ơng lai:
Do tầm quan trọng của enzym β-galactosidaza trong các quá trình sinh học, trong các ứng dụng trị liệu và chế biến thực phẩm nên việc đánh gia và tối u hoá ph- ơng pháp tổng hợp nhằm tạo ra phơng pháp đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả là mục tiêu của các nhà sản xuất và nghiên cứu.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tổng hợp nên các oligosaccarit mới có tiềm năng ứng dụng rất lớn. Các glicoprotein chứa duy nhất một loại gốc đờng tham gia vào việc xác định loại nhóm máu, đóng vai trò trong các bệnh truyền nhiễm virut và nhiễm khuẩn, chịu trách nhiệm đối với các nhận biết tế bào – tế bào, nằm trên các vị trí thụ thể tế bào. Các galactozit có thể đợc sử dụng làm phụ gia thực phẩm với nhiều mục đích, chức năng khác nhau nh làm chất tạo ngọt, chất ổn định, chất hoà tan…
Trong tơng lai, các ứng dụng trong thực phẩm, dợc phẩm và y học tập trung vào các quá trình chuyển hoá galatozyl nhằm tổng hợp nên các hợp chất chức năng duy nhất bằng cách thêm vào các phần tử nhận.
Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu
II.1 Nguyên liệu:
II.1.1 Môi trờng nuôi cấy, phân lập:
II.1.1.1 Môi trờng thạch dùng để phân lập (môi trờng Lactoza-Broth):
Thành phần: Cao thịt bò: 3g Pepton: 5g Lactoza: 5g Agar: 15 ữ 20g Nớc thêm đạt 1000 ml Thanh trùng ở 110oC/ 30 phút
II.1.1.2 Môi trờng nuôi cấy cơ bản (môi trờng Lactoza):
Lactoza: 20g Pepton: 3g NaCo3: 3g KCl: 0.5g MgSO4.7H2O: 0.5g KH2PO4: 0.1g FeSO4.7 H2O: 0.01g ZnSO4.7H2O: 0.01g CuSO4.5H2O: 0.005g Nớc thêm đạt 1000 ml Thanh trùng ở 110oC/ 30 phút
Môi trờng thạch dùng để cấy chuyền và giữ giống còn có thêm Agar-Agar với hàm lợng 15 ữ 20g/lít môi trờng.
II.2 Hoá chất:
II.2.1 Nguồn Cacbon:
- Nguồn cacbon sử dụng Lactoza, Glucoza, Saccaroza.
II.2.2 Nguồn Nitơ:
- Nguồn Nitơ vô cơ sử dụng: NaNO3, (NH4)2SO4. - Nguồn Nitơ hữu cơ sử dụng: Pepton, cao thịt bò.
II.2.3 Các hoá chất khác:
- Cơ chất ONPG (o-nitrophenil-β-D-galactopyranoside): sản phẩm của hãng Sigma Alrich-Germany.
- Thuốc thử X-Gal (5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-galactoside): sản phẩm của hãng USBTM- Italia.
- Clorofrom tinh khiết.
- Dung dịch SDS (sodium dodecyl sunfate): 0.1%. - Dung dịch Na2C03. 1M.
- 2-mecaptoetanol. - Các hoá chất khác.
Ghi chú: Tất cả các hoá chất phân tích đều là hoá chất tinh khiết.
II.3 Thiết bị:
- Kính hiển vi Nikon eclipse E800, camera Fujix Digital HC-300Zi, Japan. - Thiết bị so màu quang phổ Ultrospec 2000, Amersham pharmacia biotech,
- Máy ly tâm thờng EBA 20 – Hettich zentrifugen, Germany.
- Máy ly tâm eppendof IK15 – Sigma laborzentrifugen 1999, Germany. - Thiết bị siêu âm phá vỡ tế bào.
- Tủ nuôi ổn nhiệt B12 Heracus-Kendo laboratory Products. - Thiết bị hấp tiệt trùng Medizinische Geratefabrik, Berlin. - Máy nuôi cấy ổn nhiệt Shaking incubator, Korea.
