thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê

thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả các l...

Mục lục

I Tổng quan:

1 Giới thiệu chung về enzyme rennin:

• Cấu trúc phân tử

• Đặc tính và khả năng thủy phân của rennin

• Sự họat hóa prorennin thành rennin

• Các yếu tố ảnh hưởng đến họat tính của enzyme rennin

• Bảo quản rennin

2 Dạ dày bê:

• Cấu trúc dạ dày

• Sự tiêu hóa thức ăn trong dạ dày

• Mối liên hệ của dạ dày bê và rennin

II Phương pháp thu nhận rennin:

Quy trình:

1 Giai đọan 1: Thu nhận dung dịch rennet

2 Giai đọan2: thu nhận rennin từ dịch chiết

III Các phương pháp phân tích chất lượng chế phẩm enzyme

− Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford

− Xác định hoạt lực đông tụ sữa của enzyme

− Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến

IV Ứng dụng:

Trong công nghiệp sản xuất phomat.

Tài liệu tham khảo:

− Nguyễn Đức Lựợng – công nghệ enzyme- NXBĐHQG

− Ðồng Thị Thanh Thu , Sinh hóa ứng dụng, Nhà XB ÐHQG -TPHCM( 2002 )

− Bài giảng cn protein – enzyme- www.ebook.edu.vn/

− Các hình ảnh trên google

− METHOD FOR THE PURIFICATION OF CALF RENNET- Inventor: Sethuraman Subramanian, Elkhart,ind – Oct 16/1985 –

http://www.freepatentsonline.com/4666843.html?query=calf+rennet&stemming=on

THU NHẬN ENZYME RENNIN TỪ DẠ DÀY BÊ

I Tổng quan:

1 Giới thiệu chung về enzyme rennin:

Năm 1951, Heinz khám phá ra enzyme đông tụ sữa được tìm thấy ở dịch tiêu hóa của ngăn thứ tư dạ dày bê gọi là rennin

Rennin do tế bào chính của tuyến dạ dày tiết ra có để tiêu hóa sữa cho động vật mới sinh, đặc biệt ở ngăn thứ tư dạ dày bê dưới 5 tháng tuổi Khi bê càng gần 5 tháng tuổi, bắt đầu ăn, thành phần rennin trong rennet giảm dần và được thay thế bằng pepsin

a Phân lọai:

Rennin là một protease tính acid, số phân lọai E.C.3.4.4.3

Rennin là thành phần chủ yếu của rennet

Rennin là enzyme đặc biệt có khả năng đông tụ sữa cao và phân giải protein (đặc biệt là casein của sữa)

b Cấu trúc phân tử :

-Rennin là enzyme thủy phân liên kết peptide, có trọng lượng phân tử khoảng 33.000 – 34.000 Da Rennin tinh khiết có dạng tinh thể lập phương

-Về mặt cấu tạo phân tử, rennin có mạch polypeptide có gắn glycine trong mạch có vòng carbon Các liên kết hydro có thể đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cấu trúc bậc 2, 3 của rennin ở dạng họat động Cấu trúc bậc nhất của rennin cũng có nét tương tự pepsin ở phân đọan mạch đầu C, ở đọan mạch gần liên kết disulfur và phần đọan mạch chứa aspartic acid ở trung tâm họat động

-Thành phần hóa học rennin chứa nhiều amino acid có tính acid hơn amino acid kiềm tính, nhưng tỷ lệ thấp hơn so với pepsin Trong thành phần của rennin còn chứa nhiều prolin, serin và trong phân tử có chứa tới 3 cầu disulfur Do đó, rennin thể hiện tính acid yếu hơn pepsin

c Đặc tính và khả năng thủy phân của rennin:

• Đặc tính:

Rennin tinh khiết có đặc tính của một globulin Điểm đẳng điện pI=4.5 Rennin thấm chọn lọc qua màng tế bào nhưng không thấm qua màng tế bào ở môi trường kiềm

