Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym ?-galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16

ữa là một thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giúp cho sự hấp thụ phospho và canxi cao, có tính kháng thể mạnh, do vậy rất tốt cho trẻ em và người già. Lactoza là disccarit chiếm chủ yếu trong thành phần sữa. Sự có mặt của lactoza trong quá trình chế biến thực phẩm đôi khi không có lợi, gây sẫm màu và tạo ra mùi không mong muốn đối với sản phẩm khi gia nhiệt, làm ảnh hưởng tới chất lượng cảm quan do sự tái kết tinh của chúng. Sau khi dùng sữa, lactoza được enzym ?-galactosidaza trong ruột non của người phân giải thành glucoza và galactoza. Tuy nhiên năng lực tổng hợp enzym trên ở người bị mất dần khi qua tuổi cai sữa. Kết quả là đại đa số người trưởng thành và người già trên thế giới đều mắc bệnh thiểu năng chuyển hóa lactoza. Nghĩa là, ở những người này khi sử dụng nhiều sữa sẽ có các triệu chứng như đầy hơi, chướng bụng, đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn. Vì vậy các hướng giải quyết được đặt ở đây là: • Phát triển các sản phẩm sữa có hàm lượng lactoza giảm để những người mắc bệnh thiểu năng chuyển hóa lactoza có thể sử dụng được. • Dùng trực tiếp các chế phẩm enzym dưới dạng thực phẩm nhằm tăng hoạt độ enzym ?-galactosidaza trong ruột non. Để thuỷ phân chuyển hóa lactoza thành glucoza và galactoza có thể dùng axit hoặc enzym ?-galactosidaza. Việc thuỷ phân bằng axit dẫn đến một số bất lợi như hao mòn thiết bị, ô nhiễm môi trường, gây khó khăn cho việc đảm bảo an toàn thực phẩm mà phương pháp enzym hoàn toàn có thể khắc phục được. Ngoài ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, tiềm năng ứng dụng của enzym ?-galactosidaza trong các lĩnh vực nghiên cứu cơ bản, trong sinh học phân tử và kỹ nghệ protein (làm các gen thông báo, chỉ thị, các phân tử cảm biến...), trong sản xuất dược phẩm và trong y học là rất lớn. Chính vì vậy, việc nghiên cứu nhằm sản xuất ra các chế phẩm enzym ?-galactosidaza là hết sức cần thiết, nhất là trong công nghiệp chế biến sữa. Đề tài “Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym ?-galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16

Nh÷ng tõ viÕt t¾t ONPG : o-nitrophenil- β -D-galactopyranoside. X-Gal : 5-bromo-4chloro-3-indolyl- β -D-galactoside. SDS : sodium dodecyl sunfate. ONPG : p-nitrophenil- β -D-galactopyranoside. GO : oligosaccarit. DEAE : dietylaminoetylxelluloza. Nguyễn Thị Hải Yến - CNSHA - K44 Đồ án tốt nghiệp Mục lục Lời mở đầu 3 Phần I: tổng Quan 5 I.1. Sơ lợc về enzym -galactosidaza 5 I.1.1. Vi sinh vật có khả năng tổng hơp enzym -galactosidaza .5 I.1.2. Đặc tính enzym -galactosidaza từ vi sinh vật .6 I.2. Các nguồn enzym -galactosidaza .7 I.2.1. Enzym -galactosidaza từ vi khuẩn 7 I.2.2. Enzym -galactosidaza từ nấm mốc .8 I.2.3. Enzym -galactosidaza từ thực vật .8 I.3.Một số cơ chế của các phản ứng đợc xúc tác bởi enzym -galactosidaza 9 I.3.1. Cơ chế động học của phản ứng ONPG .9 I.3.2. Cơ chế động học của phản ứng lactoza 10 I.3.3. Cơ chế thuỷ phân lactoza của -galactosidaza có pH trung tính .11 I.4. Sự điều hoà sinh tổng hợp enzym -galactosidaza của vi sinh vật .13 I.5. Tách chiết và tinh chế enzym .14 I.5.1. Tách chiết 14 I.5.2. Tinh chế .14 I.6. ứng dụng của enzym -galactosidaza .16 I.6.1. ứng dụng để thuỷ phân lactoza trong công nghiệp chế biến sữa và các thành phần của sữa .16 I.6.2. Sử dụng phản ứng chuyển hoá galactozyl tạo ra các oligosacarit từ lactoza .19 I.6.3. Sử dụng trong sinh học phân tử và kỹ nghệ protein .20 I.7. Nguồn thu từ enzym công nghiệp trong tơng lai .21 I.8. Khả năng ứng dụng của enzym -galactosidaza trong tơng lai 22 Phần II: nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu .23 II.1. Nguyên liệu .23 II.2. Hoá chất 24 II.3. Thiết bị .24 II.4. Các phơng pháp nghiên cứu 25 2 Nguyễn Thị Hải Yến - CNSHA - K44 Đồ án tốt nghiệp II.4.1. Nhuộm gram 25 II.4.2. Xác định định tính enzym -galactosidaza bằng chỉ thị X-Gal .27 II.4.3. Xác định hoạt độ enzym -galactosidaza nội bào 27 II.4.4. Xác định hoạt độ enzym -galactosidaza ngoại bào 30 Phần III: Kết quả và thảo luận 32 III.1. Vài nét về chủng vi khuẩn sử dụng .32 III.2. Nghiên cứu khả năng đồng hoá các nguồn cácbon khác nhau .33 III.3. Khảo sát sự thay đổi pH, mật độ tế bào, hoạt độ enzym của chủng S.paucimobilis BK16 trong quá trình lên men 35 III.4. Xác định một số đặc tính enzym -galactosidaza thu đợc 38 III.4.1. ảnh hởng của pH phản ứng tới hoạt độ của enzym 38 III.4.2. ảnh hởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt độ của enzym 40 III.4.3. ảnh hởng của pH tới tính bền của enzym .41 III.4.4. ảnh hởng của pH tới tính bền của enzym .42 III.5. Nghiên cứu khả năng thu enzym nội bào .43 III.6. Nghiên cứu khả năng kết tủa enzym bằng muối amonsunfat 45 Kết luận 46 Tài liệu tham khảo 47 3 Nguyễn Thị Hải Yến - CNSHA - K44 Đồ án tốt nghiệp Lời mở đầu Sữa là một thực phẩm có giá trị dinh dỡng cao, giúp cho sự hấp thụ phospho và canxi cao, có tính kháng thể mạnh, do vậy rất tốt cho trẻ em và ngời già. Lactoza là disccarit chiếm chủ yếu trong thành phần sữa. Sự có mặt của lactoza trong quá trình chế biến thực phẩm đôi khi không có lợi, gây sẫm màu và tạo ra mùi không mong muốn đối với sản phẩm khi gia nhiệt, làm ảnh hởng tới chất lợng cảm quan do sự tái kết tinh của chúng. Sau khi dùng sữa, lactoza đợc enzym - galactosidaza trong ruột non của ngời phân giải thành glucoza và galactoza. Tuy nhiên năng lực tổng hợp enzym trên ở ngời bị mất dần khi qua tuổi cai sữa. Kết quả là đại đa số ngời trởng thành và ngời già trên thế giới đều mắc bệnh thiểu năng chuyển hóa lactoza. Nghĩa là, ở những ngời này khi sử dụng nhiều sữa sẽ có các triệu chứng nh đầy hơi, chớng bụng, đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn. Vì vậy các hớng giải quyết đợc đặt ở đây là: Phát triển các sản phẩm sữa có hàm lợng lactoza giảm để những ngời mắc bệnh thiểu năng chuyển hóa lactoza có thể sử dụng đợc. Dùng trực tiếp các chế phẩm enzym dới dạng thực phẩm nhằm tăng hoạt độ enzym -galactosidaza trong ruột non. Để thuỷ phân chuyển hóa lactoza thành glucoza và galactoza có thể dùng axit hoặc enzym -galactosidaza. Việc thuỷ phân bằng axit dẫn đến một số bất lợi nh hao mòn thiết bị, ô nhiễm môi trờng, gây khó khăn cho việc đảm bảo an toàn thực phẩm mà phơng pháp enzym hoàn toàn có thể khắc phục đợc. Ngoài ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, tiềm năng ứng dụng của enzym -galactosidaza trong các lĩnh vực nghiên cứu cơ bản, trong sinh học phân 4 Nguyễn Thị Hải Yến - CNSHA - K44 Đồ án tốt nghiệp tử và kỹ nghệ protein (làm các gen thông báo, chỉ thị, các phân tử cảm biến .), trong sản xuất dợc phẩm và trong y học là rất lớn. Chính vì vậy, việc nghiên cứu nhằm sản xuất ra các chế phẩm enzym -galactosidaza là hết sức cần thiết, nhất là trong công nghiệp chế biến sữa. Đề tài Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym -galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16 nhằm những mục đích sau: Khảo sát đặc tính sinh enzym của chủng S. paucimobilis BK16. Nghiên cứu lựa chọn nguồn cacbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzym -galactosidaza chủng S. paucimobilis BK16. Xác định một số đặc tính của enzym -galactosidaza thu đợc từ chủng S. paucimobilis BK16. Nghiên cứu khả năng thu enzym kỹ thuật. 