- Máy đo pH MP 220 – Mettler Toledo.
II.4 Các phơng pháp nghiên cú:
II.4.1 Nhuộm gram: [2]
Với phơng pháp nhuộm này, ngời ta có thể phân biệt sự khác nhau giữa hai loại vi sinh vật giống nhau về hình thái và kích thớc. Nguyên nhân của hiện tợng này là do cấu tạo hoá học của những vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Có nhiều giả thiết về cơ chế nhuộm gram (giả thuyết về điểm đẳng điện, cấu tạo tế bào, thành phần hoá học ). Nh… ng cho đến nay, giả thuyết về cấu tạo hoá học vẫn đợc chấp nhận tuyệt đối hơn cả. Thuyết này cho rằng khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan tới muối magiê của axit ribonucleic. Khi nhuộm màu phức tạp (nhuộm gram) muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại triphenymetan (nh gential violet, kristal violet hoặc metyl violet ) chịu đ… ợc tác dụng của cồn, nghĩa là không mất màu dới tác dụng của cồn. Những vi sinh vật có tính chất này gọi là vi sinh vật gram dơng. Ngợc lại những vi sinh vật không giữ màu khi xử lý bằng cồn là vi sinh vật gram âm. Đây là một trong những đặc điểm quan trọng trong việc phân
loại vi sinh vật. Dựa vào khả năng nhuộm màu gram của vi sinh vật mà ngời ta chia chúng ra thành 2 nhóm:
- Vi sinh vật gram dơng (G+): gồm hầu hết các loại cầu khuẩn, trực khuẩn hiếu khí có nha bào;
- Vi sinh vật gram âm (G-): gồm vi khuẩn đờng ruột và vi khuẩn axetic. Hoá chất: + Dung dịch tím gential + Dung dịch lugol + Cồn 950 + Dung dịch fucsin + Dầu séc + Toluen Tiến hành:
+ Làm tiêu bản vi sinh vật, cố định vết bôi
+ Nhuộm bằng tím gential (gential violet): nhỏ tím gential lên vết bôi, giữ trong 1-2 phút rồi đổ hết thuốc nhuộm đi.
+ Nhuộm bằng dung dịch lugol: nhỏ lugol lên tiêu bản, để trong 1 phút rồi đổ thuốc nhuộm đi.
+ Rửa bằng cồn 950 trong 30 giây.
+ Rửa lại bằng nớc rồi làm khô vết bôi bàng sứa nóng đèn cồn.
+ Nhuộm bổ sung bằng fucsin trong 1 phúỏngồi rửa lại bằng nớc, đợi khô sau đó đem quan sát.
Tế bào vi sinh vật nhuộm gram dơng bắt màu tím, còn gram âm bắt màu hồng của thuốc nhuộm bổ sung [2].
II.4.2 Xác định tính enzym β-galactosidaza bằng chỉ thị X-Gal [15]:
Sự có mặt của β-galactosidaza đợc xác định dựa trên nguyên tắc sau: β- galactosidaza thuỷ phân X-Gal hình thành nên kết tủa màu xanh Blue kiểu indigo. Vì vậy vi khuẩn dơng tính với enzym này tạo khuẩn lạc màu xanh khi nuôi cấy với sự có mặt của chỉ thị X-Gal.
X-Gal đợc hoà tan trong dimethylformamide ở nồng độ 20 àg/ml. Dung dịch gốc này phải đợc bảo quản trong tối ở nhiệt độ 40C.
Môi trờng thạch dùng để cấy hoặc phân lập bình thờng đợc hấp vô trùng và làm nguội đến nhiệt độ khoảng 550C, sau đó thêm chỉ thị X-Gal vào đến nồng độ cuối là 4 àg/ml (dung dịch gốc pha loãng 500 lần). Cần chú ý không thêm chỉ thị X- Gal vào khi nhiệt độ môi trờng lớn hơn 550C do tại nhiệt độ lớn hơn 550C chỉ thị này không bền và sẽ bị phân huỷ.