• Đặc hiệu thủy phân:

Rennin chỉ thủy phân liên kết peptide và không làm ảnh hưởng đến liên kết ester và amin Rennin đặc hiệu có tác dụng mạnh lên các liên kết được tạo nên bởi tyrosine và phenyl alanine (tạo mùi vị đặc trưng cho phomai)

Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác Đặc tính thủy phân casein của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH Ở pH 6.8 rennin phân cắt trung bình 1/33 còn ở pH= 2.3 thì phân cắt 1/8 số liên kết peptide trong phân tử casein

d Sự họat hóa prorennin thành rennin:

Rennin có trong màng nhày dạ dày ở dạng tiền enzyme là prorennin, gồm 2 phân đọan là prorennin A và B

Prorennin là một chuỗi protein đơn chứa 3 cầu nối disulfite, nó được giữ lại trong phân tử rennin hỗ trợ cho hoạt động của enzyme

Prorennin ổn định ở pH = 5.3 – 9, dạng thô hòan tòan ổn định ở pH = 8

Prorennin ở môi trường có ure 6M thì nhanh chóng bị phân hủy và có thể trở thành dạng họat động

 Quá trình họat hóa prorennin:

Sự họat hóa prorennin thành rennin xảy ra ở pH <5, xảy ra rất mạnh ở pH <3 Trong quá trình họat hóa prorennin, 10-15% protein được tách ra dưới dạng peptide Họat động của prorennin bao gồm sự phân tách chuỗi peptide từ đầu cuối N của prorennin, với sự giảm trọng lượng phân tử từ 36.000 còn 31.000, đầu N của phân tử prorennin là alanine, còn của phân tử rennin họat động là glycine

Khác với quá trình họat hóa pepsinogen, quá trình họat hóa prorennin không phải

là quá trình tự xúc tác và peptide được giải phóng ra không có tác động kìm hãm với rennin

e Các yếu tố ảnh hưởng đến họat tính của enzyme rennin:

-Họat động xúc tác tối ưu của rennin ở pH=3.7; pH tối ưu của rennin nằm ở vùng pH acid yếu hơn so với pepsin và thay đổi tùy theo cơ chất vào khoảng 3.4- 4 Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid vừa phải và cần có sự hiện diện

Ca2+ Ở pH =3.7, các ion Ca2+ làm tăng họat độ rennin, những cation hóa trị +1 làm giảm hoạt độ của nó

-Chất kìm hãm có tác dụng hiệu quả nhất lên rennin là dung dịch H2S 0.0001M và MgCl2 Rennin và prorennin bị bất họat nhanh chóng bởi ure

-pH :

Ở pH = 2 trong NaCl

rennin họat động nhanh

nhưng hình thể không ổn

định

Ở pH = 5 rennin họat

động chậm nhưng hình thể

ổn định và được bảo vệ tốt,

thêm vào đó ở nồng độ NaCl

2M sẽ tăng khả năng họat

động của enzyme.(Rand và

Ernstron chứng minh)

Ở pH = 7 có sự tự phân

hủy và hoạt tính thủy phân

của rennin ở pH này rất thấp Họat tính bị giảm khi pH >6 kèm theo sự xuất hiện protein kết tủa trong dung dịch ở nhiệt độ cao

Rennin bị mất họat tính nếu để lâu trong môi trường kiềm yếu pH = 9 , bị bất họat nhanh chóng trong môi trường acid mạnh

f Bảo quản rennin:

Rennin tinh khiết được bảo quản ở 15oC Dịch rennet được bảo quản ở nồng

độ muối cao 14-20% và có thể thêm Na-benzoate và propylene-glycol để bảo quản

2 Dạ dày bê:

a Cấu trúc dạ dày:

