THU NHẬN ENZYME CELLULASE

THU NHẬN ENZYME CELLULASE tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả các lĩnh vực ki...

THU NHẬN ENZYME CELLULASE

Phần 1 : Giới thiệu về enzyme cellulase

1 Định nghĩa

Cellulase là hệ enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm hòa tan Phức hệ enzyme cellulase là enzyme khá phức tạp Một mặt chúng như enzyme cảm ứng (mà ở đây cellulase lại là chất cảm ứng không chặt chẽ), một mặt chúng lại chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu kiểm soát bởi cơ chế dị hóa)

2 Cấu tạo chung của cellulase

Trọng lượng của enzyme cellulase thay đổi từ 30-110 Kdal (Beguin, 1900 và cộng sự 1991) Cấu trúc không gian khoảng 280-600aa nhưng chiều dài cellulase thường khoảng 300-400 aa (Gillees và cộng sự 1992) và trung tâm xúc tác khoảng

250 aa Cellulase là một loại homopolimer của β – D – glucose Các góc glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucan

β-D-Hệ thống enzyme thủy phân cellulose bao gồm ít nhất 3 enzyme khác nhau: endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase, EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4-β-D glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91) và β-glucosidase (β-D-glucosidglucohydrolase, EC.3.2.1.21) Các enzyme này có tính đặc hiệu khác nhau và hoạtđộng hỗ trợ nhau Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết 1,4-β-D-glucoside trongphân tử cellulose, sau đó endoglucanase tiếp tục thủy phân cellulose thành các phân tử cellobiose và sau cùng β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose

3 Phân loại hệ thống các enzyme thuỷ phân cellulose

Hệ thống các enzyme thủy phân cellulose gồm có: endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, Exoglucanase ký hiệu EC 3.2.1.91 và β-glucansidase có kí hiệu EC 3.2.1.21

Tên thường gọi: cellulose 1,4-β-cellobiosidase

Tên hệ thống: 1,4,β-D-glucan cellobiohydrolase

Các tên khác: exo-cellobiohydrolase, exoglucanase; cellulase C1; glucan cellobiohydrolase

exo-β-1,4-Enzyme này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid, giải phóng cellobiose từ đầu không khử

Exoglucanase là một enzyme chứa hai vùng xúc tác với một vùng gắn cellulose qua một vùng liên kết được glycin hóa cao Exoglucanase gồm có 2 chuỗi A và B

Cả hai chuỗi đều có 434 aa nhưng giữa chúng có sự khác nhau để phân biệt

+β-glucosidase-EC 3.2.1.21

Tên thường gọi: β-D-glucosidase

Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase

Một số trường hợp cũng thủy phân:β-D-galactosidase,

β- Đặc tính vật lý và hóa học

Theo nghiên cứu, các cellulase có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần acid amin giống nhau Độ bền và tính đặc hiêu cơ chất có thể khác nhau._ nhiệt độ tối ưu: 40-500C

_pH tối ưu: thường ở giữa 4-5

C1 không phải là một enzyme mà chỉ là một yếu tố của enzyme C1 Có tác dụng làm biến đổi cellulose, nhưng khi tách riêng thì tác dụng này không

 Exo-β-1,4- glucanase: xúc tác tách ra một cách liên tiếp các đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose

 Endo-glucanase: có khả năng phân cắt liên kết

β-1,4-glucoside ở bất cứ nơi nào bên trong chuỗi cellulose phân tử

Để xác định hoạt tính của enzyme Cx người ta thường sử dụng CMC (cacboxymethyl cellulose) hay HEC (hydroxyethyl cellulose) làm cơ chất

 Cellobiose thì tác dụng lên các disacaritxellobiose để tạo ra glucose.Phức hệ cellulase nhiều cấu tử đã được tách ra từ nấm Myrothecium verrucaia Bằng phương pháp điện di, người ta thấy phức hệ enzyme này gồm 6 cấu tử Nhưng chỉ có 3 cấu tử có khả năng thủy phân được cellulose nguyên thủy và cellulose hòa tan Ở nấm Polyporus

versicolor thì phức hệ cellulase có 4 cấu tử trong đó có β-glucosidase Các enzyme này khác nhau bởi cấu trúc phân tử, tính đặc trưng và vận tốc tác dụng trên cellulose

6 Sinh vật tổng hợp cellulase

6.1.giới thiệu chung về nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase

Cellulase có mặt trong các hạt của thực vật bậc cao, lúa mạch, sâu róm, giun đất các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, niêm khuẩn Có thể nói quá trình phân giải cellulose bởi vsv là một trong những chu trình quan trọng nhất của tự nhiên Người đầu tiênnghiên cứu khả năng phân giải cellulose của các vsv kị khí là Popov vào năm

1875, tiếp đó là Omelianxki Các môi trường nghiên cứu phân lập các vsv này trở nên kinh điển Người đầu tiên pháp hiện sự phân giải cellulose bởi vsv hiếu khí là G.Van Interson năm 1903