Đĩa thạch chỉ thị này đợc dùng để nuôi vi khuẩn. Sau một thời gian nuôi cấy (tùy thuộc vào đặc tính của mỗi chủng riêng biệt), các chủng vi khuẩn tạo khuẩn lạc có màu xanh trên đĩa chỉ thị là chủng có khả năng sinh tổng hợp enzym β-galactosidaza.
Cần chú ý là các đĩa thạch sau khi đã thêm chất chỉ thị phải đợc bảo quản trong tối ở 4oC và chỉ dùng đợc trong khoảng thời gian là 1 tháng.
II.4.3 Xác định hoạt độ enzym β-galactosidaza nội bào [9]:
Hoá chất:
+ Na2HPO4 0,06M (ở dạng ngậm 12H2O, phân tử lợng là 358,14) + NaH2PO4 0,04M (ở dạng ngậm 2H2O, phân tử lợng là 156.01) + KCL 0,01M
+ MgSO4 0.001M
Dung dịch đệm Z đợc pha trong nớc, trớc khi sử dụng thêm 2- mercaptoetanol với hàm lợng 0,27 ml 2- mercaptoetanol/100ml dung dịch đệm.
- Dung dịch Na2CO3 1M (bảo quản vô hạn định ở nhiệt độ phòng) - Dung dịch cơ chất ONPG.
- Dung dịch đệm phosphat 0,1M, pH = 7,0 có thành phần nh sau: Na2HPO4.7H2O 0,06M
NaH2PO4.H2O 0,04M
Điều chỉnh đến pH 7,0 bằng NaOH hoặc H3PO4. Dung dịch này ổn định ở nhiệt độ phòng và không cần phải pha mới hàng ngày.
Dung dịch cơ chất nồng độ 4 àg/ml đợc pha trong đệm photphat 0,1M, pH 7,0 nêu trên, đợc lọc và bảo quản ở 40C cho đến khi bắt đầu ngả sang màu vàng. tốt hơn là dung dịch cơ chất này đợc pha mới hàng ngày.
- Dung dịch SDS 0.1%
- Dung dịch clorofom tinh khiết. Thiết bị và dụng cụ:
- Thiết bị li tâm
- Thiết bị so màu quang phổ - Thiết bị ổn nhiệt
Tiến hành:
- Chuẩn bị sinh khối vi sinh vật:
+ Ly tâm ít nhất 2ml dịch nuôi cấy vi sinh vật, quá trình ly tâm ở 40C với tốc độ 6000 vòng/phút.
+ Loại bỏ phần dịch trong, phần cặn bã đợc tái tạo huyền phù bằng cùng một thể tích dung dịch đệm Z đã làm lạnh.
- Đo độ hấp thụ OD tại 600nm với mẫu trắng lá dung dịch đệm Z.
- Pha loãng dịch huyền phù chứa tế bào vi sinh vật bằng dung dịch đệm Z, tuỳ thuộc vào hoạt độ của enzym trong mẫu dịch nuôi cấy vi sinh vật mà cần pha loãng ở các tỷ lệ nhất định.
- Làm tăng tính thấm của các tế bào vi sinh vật đã pha loãng này bằng cách thêm 100 àl Cloroform và 50 àl dung dịch SDS 0,1% vào 1ml huyền phù đã pha loãng ở trên.
- Lắc đều và để ổn định ở 280C trong 5 phút. Phân tích:
- Bắt đầu phản ứng bằng cách thêm 0,2 ml dung dịch cơ chất ONPG ở trên vào mẫu thí nghiệm.
- Giữ mẫu ở 280C cho đến khi thấy xuất hiện màu vàng tơng tự nh màu của màu dịch chiết bò thì dừng phản ứng enzym và đọc thời gian phản ứng tính từ lúc thêm dung dịch cơ chất.
- Đọc mật độ quang tại 420 nm và 550 nm vỡi mẫu trắng có thành phần giống nh mẫu phân tích nhng thứ tự thêm cơ chất và thêm chất dừng phản ứng là ngợc nhau, nghĩa là ban đầu thêm chất dừng phản ứng, thêm tiếp cơ chất rồi mới ủ ở 280C.
