thu nhận enzyme bromelin từ phế liệu dứa

thu nhận enzyme bromelin từ phế liệu dứa tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả...

PHẦN NỘI DUNG

I TỔNG QUAN

I.1 Nguồn nguyên liệu – Phế liệu dứa

I.1.1 Công dụng

 Cây dứa (Ananas comusus) thuộc họ đơn tử diệp, thuộc họ Bromeliaceae có nguồn gốc từ Nam Mỹ

 Hiện nay, ở nước ta loại dứa đang đựơc trồng nhiều nhất là Ananas comusa được dùng làm nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, là nguồn thu nhận enzyme và được sử dụng trong một số lĩnh vực như mỹ phẩm, dược phẩm…

 Phần thân và lá sau khi thu hoạch có thể làm giấy, lấy sợi, làm phân bón…

I.1.2 Thành phần của dứa

Trong quả dứa chín, nước chiếm đa số, hàm lượng 80- 86%, cacbohyrat chiếm 10- 18% (trong đó saccharose 60- 67%, glucose và fructose chiếm 30- 40%), protein 2- 3%, axit hữu cơ 0.1- 1.6%( axit citric chiếm 87% và axit maleic chiếm 13%), tro 0.3%, sắc tố 0.03- 0.6% và các hợp chất phenolic( tạo màu), các hợp chất tạo mùi, các vitamin: A, B1, C… và enzyme bromelin

I.2 Enzyme bromelin

I.2.1 Đặc điểm

 Bromelin là tên gọi chung của nhóm enzmye thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ cây dứa

 Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa, có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH6-8

 Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc họ Sung

 Enzyme bromelin có trọng lựơng phân tử lớn khoảng 33000 Da, lớn 1.5 lần so với papain

I.2.2 Tính chất của Bromelin

 Thành phần chủ yếu của Bromelin có chứa nhóm sulfhydryl, trong dịch chiết Bromelin có chứa một ít peroxidase, phospatase acid và chất cản protease

 Hiện nay người ta ghi nhận trong thân có chứa 8 thành phần cơ bản có hoạt tính thủy phân protein

 Dịch chiết Bromelin toàn phần hoạt động trong khoảng pH 4,5- 9,8 Bromelin chiết tách từ các bộ phận khác nhau của cây dứa sẽ có hoạt động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính sinh lý giống nhau Bromelin không ổn định với nhiệt độ trong quá trình chiết tách hay điều kiện bảo quản không thích hợp

 Bromelin có thể thấm hoàn toàn qua dạ dày và ruột của động vật Nồng độ cao nhất trong máu được tìm thấy sau khi ăn 1 giờ nhưng khả năng thủy phân protein bị bất hoạt nhanh chóng có thể do hoạt động của các prtease nội sinh và yếu tố α − 2 − macroglobu line của huyết thanh

I.2.3 Cấu tạo hóa học của Bromelin

 Bromelin là một protease nhưng khác papain và ficin vì nó là một glicoprotein, mỗi phân tử có một glican gồm 3 manose, 2 glucosamin, 1 xylose và 1 fructose Sợi hydratcacbon liên kết hoán vị với sợi polipeptid

 Khi phân tích thành phần amino axit của Bromelin thân và Bromelin quả thì tùy theo phương pháp thu nhận mà thành phần axit amin khác nhau Bromelin có thành phần amino axit thay đổi trong khoảng 321- 144 và Bromelin quả là 283- 161 amino axit

 Bromelin thân có một sợi polipeptid có amino axit ở đầu amin là valine và ở đầu cacbohydrat là glicine, Bromelin quả có amino axit ở đầu là alanine

I.2.4 Cấu trúc không gian của Bromelin

 Theo Murachi và Busan, cấu trúc bậc một của Bromelin như sau:

Ser- Val- Lis- Asn- Gln- Asn- Pro- Cys- Gli- Ala- Cys- Tryp-

- Gli- Cys-

Lis-OH OH OH

OH

OH

OH OH

OH

OH

OH OH

CH OH2

CH OH2

CH OH 2

OH OH

NHCONH3

NHCONH3

NHCOCH2

C N CH

CH2

Fructose

Maltose

Maltose

Maltose

Xylose

Glucofamine

 Bromelin có trung tâm hoạt động chứa Cysteine và 2 sợi polippetid liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S-, phân tứ có hình cầu do cách sắp xếp phức tạp

 Trong Bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong xúc tác và trong phân tử có 5 cầu nối dislfit, ngoài ra trong phân tử có các ion Zn2+ có vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme

I.2.5 Tính chất vật lý Bromelin

cm

tán)

32.100(tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên

35.500(tính bằng phương pháp Archibald)

I.2.6 Hoạt tính của Bromelin

I.2.6.1 Hoạt tính phân giải

 Bromelin có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase

 Bromelin thân có nhiều cơ chất tự nhiên và có thể phân giải cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp

• Khả năng phân giải cơ chất tự nhiên của Bromelin

Đối với cơ chất là Casein, hoạt tính phân giải của Bromelin thân cao hơn Bromelin quả xanh và Bromelin quả chín

Cơ chất Hoạt tính phân giải Casein (UI/mg)

Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín

• Khả năng phân giải cơ chất nhân tạo của Bromelin

Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín

Ở nhiệt độ 5OC, pH= 6

Benzoyl-L-Arginine amid

Benzoyl-L-Arginine ethyl ester

Benzoyl-L-Arginine methyl ester

(hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau)

I.2.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của Bromelin

• Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những cơ chất khác nhau thì hoạt tính của Bromelin khác nhau

 Ví dụ: Nếu cơ chất là hemoglobin thì Bromelin phân giải mạnh hơn papan 4 lần

Nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của Bromelin tương tự papain

Nếu là cơ chất tổng hợp thì khả năng phân giải của Bromelin yếu hơn papain

• Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ thay đổi là ảnh hưởng đến hoạt tính, nồng độ, dạng tồn tại của

enzyme, nồng độ cơ chất

 Ví dụ: Ở dịch chiết quả (pH=3.5) khi tăng nhiệt độ lên 60OC, Bromelin vẫn còn hoạt tính nhưng Bromelin tính khiết lại rất nhạy cảm với nhiệt độ

Quá trình đông khô làm mất 27% hoạt tính

• Ảnh hưởng bởi pH: pH tối thích của Bromelin không ổn định mà tùy thuộc nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch đệm, sự có mặt của chất tăng hoạt tính Bromelin có biên độ pH rộng 3- 10 nhưng pH tối thích của enzyme là 5- 8 tùy cơ chất

 Ví dụ: Bromelin thân đã tinh sạch 1 phần có hoạt tính cao nhất ở pH 6 và pH 8, ổn định ở pH 3.5 – 5.6 với nhiệt độ 63OC

• Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến Bromelin vì chúng thừơng gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme

 Ví dụ: Muối thủy ngân ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của Bromelin và mức độ kìm hãm tùy vào nồng độ muối

Các ion kim loại: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử của Bromelin

• Ngoài ra, Bromelin còn bị ức chế bởi các ion hay các hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm –SH, các tác nhân oxi hóa, halogen, ankyl hóa, …:iodoacetate, bromoacetate, methyl bromur…

• Ảnh hưởng bởi trạng thái và điều kiện bảo quản:

Hoạt tính (UI/mg protein)

I.2.7 Cơ chế tác động của Bromelin

 Casein và hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất

 Đầu tiên, Bromelin kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polipeptid và axit amin Proetein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazone khử ester giải phóng enzyme, axit amin và peptid

 Ở giai đoạn đầu, Zn2+ kết hợp với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động hình thành mercaptid phân li yếu

( nhưng vẫn có khả năng tạo liên kết phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của protein: amin, cacboxyl,…)

Enzyme-SH + Zn2+  Enzyme-S-Zn + H+

 Nhóm –SH trong trung tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không gian được bảo vệ

ổn định

II QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ THU NHẬN BROMELIN TỪ PHẾ LIỆU DỨA

II.1 Các phương pháp thu nhận

II.2 Giải thích quá trình thu nhận:

II.2.1 Xử lý nguyên liệu thu dịch enzyme thô:

 Enzyme bromelin có thể thu được trong thân, trong phần thịt quả và trong chồi quả

 Phế liệu dứa ( chồi, vỏ, thân, cùi dứa ) được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc

 Sau đó đem dịch lọc li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để lọai bỏ chất sơ sẽ thu được dịch chiết có chứa Bromelin

 Khi sử dụng phương pháp siêu lọc để tinh sạch enzyme bromelin thì các hợp chất pectin trong dịch chiết quả sẽ làm tăng độ nhớt của dịch chiết làm trở ngại quá trình lọc

Vì vậy người ta có thể dùng phương pháp đồng hóa nguyên liệu dưới điều kiện áp suất cao thì có thể phá vỡ tế bào mô dứa, giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzyme nội bào, mà không làm biến tính chúng

 Khi đồng hóa nguyên liệu ở 15Mpa:

Đô nhớt trong dịch chiết giảm xuống, giá trị độ brix và pH thay đổi không đáng kể, sản lượng và họat tính của enzyme gia tăng, sản lượng enzyme tăng gấp 2 lần (1.27g/500mL dịch chiết từ quả dứa kể

cả phần lõi) với họat tính cao nhất là 2.06 UI/mg2

 Khi đồng hóa nguyên liệu ở 20Mpa :

Sản lượng enzyme thu được từ vỏ quả là 0.9g/500mL dịch chiết

II.2.2 Các phương pháp thu tủa Bromelin thô:

II.2.2.1 Phương pháp kết tủa:

 Nguyên tắc : Điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH=7 nên trong điều kiện sinh lý, các phân

tử protein tích điện âm thừa kết hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dịch, protein liên kết với một lượng nước khá lớn) hoặc với các ion dương Sự kết hợp với nước tạo ra một lớp nước xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng

 Để có thể kết tủa được enzyme phải phá vỡ lớp nước liên kết bằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặc các hóa chất có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein, giúp cho protein tủa xuống

 Các dung môi thường được sử dụng để kết tủa bromelin là: Acetone và ethanol,… có tác dụng làm giảm hằng số điện môi của dung dịch nên làm giảm độ hòa tan của protein

 Các hóa chất khác như muối trung tính ở nồng độ cao ( vì có độ hòa tan rất tốt ) Ở nồng độ muối thấp, đa số các protein và enzyme có độ hòa tan lớn nên chỉ có một số tạp chất kết tủa Khi tăng dần nồng nồng độ muối thì có hiện tượng tranh giành lớp vỏ hirat của prtein làm các protein gắn kết lại với nhau và tủa xuống Ở nầng độ muối bão hòa thì toàn bộ các prtein và enzyme bị kết tủa.Muối của các ion hóa trị II tủa protein tốt hơn các muối của các ion hóa trị I, các muối thường dùng là:

(NH4)2SO4, MgCl2 vì rẻ tiến và dễ tìm

II.2.2.1.1.Tủa bằng ethanol:

 Làm lạnh dung dịch nước dứa sau li tâm, cho ethanol 960 (đã được làm lạnh) vào theo tỷ lệ 4 nước dứa: 1 cồn, trộn đều ở 00C trong 3- 4 giờ

 Li tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút và tủa bằng acetone rồi thu nhận Bromelin thô

 Dẫn chứng bằng một số kết quả từ thực nghiệm:

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng:

Khảo sát tỷ lệ dịch enzyme và cồn 96OC

** Cách thực hiện

Thể tích dịch enzyme

(ml)

** Kết quả:

** Nhận xét và kết luận: Lượng tác nhân tủa càng nhiều thì hàm lượng protein thu được càng nhiều, tủa bằng tỷ lệ 1:5 hàm lượng prtein cực đại; nhưng sau đó hàm lượng giảm do lượng tác nhân nhiều làm hẳng số điện môi giảm, các prtein tự tháo gỡ liên kết Hoạt tính Bromelin cực đại ở tỷ lệ 1:2

Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của Bromelin ở tỷ lệ 1:2:

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính Bromelin

** Nhận xét và kết luận: Khi nhiệt độ tăng thì hoạt tính của enzyme tăng nhưng khi nhiệt độ tăng tới hạn thì hoạt tính Bromelin giảm dần do bị biến tính Hoạt tính Bromelin cực đại khi tủa bằng cồn 96OC tỷ

lệ 1:2 ở nhiệt độ 47OC

Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của Bromelin ở tỷ lệ 1:2:

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính Bromelin

** Nhận xét và kết luận: : Khi pH tăng thì hoạt tính của enzyme tăng nhưng khi pH tăng tới hạn thì hoạt tính Bromelin giảm dần do bị biến tính, tuy nhiên ảnh hưởng không đáng kể như ảnh hưởng của nhiệt

độ Hoạt tính Bromelin cực đại khi tủa bằng cồn 96OC tỷ lệ 1:2 ở nhiệt độ 47OC pH 7

II.2.2.1.2 Tủa bằng acetone:

 Thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào một dung dịch nước dứa sau li tâm, để yên trong một giờ ở nhiệt độ 0- 40C

 Li tâm với tốc độ 6000vòng/phút trong 5 phút, lọai bỏ tủa

 Thêm hai thể tích acetone lạnh vào để 1 giờ ở 0- 40C, li tâm thu tủa, rửa tủa bằng acetone lạnh

 Bromelin trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ do đó để sự kết tủa đạt hiệu quả cao thường tiến hành quá trình kết tủa trong điều kiện lạnh (00c – 40c)

 Sau khi thu được tủa thì rửa sạch tủa bằng acetone và làm khô thật nhanh để Bromelin không bị biến tính

 Dẫn chứng bằng một số kết quả từ thực nghiệm:

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng:

Khảo sát tỷ lệ dịch enzyme và aceton:

** Cách thực hiện

Thể tích dịch enzyme

(ml)

** Kết quả:

1:3 214106 214.106 1708.75 7.98

** Nhận xét và kết luận: Lượng tác nhân tủa càng nhiều thì hàm lượng protein thu được càng nhiều, tủa bằng tỷ lệ 1:5 hàm lượng prtein cực đại; nhưng sau đó hàm lượng giảm do lượng tác nhân nhiều làm hẳng số điện môi giảm, các prtein tự tháo gỡ liên kết Hoạt tính Bromelin cực đại ở tỷ lệ 1:5

Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của Bromelin ở tỷ lệ 1:5:

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính Bromelin

** Nhận xét và kết luận: Khi nhiệt độ tăng thì hoạt tính của enzyme tăng nhưng khi nhiệt độ tăng tới hạn thì hoạt tính Bromelin giảm dần do bị biến tính Hoạt tính Bromelin cực đại khi tủa bằng aceton tỷ lệ 1:5 ở nhiệt độ 47OC

Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của Bromelin ở tỷ lệ 1:5:

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính Bromelin

** Nhận xét và kết luận: : Khi pH tăng thì hoạt tính của enzyme tăng nhưng khi pH tăng tới hạn thì hoạt tính Bromelin giảm dần do bị biến tính, tuy nhiên ảnh hưởng không đáng kể như ảnh hưởng của nhiệt

độ Hoạt tính Bromelin cực đại khi tủa bằng aceton tỷ lệ 1:5 ở nhiệt độ 47OC pH 7

II.2.2.1.3 Tủa bằng muối ammonium sulfate (NH4)2SO2 :

 Cách thực hiện

dứa sau li tâm cho từ từ 532g ammonium sulfate vào

khuấy đều (dung dịch đạt độ bão hòa ammonium sulfate

là 70%)

10-15 phút, sau đó đem li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút để

thu nhận tủa

Sự kết tủa protein bằng ammonium sulfate (đặc biệt là ở nhiệt độ thấp) là một quá trình thuận nghịch, tủa dễ hòa tan bằng nước và muối có thể được lọai ra khỏi protein bằng cách thẩm tích

Phương pháp này có thể thực hiện ở nhiệt độ thường

 Những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng của chế phẩm enzyme là:

 Nồng độ của ammonium sulfate

 pH của dung dịch chiết

 Nhiệt độ kết tủa

 Thời gian tiếp xúc của các tác nhân đệm và dịch tiết

Thông thường nếu sử dụng phương pháp tủa với (NH4)2SO2 thì cứ 60Kg nguyên liệu tươi thì thu được khỏang 1 Kg Bromelin thô

 Dẫn chứng bằng một số kết quả từ thực nghiệm:

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng:

Khảo sát tỷ lệ dịch enzyme và aceton:

** Cách thực hiện

** Kết quả:

Các phân tử enzyme trong dung môi hữu cơ

Tỷ lệ Hàm lượng protein Hoạt tínhbromelin Hoạt tính riêng

** Nhận xét và kết luận: Lượng tác nhân tủa càng nhiều thì hàm lượng protein thu được càng nhiều, trong trường hợp tủa bằng (NH4)2SO4 ngoài protein còn có lượng muối dư do nồng độ quá cao nên hàm lượng tăng dần đến 100% Hoạt tính Bromelin cực đại ở nồng độ(NH4)2SO4 80%

Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của Bromelin ở nồng độ (NH4)2SO4 80% :

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính Bromelin

** Nhận xét và kết luận: Khi nhiệt độ tăng thì hoạt tính của enzyme tăng nhưng khi nhiệt độ tăng tới hạn thì hoạt tính Bromelin giảm dần do bị biến tính Hoạt tính Bromelin cực đại khi tủa bằng (NH4)2SO4

80% ở nhiệt độ 47OC

Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của Bromelin ở nồng độ (NH4)2SO4 80%:

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính Bromelin

** Nhận xét và kết luận: : Khi pH tăng thì hoạt tính của enzyme tăng nhưng khi pH tăng tới hạn thì hoạt tính Bromelin giảm dần do bị biến tính Hoạt tính Bromelin cực đại khi tủa bằng (NH4)2SO4 80% ở nhiệt

độ 47OC, pH 7

 So sánh hiệu quả giữa 3 phương pháp:

Tác nhân tủa Hàm lượng protein (mg/g) Hoạt tính Bromelin (UI/g) Hoạt tính riêng (UI/mg)

Trong 3 phương pháp thì tủa bằng Aceton cho hiệu quả cao nhất

II.2.2.2 Phương pháp hấp phụ:

II.2.2.2.1 Hấp phụ bằng Kaolin:

Kaolin: là một chất có tính hấp phụ tốt

 Kích thước hạt nhỏ hơn 1 µm do diện tích tiếp xúc giữa

hạt kaolin và chất bị hấp phụ tăng lên rất nhiều

 Trên bề mặt kaolin có rất nhiều ion OH- và O2-, những

ion này có khả năng liên kết tương đối bền vững với chất

bị hấp phụ

 Cách thực hiện:

Cấu tạo của Kaolin