5 Nguyễn Thị Hải Yến - CNSHA - K44 Đồ án tốt nghiệp Phần I Tổng quan I.1. Sơ lợc về enzym -galactosidaza: Enzym -galactosidaza là enzym xúc tác cho quá trình thuỷ phân và chuyển hóa các gốc -D-galactozyl, trong đó có sự thủy phân lactoza thành glucoza và galactoza [6]. Enym -galactosidaza có trong nhiều tổ chức bao gồm các vi sinh vật, thực vật và động vật. Các enzym này đã đợc ứng dụng trong nhiều quá trình công nghệ sinh học, đặc biệt là các enzym từ vi sinh vật đợc sử dụng để thủy phân lactoza nhằm làm tăng khả năng tiêu hóa sữa hoặc để cải thiện các đặc tính chức năng của các sản phẩm từ sữa. Phản ứng chuyển hoá galactozyl cũng thờng đợc sử dụng để tạo ra các galacto-oligosaccrit nhằm cải biến về mặt chức năng và cấu trúc của nguyên liệu thực phẩm, dợc phẩm và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác [6]. Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về enzym - galactosidaza, chủng vi sinh vật tổng hợp nên nó, đặc tính enzym, phơng pháp tách chiết, tinh chế và ứng dụng nó trong nhiều lĩnh vực khác nhau nh trong công nghiệp thực phẩm, trong y học và dợc phẩm cũng nh cả trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản. Mặc dù vậy, ở nớc ta, việc nghiên cứu về enzym này mới chỉ là bớc đầu và ứng dụng của chúng rất ít đợc đề cập đến. I.1.1. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp -galactosidaza : Hiện nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra đợc nhiều chủng loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym -galactosidaza với hoạt lực cao. Enzym khi đợc tổng hợp có thể ở dạng ngoại bào (tiết ra ngoài môi trờng) hoặc nội bào (tích tụ trong tế bào, có thể ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết với màng, với plasma hoặc lyzosome của tế bào ) [6]. 32 Nguyễn Thị Hải Yến - CNSHA - K44 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1: Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzym -galactosidaza: Nấm men Candida pseudtropicalis, Crypotoccus laurentii, Kluyverromyces lactics, K.fragilis, K.marxianus, Torulopsis sphaerica, T.versalitis Nấm mốc Asperigillus awmori, A.cellulosae, A.foetidus, A.niger, A.oryzae, Chaetomium globosum, C.funicola, Fusarium maniforme, Penicillum canescens, Rhizopus acidus, R.niveus, Vi khuẩn Vi khuẩn gram âm: Sphigomonas Paucimobilis, Aeromonas cavie, A.formicans, Agrobacterrium rediobacter, Enterobacter cloacae, Escerichia coli, Fibrobacter succinogenes, Xanthomonas campertris, Vi khuẩn gram dơng: Bacillus acidocaldarius, B.circulans, B.coagulans, B.macerans, B.subtilis, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterrium murisepticum, Lactococcus pneumonira, I.2 Đặc tính của enzym -galactosidaza từ vi sinh vật: Khối lợng phân tử của enzym dao động từ 19.000 đến 630.000 Dalton. Cấu trúc dới phân tử của các enzym này bao gồm nhiều loại khác nhau từ monomer (enzym từ Kluyveromces lactic) đến octamer (enzym từ E.coli) [4]. Tuỳ thuộc vào nguồn thu enzym mà tính đặc hiệu phân tử của từng loại enzym là khác nhau. Các enzym -galactosidaza có nguồn gốc từ vi khuẩn có pH tối u thuộc 33 Nguyễn Thị Hải Yến - CNSHA - K44 Đồ án tốt nghiệp vùng trung tính, trong khi đó hầu hết các enzym -galactosidaza từ nấm mốc có pH thuộc vùng axit, có một số chủng đạt tới pH tối u là pH=2 [15]. Một số enzym -galactosidaza từ vi khuẩn để có hoạt tính cần phải có mặt các ion hoá trị 1 và các ion hoá trị 2, ví dụ nh enzym -galactosidaza từ S. rectivirgula cần phải có mặt nhiều ion kim loại hoá trị 2 để đạt đến độ bền nhiệt và hoạt tính tối đa. Tuy nhiên một số enzym -galactosidaza khác lại không cần sự có mặt của các ion kim loại nh enzym từ Rhizobium melioti [15]. Những điểm trên cho ta thấy tính đa dạng của enzym -galactosidaza vi sinh vật. I.2. Các nguồn enzym -galactosidaza: Mặc