Tính kết quả:
Tính toán số đơn vị hoạt độ có trong 1 ml dịch nuôi cấy theo công thức sau: 1000 (OD420 – 1,75.OD550)
E =
V.T.OD600
Trong đó: E: Hoạt độ enzym (MU/ml)
V: thể tích của mẫu đem phản ứng (ml) T: thời gian phản ứng (phút)
OD420 và OD550: giá trị đo mật độ quang của dung dịch mẫu mẫu sau phản ứng ở các bớc sóng 420 nm và 550 nm so với mẫu trắng.
OD600: giá trị mật độ quang của dịch mẫu ở bớc sóng 600 nm với mẫu trắng là dung dịch đệm Z.
II.4.4 Xác định hoạt độ enzym β-galactosidaza ngoại bào [9 ]
Xác định hoạt độ enzym β-galactosidaza ngoại bào trong mẫu dịch lên men bằng phơng pháp tơng tự nh trên, chỉ khác ở những điểm sau:
- Mẫu dùng xác định là dịch lên men đem ly tâm ở nhiệt độ 40C, tốc độ 8000 vóng/phút để thu lấy dịch trong.
- Pha loãng mẫu bằng dung dịch đệm Z (không cần bớc tăng tính thấm của thành tế bào bằng Cloroform và SDS).
- Lắc đều và để ổn định ở 280C trong 5 phút. Phân tích:
- Các bớc phân tích tơng tự nh trên, chỉ khác là không cần xác định giá trị mật độ quang tại các bớc sóng 550 và 600 nm do dịch mẫu phân tích là dịch trong hoàn toàn.
Tính toán kết quả:
Tính kết quả nh sau (đơn vị: MU/ml):
1000. OD420 E =
V.T Trong đó:
E: Hoạt độ enzym (MU/ml)
OD420: Giá trị mật độ quang tại bớc sóng 420 nm V: Thể tích thực của mẫu đem phản ứng (ml) T: Thời gian phản ứng (phút)
Kết quả và thảo luận
III.1 Vài nét về chủng vi khuẩn sử dụng:
Nguồn gốc: Đây là chủng vi khuẩn đợc phân lập từ nguồn sữa chua tại trờng Đại học Bách khoa Hà Nội, mang ký hiệu BK16.
Tên khoa học:Sphingomonas paucimobilis BK16.
Đặc điểm tế bào: Gram âm, kích thớc khuẩn lạc 2 mm.
Hình 3: Chủng S. paucimobilis BK16 (độ phóng đại 1000 lần)
III.2. Nghiên cứu khả năng đồng hoá các nguồn cacbon khác nhau:
Tiến hành thí nghiệm nuôi cấy chủng BK16 trên các nguồn cacbon: lactoza, glucoza và saccroza với hàm lợng 20g/l. Các thành phần khác của môi trờng nuôi cấy giống nh môi trờng cơ bản. Kết quả đợc thể hiện ở bảng sau:
Bảng 2: Sự thay đổi mật độ tế bào khi nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau:
Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72 OD 600 nm Lactoza 0.434 0.922 1.441 1.640 1.627 1.604 1.574 Glucoza 0.336 0.492 0.894 1.007 1.003 0.940 0.747 Saccaroza 0.346 0.680 1.108 1.054 1.002 0.892 0.874
Hình 5: Sự thay đổi mật độ tế bào khi nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau:
Nhận xét:
- Trên tất cả các nguồn cacbon, pha logarit đều nằm trong khoảng từ giờ thứ
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 0 12 24 36 48 60 72 84
Thời gian lên men (h)
M ật đ ộ tế b ào (O D 6 00 nm ) Lactoza Glucoza Saccaroza
Trên nguồn cacbon là glucoza chủng này kém phát triển.
