thu nhận enzyme papain từ đu đủ

thu nhận enzyme papain từ đu đủ tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả các lĩnh...

THU NHẬN ENZYM PAPAIN

TỪ ĐU ĐỦ

Nhóm HTV:

Phan Huy Huy Phạm Quốc Trung

Lư Quốc Việt

I TỔNG QUAN VỀ ENZYM PAPAIN [2]:

Hình I.1: Nguồn nguyên liệu thu nhựa Hình I.2: Hoa đu đủ

để sản xuất papain

I.1 Đặc điểm chung:

Enzym papain được tách ra từ nhựa trái đu đủ xanh, thuộc nhĩm enzym thuỷ phân

cĩ nguốn gốc thực vật được nguyên cứu nhiều nhất về tính chất và cơ chế hoạt động Papain là một sulfhydryl protease, lần đầu tiên được tách ra bởi Bals và cộng sự của ơng, sau đĩ bởi Kimmel và Smith từ nhựa khơ

Theo danh pháp quốc tế, papain mang mã số 3.4.22.2, cĩ hoạt tính xúc tác tương tự như bromelin (trong dứa) và ficin (trong cây sung).

G.C.Roy là người đầu tiên phát hiện ra nhựa cây đu đủ là một nguồn enzym Ơng cơng bố báo cáo của mình trong tạp chí “Calaitta Medical Journal’’ Đến năm 1879, Wrutz

và Bouchet là những người đầu tiên sử dụng thuật ngữ “papain” để diễn tả tính chất phân huỷ protein của enzym trong nhựa đu đủ Ngày nay, thuật ngữ “papain” tiếp tục được sử dụng để miêu tả mủ đu đủ khơ được dùng rộng rãi trong cơng nghiệp và cả trong chế phẩm enzym thuỷ phân dạng kết tinh từ mủ.

Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trãi rộng khắp tồn bộ cây, ngoại trừ rễ Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất Nhựa là hỗn hợp enzyme chứa các protease sau: papain, chymopapain A (gốc aa cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc aa cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease Các tính chất vật lý của papain gần giống với chymopapain nhưng papain cĩ hoạt tính mạnh hơn gấp nhiều lần chymopapain.

I.2 Tính chất vật lý:

Bảng I.2.1: Tinh chất vật lý của papain:

Bột màu vàng hay nâu nhạt tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu

cơ nhưng tan một phần trong nước hay glycerine

Bền nhiệt

I.3 Tính chất hóa học :

 Cấu tạo hóa học

- Papain là một endoprotease chứa 16,1% N và 1,2% S

- Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain là một chuỗi polypeptide gồm 212 amino acid không chứa methionine, đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí cysteine 25

- Papain chưa hoạt hóa là hỗn hợp protein disulfurcysteine

 Cấu trúc không gian:

Phân tử papain có dạng cầu, mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt khe này, nhóm –SH của cysteine 25 ở bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe Phần xoắn α chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử

Phân tử papain có hai nhân kỵ nước, mỗi nhân nằm ở một phần của papain và cả hai nhân đều bắt đầu với một chuỗi xoắn α Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu nối nội phân tử

 Cấu trúc tâm hoạt động của papain:

Tâm hoạt động của papain gồm nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159 Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen

Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là:

Lys – Asp – Glu – Gly – Ser – Cys – Gly – Ser – Cys

Hình I.3.1: Tâm hoạt động của papain

 Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng:

Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase

Các endopeptidase thuỷ phân protein chủ yếu thành peptid:

(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH (-NH-CH(R)-COOH)i + (H2N-CH(R)-CO-)k

i + k = n

Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành các amino acid

So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxyl tự

do Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ

ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vị trí giữaY và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y (có Phe nằm ở vị trí thứ hai trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain

Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase

 Hoạt hoá papain:

Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do Vì vậy ta phải sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động Do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, hydrocyanic… Trong đó cysteine là chất hay dùng nhất Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ

 Bất hoạt:

Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxi hoá như: O2, O3, H2O2, iodur acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó

Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp Papain tác dụng với chloromethyl cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ (độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6 - 8 M)

(H2N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH (H2N-CH(R)-COOH)n’ + (H2N-CH(R)-CO-)k’

n’ + k’ = n

 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain:

• Nhiệt độ:

Papain là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC Ở dạng dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ trên 100oC thì sẽ mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch vì cấu trúc tâm hoạt động của enzym đã bị phá hủy hoàn toàn

Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng, trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự tự phân hoặc oxi hoá Papain dạng ổn định (có cấu trúc không gian ổn định) ở trạng thái khô có thể chịu được nhiệt độ sấy ở 115oC trong 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%

Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 8,5 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH > 12 Tuỳ thuộc bản chất của cơ chất mà pH tối ưu của papain khác nhau Papain dạng ổn định có thể chịu được pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút

• Dung môi:

Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70%, không bị giảm hoạt tính trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M, nhưng trong dung dịch TCA 10% papain bị biến đổi bất thuận nghịch

II PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN [2], [4], [7]: Quy trình công nghệ:

Nguyên liệu

Nghiền

Trích ly bã cát sạch

celite

Lọc

Chỉnh pH

Lọc

Kết tủa

bã

tủa xám NaOH

(NH 4 ) 2 SO 4

phân đoạn 1

Ly tâm 1

Ly tâm 2

Kết tinh

dịch lỏng

dịch lỏng NaCL rắn phân đoạn 2 Kết tủa

Papain

Tái kết tinh

Sấy chân không

dd NaCl bão hòa

1 Thu nhận nhựa đu đủ:

Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ Nhựa là hỗn hợp enzym chứa các protease sau: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase

IV, thiolprotease, trong đó papain chiếm tới 95%

 Điều kiện lấy nhựa:

- Cây đang sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhựa nhiều

- Quả: lấy ở những quả còn xanh, vỏ mịn, từ 0,3 – 1kg, độ 10 tuần tuổi là tốt nhất

- Thời gian lấy nhựa: sáng sớm

Hình II.1.1: Vườn đu đủ trồng để lấy nhựa.

 Cách tiến hành:

- Lấy nhựa ở quả xanh còn ở trên cây, dùng dao inox đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (không rạch sâu quá 2cm để dịch nước và tinh bột từ quả không bị trộn lẫn vào nhựa làm giảm chất lượng nhựa)

- Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 - 6 phút, lấy nhựa xong phải đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh trong thời gian chờ các công đoạn xử lý tiếp theo Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho nhựa tiếp xúc lâu với không khí, đảm bảo hoạt tính papain có trong nhựa Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào

Hình II.1.2: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ

•Lưu ý:

- Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì sẽ làm giảm chất lượng nhựa

- Quả có thể được rút nhựa trong suốt 4 - 7 ngày, lần đầu có thể chỉ cần một rạch là đủ, những lần thu nhựa sau rạch 2 - 3 đường giữa những đường rạch trước đó

- Cần tránh không cho nhựa tươi tiếp xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng, không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng… vì sẽ làm biến màu và giảm hoạt tính enzym Lọ, dao, muỗng… phải được làm bằng nhựa hoặc thép không rỉ

- Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% ẩm

2 Thu nhận papain :

2.1 Chuẩn bị:

Do trong nhựa đu đủ tươi ngoài papain, chymopapain còn có một số loại enzym, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác nên để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm loại bỏ các tạp chất trên Cách làm như sau:

- Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kĩ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dịch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cystein

hydrochloride trong 1000mL dung dịch NaOH 0,054M, kiềm được sử dụng để đưa

pH dịch chiết tới 5,7)

- Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300mL dung dịch cysteine Rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích dịch chiết lên 1l

- Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số

1, thời gian lọc có thể rất dài Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5,7

- Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzym được tiến hành trong điều kiện lạnh

2.2 Loại bỏ các chất không tan ở pH 9:

Thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110mL dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh pH của dịch chiết thu được ở trên lên pH 9 Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1 giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dịch trích trong

2.3 Quá trình phân đoạn bằng (NH 4 ) 2 SO 4 :

Cho (NH4)2SO4 vào dịch enzym đến 40% độ bão hòa, sau 1 - 2 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại để lấy chymopapain Tủa được rửa lại một lần nữa với 400 - 500mL dung dịch (NH4)2SO4 40% độ bão hòa

2.4 Quá trình phân đoạn bằng NaCl:

Hòa tan tủa trong 600mL dung dịch cysteine 0,02M, dung dịch thu được có pH 7-7,5, sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn Sau một giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa, bỏ dịch lỏng

2.5 Kết tinh:

Hoà tan tủa với 400mL dung dịch cysteine 0,002M ở nhiệt độ phòng thu được một dung dịch huyền phù có pH = 6,5 Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, duy trì ở 4oC qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể

2.6 Tái kết tinh:

Hòa tan tinh thể thu được ở bước trên trong nước cất ở nhiệt độ phòng tạo dung dịch có nồng độ protein khoảng 1% Sau đó cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dịch NaCl bão hòa (10mL/300mL dung dịch protein) Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng Dịch huyền phù được giữ ở 4oC qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4 - 5 giờ để thu nhận tinh thể Hoạt độ riêng của enzym có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên

Để tăng hoạt tính enzym, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trong dung dịch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000Ao và đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc

2.7 Sấy chân không:

Sấy chân không ở nhiệt độ 40oC thu nhận papain tinh chế.

