thời gian phù hợp đo khả năng sinh trưởng và hoạt độ amylase. Từ đĩ kết luận được nồng độ CaCl2 tối ưu để sinh amylase cĩ hoạt độ cao.
2.3.7.7. Nồng độ NaCl ức chế sinh trưởng
Nuơi chủng đã chọn trên mơi trường MPA cĩ nồng độ muối NaCl khác nhau: từ 1% đến 7% (mỗi bước nhảy 1%) với điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp trên máy lắc 200 vịng/phút. Sau thời gian sinh trưởng tối ưu như đã xác định ở mục 2.3.7.1 tiến hành đo pH và sự sinh trưởng OD620, so sánh với pH và OD620 của mơi trường MPA. Từ đĩ xác định được nồng độ NaCl cao nhất ức chế sự sinh trưởng của chủng nghiên cứu.
2.3.8. Phương pháp phân loại để xác định lồi của chủng đã tuyển chọn [20]: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sử dụng kỹ thuật PCR
Nguyên tắc: Khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi
chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
• Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94-
950C trong vịng 30s-1phút.
• Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuơn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-700C và kéo dài 30s-1phút.
• Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được nâng lên đến 720C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30s đến vài phút.
Giải trình tự các axit nucleic
Các phương pháp nhằm xác định trình tự axit nucleic đều dựa vào 2 nguyên tắc:
• Nguyên tắc hố học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thuỷ giải hố học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn cĩ kích thước chênh nhau 1 nucleotide.
• Nguyên tắc enzym học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thơng thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA cĩ kích thước chênh nhau 1 nucleotide.
Ở cả 2 phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phĩng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phĩng xạ tự ghi từ bản điện di.
2.3.9. Phương pháp nghiên cứu động học
Với các điều kiện tối ưu đã xác định được ở mục 2.3.7 sẽ tiến hành nuơi cấy chủng sản – chủng đã tuyển chọn cĩ hoạt độ enzym α - amylase cao nhất -