Bảng 3: Sự thay đổi hoạt độ enzym khi nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau:
Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72 Hoạt độ enzym (mU/ml) Lactoza 15.12 235.8 343.85 393.39 383.76 257.79 153.45 Glucoza 0 5.78 12.95 30.42 23.31 12.57 0 Saccaroza 0 4.02 20.85 37.99 71.40 48.54 15.57
Hình 6: Sự thay đổi hoạt độ enzym khi nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau:
Nhận xét:
- Chủng BK16 có khả năng sinh tổng hợp enzym β-Galactosidaza cao nhất trên nguồn cacbon lactoza, khả năng sinh tổng hợp enzym trên các nguồn cacbon còn lại là thấp đặc biệt là trên nguồn cacbon glucoza.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 12 24 36 48 60 72 84
Thời gian lên men (h)
H oạ t đ ộ en zy m (M U /m l) Lactoza Glucoza Saccaroza
Vì vậy chúng tôi chọn nguồn cacbon lactoza làm môi trờng để nuôi sinh tổng hợp enzym β-Galactosidaza.
III.3 Khảo sát sự thay đổi pH, mật độ tế bào, hoạt độ enym của chủng S.paucimobilis BK16 trong quá trình lên men:
Nguồn cacbon: lactoza.
Giống trớc khi cấy đợc hoạt hoá trong ống nghiệm chứa 10ml dịch có thành phần giống nh môi trờng lên men ở 300C trong 24 giờ.
Nhiệt độ nuôi cấy 300C.
Tốc độ lắc 200 vòng/phút.
Sau mỗi khoảng thời gian 12 giờ lấy mẫu một lần, đem xác định giá trị pH, mật độ tế bào, hoạt độ enzym nội bào.
Bảng 4: Sự thay đổi pH của chủng S.paucimobilis BK16 trong quá trình lên men:
Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72
pH 4.83 4.26 3.69 3.27 3.15 3.10 2.82
Hình 7: Sự thay đổi pH của chủng S.paucimobilis BK16 trong quá trình lên men
0 1 2 3 4 5 6 0 12 24 36 48 60 72 84
Thời gian lên men (h)
p
Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72
OD 600 nm 0.434 0.922 1.441 1.640 1.637 1.624 1.574
Hình 8: Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng BK16 trong quá trình lên men:
Nhận xét:
- Giai đoạn phát triển logarit của BK16 bắt đầu từ giờ thứ 6 và kết thúc ở giờ thứ 36.
- Mật độ tế bào đạt nhiều nhất ở giờ lên men thứ 36 thể hiện ở giá trị OD 600 nm = 1.640. 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 0 12 24 36 48 60 72 84
Thời gian lên men (h)
M ật đ ộ tế b ào ( O D 60 0 nm ) CD 600
Bảng 6: Sự thay đổi hoạt độ enzym của chủng BK 16 trong quá trình lên men
Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72
Hoạt độ enzym
(MU/ml) 15.12 238.98 343.39 393.39 383.76 254.79 153.45
Hình 9: Sự thay đổi hoạt độ enzym của chủng BK 16 trong quá trình lên men
Nhận xét:
- Hoạt độ enzym tăng rất nhanh ở giai đoạn đầu (trong khoảng thời gian từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12).
- Hoạt độ enzym cao nhất đạt 393.39 mU/ml với thời gian lên men là 36 giờ. Kết quả này gần với công trình nghiên cứu về enzym có nguồn gốc từ vi khuẩn cho rằng enzym này đợc tổng hợp mạnh nhất ở cuối pha logarit và đầu pha cân bằng. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 12 24 36 48 60 72 84
Thời gian lên men (h)
Hoạ t đ ộ enz
ym (M U/m l)
III.4 Xác định một số đặc tính enzym β-Galactosidaza thu đợc từ chủng BK16:
III.4.1 ảnh hởng của pH phản ứng tới hoạt độ enzym:
Giá trị pH có ảnh hởng lớn tới hoạt tính của enzym, mỗi enzym hoạt động mạnh ở một giá trị pH khác nhau. Giá trị pH mà tại đó mà enzym hoạt động mạnh nhất đợc gọi là pH tối u. Để khảo sát ảnh hởng của pH tới hoạt độ của enzym thu đ- ợc từ chủng BK16, ta xác định hoạt độ của chế phẩm thô khi tham gia phản ứng với