-Dạ dày là một đọan phình ra của ống tiêu hóa có tác dụng:

chứa đựng thức ăn, nhào trộn thức ăn để thấm qua dịch vị

Thức ăn sẽ chịu sự tiêu hóa của các enzyme tiêu hóa chứa trong dịch vị, chuẩn bị giai đoạn chính của việc tiêu hóa ở ruột non

-Hệ dạ dày kép gồm 4 túi: trong đó 3 túi trước (dạ cỏ, dạ tổ ong, dạ lá sách) gọi chung là dạ dày trước, không có tuyến tiêu hóa riêng, có chức năng tích trữ, nhào trộn và chuyển hóa thức ăn Túi thứ 4 gọi là dạ múi khế tương tự dạ dày đơn,

có hệ thống tuyến tiêu hóa phát triển mạnh

 Các tuyến chính của dạ dày:

Tế bào niêm dịch bài tiết chất nhầy

Tế bào chính bài tiết pepsinogen, rennin, galactinase

Tế bào viền bài tiết HCl

Tế bào bài tiết gastrin

b Sự tiêu hóa thức ăn trong dạ dày:

Các men tiêu hóa cơ bản trong dịch dạ dày là protease và lipase

Các protease được tiết ra trong dạ dày là các enzyme: pepsin, rennin, gelatinase và cathepsin

Dạ dày bê có cấu trúc khác so với dạ dày bò: bê mới đẻ sự phát triển về hình thái và chức năng của cơ quan tiêu hóa chưa đầy đủ: dạ cỏ và dạ tổ ong chiếm 30% tổng số dung tích dạ dày, dạ múi khế và lá

lách chiếm 70%, đặc biệt là ngăn thứ tư

của dạ dày bê chứa lượng rennin rất cao

giúp cho bê tiêu hóa sữa

Sự tiêu hóa của chúng cũng giống

như sự tiêu hóa của gia súc có dạ dày đơn

Sữa được dẫn trực tiếp qua rãnh thực quản

xuống dạ lá sách và dạ múi khế để tiêu hóa

nhờ có men tiêu hóa là rennin

c Mối liên hệ giữa enzyme rennin và dạ dày bê:

− Rennin có vai trò chuyển hóa sữa trong dạ dày ở ngăn thứ 4 của bê bởi sự thay đổi sữa từ dạng dịch sang dạng khối (gel)

− Họat động đông tụ sữa diễn ra trong dạ múi khế bào thai của bò khỏang 6 tháng

và tăng cao trong khỏang giữa thai bò tháng thứ 9 và bê non đang bú sữa 3 -4 ngày tuổi

− Ở động vật còn non, cấu trúc dạ dày có phần thay đổi và có hàm lượng rennin phụ thuộc vào tuổi sinh lý và phụ thuộc vào loài động vật

Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+ Ca kết tủa ở dạ dày, phần nhũ thanh còn lại của sữa chuyển xuống ruột non để tiêu hóa Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiễm pepsin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepsin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi

II Phương pháp thu nhận:

 Hóa chất:

− Muối NaCl, HCl sử dụng để kết tủa thu enzyme, nên hóa chất phải tinh khiết, khô, không lẫn tạp chất, nhất là kim lọai nặng vì gây tủa và bất họat enzyme

− Na-benzoate: chất bảo quản

 Thiết bị: máy điều nhiệt, máy ly tâm, máy quang phổ kế, máy nghiền đồng hóa, máy đo pH, cân Mettler K7, cân Prolabo

 Nguyên liệu:

Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non (dạ múi khế) dưới 5 tháng tuổi

 Quy trình: gồm 2 giai đọan: thu nhận dung dịch rennet (có chứa rennin) và thu nhận rennin

1 Giai đọan 1: Thu nhận dung dịch rennet

*Giải thích quy trình:

 Xử lý sơ bộ:

Tách mỡ, rửa sơ: Lấy phần múi khế của bao tử bê và lộn ngược một cách nhẹ tay

để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, cân trọng lượng Rửa nhẹ bằng nước lạnh, không nên rửa quá kỹ sẽ làm mất enzyme, sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%