dù rất nhiều enzym -galactosidaza từ vi sinh vật đợc biết đến nhng chỉ có một số ít các vi sinh vật đợc lựa chọn làm nguồn sinh enzym trong công nghiệp. Hầu hết các vi sinh vật này có nguồn gốc từ nấm mốc nh là Kluyveromyces lactic, K.fragilis, Aspergillus niger và A.oryzae hoặc từ vi khuẩn nh E.coli. Những loài vi sinh vật đó đợc lựa chọn chính vì chúng có thể tạo ra enzym -galactosidaza với giá rẻ và an toàn khi cho thêm vào thực phẩm [5]. Enzym từ vi sinh vật, thực vật đợc ứng dụng rất rộng rãi trong các quá trình công nghệ sinh học. I.2.1. Enzym từ vi khuẩn: 34 Nguyễn Thị Hải Yến - CNSHA - K44 Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn E.coli là đối tợng đợc nghiên cứu đầu tiên. Cấu trúc bậc ba của enzym từ E.coli cũng nh cơ chế điều hoà phiên mã của gen lacZ đã đợc khẳng định tạo điều kiện cho việc nghiên cứu kỹ hơn về cơ chế xúc tác của enzym này. Mặc dù vậy, việc sử dụng enzym này vào các quá trình sinh học chỉ đợc kiểm nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm do vi khuẩn này không đợc phép có mặt trong các sản phẩm thực phẩm. Lĩnh vực chủ yếu của enzym từ vi khuẩn E.coli này là trong nghiên cứu sinh học phân tử, trong kỹ nghệ và trong hóa miễn dịch. Enzym -galactosidaza từ Steptcoccus thermophilus một trong những vi khuẩn đợc sử dụng ở công nghệ chế biến các sản phẩm lên men từ sữa cũng đã đợc sử dụng để thủy phân lactoza trong sữa ở quy mô công nghiệp do tính bền nhiệt và độ an toàn khi đợc sử dụng dới dạng phụ gia sản phẩm. Nó cũng đợc dùng làm chất xúc tác cho quá trình sản xuất các galacto-oligosaccarit từ lactoza do hoạt tính chuyển hóa galactozyl của nó cao. Đối với vi khuẩn chúng có thể phát triển tối u trong dải pH từ 6,5 đến 7,5. Chúng kém phát triển ở pH dới 4 hoặc trên 8,5 [5]. I.2.2. Ezym từ nấm mốc: Enzym từ nấm mốc nh Kluyveromyces lactic, K.fragilis, Aspergillus niger và A.oryae đã đợc sử dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa. Đặc biệt enzym từ A.orytococcuss laurentii và Sterigmatomyces elviae có hoạt tính chuyển hóa galactozyl cao do vậy đợc dùng để sản xuất các galato-oligosaccarit từ lactoza. Nấm mốc phát triển tối u trong phạm vi pH từ 5 đến 7, chúng có thể phát triển ở dải pH từ 3 đến 8,5 [6]. 35 Nguyễn Thị Hải Yến - CNSHA - K44 Đồ án tốt nghiệp I.2.3. Enzym từ thực vật lá bina: Các nhà khoa học đã tách chiết và tinh chế đợc enzym -galactosidaza từ lá cây bina. Enzym -galactosidaza tách từ nguồn thực vật này có khả năng thủy phân các loại cơ chất khác nhau ở các tốc độ khác nhau. Cụ thể là thủy phân lactoza với tốc độ bằng 2% so với thủy phân p-nitrophenyl--galactozit. Monogalactozyldiglyxerit đợc hấp thụ vào trong celit bị thủy phân bởi - galactosidaza tại tốc độ nhỏ hơn 250 lần so với thủy phân p-nitrophenyl-- galactozit [8]. I.3. Một số cơ chế của các phản ứng đợc xúc tác bởi enzym -galactosidaza : I.3.1. Cơ chế động học của phản ứng với ONPG: Cơ chế động học của phản ứng với sự xúc tác của enzym -galactosidaza từ Escerichia coli có thể đợc thể hiện đơn giản nhất bằng phản ứng với 2- nitrophenyl- -D-galatopyranozit (ONPG). ONPG là cơ chất tổng hợp trong đó aglycon đóng vai trò là nhóm chuyển dời. ONPG (đợc ký hiệu là S) gắn với enzym để hình thành phức chất Michaelis ES (bớc a). 2-nitrophenolat nhanh chóng đợc giải phóng để tạo thành hợp chất trung gian enzym-galatozyl (bớc b), một phần hợp chất này đợc thuỷ phân tiếp theo (bớc c) và phần còn lại đợc chuyển hoá galatozyl (g,h). Đối với phản ứng thuỷ phân phân tử H 2 O phản ứng với hợp chất trung gian enzym galatozyl để tạo ra galatoza và enzym ở dạng tự do (bớc c). Đối với phản ứng chuyển hoá galatozyl, chất nhận galatozil (kí hiệu là Nu) có mặt trong hỗn hợp phản ứng gắn 36