Hình II.2.1: Trái và nhựa Đu đủ III. ỨNG DỤNG

Papain là loại protease được ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác nhau

• Trong công nghệ thực phẩm:

Protease, trong đó có papain được sử dụng rất rộng rãi trong chế biến thịt, cá và đã mang lại hiệu quả kinh tế cao Với phương pháp này, người ta có thể biến đổi những loại thịt cá rẻ tiền, khô cứng, những phần không ngon thành các chế phẩm có tính chất tốt hơn

Trong quy trình sản xuất bột cá cổ điển, người ta lợi dụng hệ enzym VSV thuỷ phân protease có sẵn trong trong cá để phân giải các protein trong thời gian dài và ở nhiệt độ thích hợp Ngày nay, việc bổ sung chế phẩm enzym, đặc biệt là papain không những rúùt ngắn thời gian thuỷ phân mà còn ngăn ngừa được các vi khuẩn gây thối, do nhiệt độ hoạt động tối ưu của nó là 70oC

Bảng III.1: Mức độ phân giải (%) một số protein thực phẩm phụ thuộc trạng thái cơ chất (sống – chín) của papain [3]:

Tên cơ chất Trạng thái cơ chất

Lòng trắng

Ngoài ra, papain còn ngăn ngừa sự làm đục bia và các loại nước giải khát khi ướp lạnh

do nó phân huỷ các vết protein hoà tan trong bia và các loại nước giải khát khác

Hình III.1: Một loại mặt nạ dưỡng da có chứa enzym papain và những dưỡng chất của đu đủ [8].

• Trong y học:

Chữa bệnh giun kim, giun đũa

Là thành phần chính của các loại thuốc trị bệnh biếng ăn, ăn không tiêu

Dùng tiêu huỷ các dị vật thừa, các protein chết trong cơ thể Hỗn hợp papain- bromelin- celluloza được sử dụng hiệu quả để phá sỏi thận

celluloza được sử dụng hiệu quả để phá sỏi thận

Làm một số vi trùng gram (+) và gram (-) ngừng phát triển, vi trùng thương hàn, Staphylococus rất nhạy cảm với papain

Papain có tác dụng giảm độc tố với toxin và toxabumin: 18mg papain trong dung dịch trung tính được 10mg rixin là chất độc có trong hạt thầu dầu, 2mg papain trung tính được 4 liều độc của toxin uốn ván

Dung dịch papain cysteine salicilate c ó công dụng chữa bỏng

• Trong các ngành công nghệ khác :

Papain làm mềm da trong công nghệ thuộc da Len đã qua xử lý papain sẽ tăng độ sạch và nhuộm được những màu sống động Trong công nghệ sản xuất dầu cá, nếu cho papain tác dụng trước lên gan thì việc tách dầu sẽ dễ dàng hơn và chất lượng dầu cũng tăng lên

Papain có thể sử dụng kết hợp với một số chất khác để điều chế ra mỹ phẩm chăm sóc

da, giúp làm da mềm mại, tẩy các tế bào chết trên da

Hình III.2: Xà bông có chứa enzyme papain

Một vài chế phẩm papain thương mại [7], [9], [10], [12]:

Hình III.3: nhựa đu đủ, hoạt tính 50000u/g Hình III.4: Chế phẩm papain lỏng,

hoạt tính 80000u/g

Hình III.5: Chế phẩm enzym thô,

hoạt tính 800000u/g

Hình III.6: Chế phẩm papain tinh khiết, Hoạt tính 2000000 – 2300000u/g

Hình III.7: Bột enzym papain, trong đó thành phần chứa 362,5mg papain và không chứa nấm men, bột mì, đậu nành, bắp, đường, chất tạo ngọt tẩng hợp, chất màu, mùi và chất bảo quản