 Xay nhuyễn:

Dạ dày bê

Xử lý sơ bộ

Xay nhuyễn

Trích ly

Lọc

HCl 0.2% và

0.7% acid boric

Tỷ lệ 1:3 theo V

HCl 6M NaCl 15%

Bã

Hoặc nước muối 10%

Tỷ lệ 1:3 theoV

Dịch rennet

− Dùng kéo cắt nhuyễn màng nhầy dạ dày thành miếng nhỏ khoảng 1cm rồi xay nhuyễn đồng nhất nhằm phá vỡ các mô tế bào tạo điều kiện cho quá trình trích ly

 Trích ly:

− Thêm HCl 0.2% để chỉnh pH 2 – 3 và 0.7% acid boric trên tổng V (có tác dụng bảo quản), tỷ lệ 1:3 theo V Hoặc thêm dung dịch nước muối 10%, tỷ lệ 1:3 theo V

− Giữ mẫu trong tủ ấm 35-40oC qua 30 giờ

 Mục đích: ở pH từ 2 – 3 và nhiệt độ 35 – 40oC giúp quá trình họat hóa prorennin thành rennin xảy ra rất mạnh

− Thêm HCl 6M chỉnh lại pH của dung dịch về 4 sẽ cho họat tính enzyme cao, khả năng hòa tan tốt

 Lọc: Vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc bằng vải màn và vải nhiều lớp

ta thu được dịch rennet chứa rennin họat động và tiền rennin bất họat

− Dung dịch rennet thu nhận có màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm hoặc bột màu trắng đến nâu nhạt, được bảo quản ở nồng độ muối cao 14-20% và thêm chất bảo quản như sodium benzoate, propylene glycol

2 Giai đọan2: thu nhận rennin từ dịch chiết

*Giải thích quy trình:

5000 vòng/phút

45 phút

Natribenzoate

Propylene glycol

Dịch rennet Khuấy

Kết tủa NaCl 22-23%, Gelatin

Ly tâm thu tủa

Tinh sạch

Sấy khô

Rennin tinh khiết

Rennin thô Sấy khô

 Khuấy:

Dịch rennet được khuấy đều, bổ sung thêm chất bảo quản Natri bezoat 1% và propylene glycol để tránh VSV phát triển trong dung dịch, chống oxy hóa…

 Tủa:

Dung dịch rennet được thực hiện sự kết tủa bằng cách bão hòa dung dịch với NaCl hoặc acid hóa dung dịch hoặc cả 2 cách Gelatin được thêm vào thường xuyên có tác dụng là giá để hấp thụ các chất cặn bã, giúp cho quá trình tủa enzyme được dễ dàng hơn

− Tiến hành tủa enzyme theo phương pháp diêm tích với muối trung tính bằng cách cho từ từ một lượng NaCl tinh thể nồng độ khỏang 22-23% vào, khuấy nhẹ cho đến khi dung dịch bão hòa, để tủ lạnh 20 phút

 Ly tâm:

Hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm trong 45 phút, tốc độ 5000 vòng/phút để thu tủa Tủa thu được là rennin thô (chứa muối, các protein lạ và ít protein tinh khiết)

 Sấy khô: Sau khi ly tâm thu phần kết tủa, đem sấy khô ở nhiệt độ phòng

 Tinh sạch rennin thô:

Có thể sử dụng bằng 2 phương pháp sau:

+Phương pháp 1: Thẩm tích bằng màng bán thấm( cellophan)

− Nguyên tắc:

Màng bán thấm (cellophan) có cấu tạo gồm nhiều lỗ nhỏ dung để tách muối và cho chất có phân tử lượng nhỏ qua túi và giữ lại những chất có phân tử lượng lớn theo nguyên tắc khuyếch tán từ nồng độ cao (dung dịch trong cellophane) đến nồng độ thấp (bên ngoài cellophane) cho đến khi đạt cân bằng nồng độ

− Thực hiện:

Cho rennin thô vào giấy cellophane, đặt vào nước cất lạnh ở nhiệt độ 0-4oC, khuấy

và thay nước cất lạnh (2 ngày đêm) cho đến khi thử âm tính với AgNO3, làm khô nhanh túi bằng sấy quạt gió, nhiêt độ 30-40oC Cân trọng lượng túi sau khi sấy khô Hiệu số trọng lượng túi ban đầu và sau khi thẩm tích là lượng NaCl đã thẩm tích qua màng

+Phuơng pháp 2: phương pháp sắc kí DEAE sephadex G-50

− Nguyên tắc:

Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhau chạy qua cột chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trình tách những phân tử có kích thước và trọng lượng khác nhau Những chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ gel do đó sẽ di chuyển chậm qua cột Các chất có phân tử lượng lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài hạt gel nên sẽ chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột trước Sau

đó, chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lần lượt đi ra theo mức độ phân tử lượng của chúng Kết quả là tách được các chất có phân tử lượng khác nhau thành các phân đoạn theo trình tự các phân đọan có trọng lượng phân tử lớn ra truớc, các phân đọan có trọng lượng phân tử nhỏ ra sau

− Thực hiện:

 Hòa tan tủa trở lại bằng 50ml dung dịch đệm citrate 0.025M, pH 5.1 ta được dung dịch A Hút 5ml dung dịch A thêm vào dung dịch đệm citrate 0.025M, pH 5.1 (để qua đêm)

 Sau đó đem ly tâm 15000 vòng/phút trong 50 phút bỏ cặn Phần dịch thu được cho qua cột DEAE sephadex G-50 (từ 1-5% thể tích cột) và được cân bằng bởi dung dịch đệm citrate 0.025M

 Sau đó enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0-18%

 Thu mẫu qua cột: Protein được giải phóng theo chiều gradient nồng độ của muối NaCl từ 0-18% với tốc độ chảy 30ml/h.Ta thu được 15phân đọan và

2 peak A, B Hiệu suất về họat tính enzyme: pepsin 20% và chymosin 72%

Xác định hoạt tính thủy phân(proteolytic activity) của enzyme bằng cách ủ với hemoglobin trong 10 phút, đo mật độ quang OD ở bước sóng 280nm

Thu được bảng kết quả sau:

Độ tinh sạch của enzym:

tinhsach R

E

η =

E

Etinh sạch : hoạt lực đông tụ riêng của enzym sau khi tinh sạch (UI/ mg protein)

ER: Hoạt lực đông tụ riêng của dịch enzym thô (UI/mg protein)

 Sấy đông khô:

 Nguyên tắc của quá trình sấy đông khô:

Nguyên tắc của phương pháp sấy đông khô là nước ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển từ trạng thái đá (rắn) vào trạng thái khí mà không làm hỏng nguyên liệu

 Quá trình sấy đông khô: gồm 3 giai đoạn:

o Giai đoạn 1 – làm lạnh: đây là giai đoạn quan trọng làm lạnh nguyên liệu xuống điểm eutectic (điểm có nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha lỏng và pha rắn cùng tồn tại) - đảm bảo quá trình thăng hoa xảy ra ở giai đoạn kế tiếp

o Giai đoạn 2 – sấy bậc 1: tạo áp suất chân không và hạ nhiệt độ xuống – 40oC

để nước trong nguyên liệu thăng hoa ở trạng thái lạnh

Sample

Clotting activity (%) C

Proteolytic activity (P) (OD 280nm/ml)

C/P

Stock

-o Giai đ-oạn 3 – sấy bậc 2 : giai đ-oạn này có nhiệt độ ca-o hơn giai đ-oạn sấy bậc

1 để giúp cho nguyên liệu giữ nguyên các tính chất

hóa lý Giai đoạn này áp suất chân không tiếp tục

thúc đẩy quá trình thăng hoa

 Tính chất của sản phẩm sấy đông khô:

Nếu sấy ở nhiệt độ thường dễ làm enzyme bị hư hỏng,

mất đi tính chất ban đầu thì phương pháp này giúp cho

enzyme giữ nguyên liệu được tính chất hóa lý và có thể bảo

quản trong thời gian dài

Sau khi sấy đông khô, enzyme thu được có dạng mảnh, màu trắng hoặc phớt hồng

Xác định hiệu suất thu hồi enzym sau quá trình sấy đông khô:

enzymesausay ngandaday

m H m

= H: hiệu suất thu hồi enzym (%)

menzymsausay : khối lượng enzym thu được sau khi sấy đông khô (g)

mngandaday : khối lượng ngăn dạ dày chứa enzym đang khảo sát (g)

III Các phương pháp phân tích chất lượng enzyme.

− Dịch rennet bê tiêu chuẩn (1000 IMCU): chứa 98% chymosin và <2% pepsin.

− Họat tính của rennin: trong 10 phút có thể làm đông tụ sữa với số lượng gấp 72 triệu lần khối lượng enzyme Hoạt động mạnh ở pH 3.8 và 40oC.

1) Khảo sát hàm lượng protein theo phương pháp Bradford:

• Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu khi cho Coomassie Brilliant Blue – G250 liên kết với protein trong môi trường acid Thuốc nhuộm này sẽ tạo với protein, tương tác với các nhóm kị nước và các nhóm mang điện dương trên phân tử protein thành một phức chất màu xanh, có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 595nm Cường độ màu này tỉ lệ thuận với hàm lượng protein, nên bằng phương pháp so màu có thể xác định được hàm lượng protein

• Ưu điểm: đây là phương pháp có độ nhạy cao, chính xác vài g, hóa chất đơn giản, ít tốn kém

Xác định hàm lượng protein có trong mẫu enzyme:

3 Δ

PU

P

−

−

=

P: hàm lượng protein của mẫu enzyme đem xác định hàm lượng protein (mg/mL)

OD: hiệu suất mật độ quang của mẩu enzyme đo được ở λ = 605nm (A)

F: độ pha loãng mẫu enzyme

VPU: thể tích mẫu enzyme đem xác định hàm lượng protein

×

s E

V

T V

=

Xác định hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme:

3

mau

V

m

−

=

Vmau: thể tích mẫu dịch enzyme (mL)

mmau: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg)

menzym: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)

Pt: hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme (mg proetin)

2) Khảo sát hoạt lực đông tụ sữa của enzyme:

Protease ngoài khả năng thủy phân protein đều có khả năng đông tụ sữa tùy mức

độ khác nhau, mạnh nhất là rennin, sau đó là pepsin và các protease khác Quá trình đông tụ sữa được ứng dụng trong sản xuất phomai

• Nguyên tắc:

Xác định hoạt độ đông tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm đông tụ một thể tích dung dịch sữa có nồng độ xác định

Đơn vị hoạt lực đông tụ sữa: là lượng enzyme cần đủ để đông tụ 1.0mL sữa trong 1 phút ở 50oC

Hoạt lực đông tụ sữa của enzyme trong 1mL

E: hoạt lực đông tụ sữa (UI/mL)

VS: thể tích dung dịch sữa (mL)

VE: thể tích dung dịch enzyme sử dụng (mL)

T: thời gian đông tụ sữa (phút)

F: độ pha loãng dịch enzyme

Tổng hoạt lực đông tụ sữa

3

mau

V

m

−

Et: tổng hoạt lực đông tụ sữa (UI)

Vmau: thể tích mẫu dịch enzyme (mL)

mmau: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg)

menzyme: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)

Hoạt lực đông tụ riêng của enzyme

t R t

E E P

ER: hoạt lực đông tụ riêng của enzyme (UI/mg protein)

Et: tổng hoạt lực đông tụ sữa (UI)

Pt: hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme (mg protein)