Trước đó ,hoạt động của vsv phân giải cellulose trong dạ cỏ của động vật nhai lại đã được phát hiện năm 1955 và đến năm 1971 đã phân lập được các vsv này

Về sau người ta phát hiện thêm nhiều vsv phân huỷ cellulose trong đất, nước ,không khí phân bón hữu cơ

Cellulose rất phổ biến trong tự nhiên Hằng năm cellulose do thực vật tổng hợp nên là 1011 tấn Nếu như cellulose được tạo ra từ cây xanh thì sự phân hủy

cellulose lại do vi sinh vật Do đó, quá trình phân hủy cellulose bằng các enzyme

từ vi sinh vật có ý nghĩa lớn về lý thuyết cũng như về thực tế Nhờ vậy mà hằng năm bầu khí quyển trái đất được bổ sung đầy đủ lượng CO2 cần thiết.

Enzyme Cellulase thường được tổng hợp mạnh mẽ từ các nhóm nấm mốc như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma… nhiều vi khuẩn và xạ khuẩn cũng có khả năng tổng hợp cellulase cao

6.2 xạ khuẩn

-Nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn Streptomyces, Actinomyces… các ông đã nhấn mạnh rằng trong cùng một loài hoạttính phân giải cellulose của các chủng khác nhau thì khác nhau

- Loại 1: Act Coelicolor, Act.sulfureus, Act, aureus, Act Ellulosae, Act

Chromogenes, Act Verne, Act Glaucus…

- Loại 2: Act Hydroscoopicus, Act Griseoflavus, Act Albidus, Act Viridans,…

- Loại 3:Act Thermoficus, Act Xanthosromus

- Loại 4: Act, flavochromogenes, Act Bovis, Act Sampsonii

Vi khuẩn hiếu khí: cellulomonas persica sp Nov và cellulomonas iranesis sp Nov

Vi khuẩn kỵ khí: clostridium thermcellum, clostridium cellulovorans, clostridium cellulotiticus

6.4 nấm sợi

Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulose thuộc giống

Alternaria Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Cladospochung Chúng được tác

từ đất xung quanh các vùng rễ cây, từ mẫu thực vật, từ than bùn và các nguồn tự nhiên khác có quá trình phân giải cellulose Một số chủng nấm mốc đã tổng hợp cellulose có hoạt tính khá cao:

- Asp Flavus, Asp Niger, Asp Oryzae…

- Chaetomium globosum, chae Elatum…

- Mucor pusillus

- Penicillium notatum, pen Variabite, pen Pusillum

- Trichoderma koningi, Trichoderma vidide…

Trong đó nấm sợi Trichoderma đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu sản xuất cellulose (Bothast &Saha 1997), nấm này sinh tổng hợp một lượng tương đối lớn endoglucanase và exoglucanase, nhưng chỉ một lượng ít Β- glucosidase.

Quá trình sinh tổng hợp Β- glucosidase thường xảy ra chậm hơn quá trình sinh tổng hợp C1 và C2 là do bản chất của Β- glucosidase là một enzyme tham gia quá trình chuyển hoá cellulose biến tính chứ không có khả năng chuyển hoá cellulose kết tinh Như vậy Cellulose biến tính có thể coi là chất cảm ứng của Β- glucosidase, mà cellulose biến tính được hình thành trên cơ sở dưới tác dụng của enzyme C1

7 Khái quát chung về nấm mốc Trichoderma Harzinaum

7.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá và sinh thái

- Khuẩn lại Trichoderma Harzianum trên môi trường PGA có dạng bông, khi còn

non có màu trắng, khi già có màu vàng xanh do màu của bào tử, mặt trái của Petri có màu vàng nhạt đến vàng nghệ

- Cuốn sinh bào tử dạng chùm, phân nhánh liên tục Đỉnh bào tử hình cầu có đường

kính 3.6- 4.5 µm, có vách xù xì

- Đặc tính sinh lý: sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu 00C, tối ưu 20- 300C, tối đa 34-

380C

- Độc tố: không sinh độc tố, có khả năng sinh enzyme chống lại 1 số

Loại nấm gây bệnh cho cây , các enzyme thu nhận từ nó không gây đột biến vi

khuẩn và mô chuột

- Sinh thái: chiếm ưu thế ở vùng khí hậu nhiệt đới

Hệ thống phân loại nhóm nấm Deuteromycetes( nhóm nấm sợi sinh sản vô tính)

là dựa vào hình thái đại thể và vi thể do đó, các loài được phân biệt về hình thái với các loài khác cùng giống

Phần 2 : Sản xuất và ứng dụng

1 Sản xuất

Enzyme thương mại thường được thu nhận từ T.ressei, Asp.niger và gần đây là các chủng vi khuẩn Cellulase thương mại được thu nhận từ T.viridae bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt theo quá trình Koji ( từ cám mì, xử lý nhiệt, cấy bào

tử, nuôi ủ, sau 3-5 ngày thu enzyme tủa với cồn)

Hiện nay việc sản xuất chế phẩm cellulase đã được tiến hành ở quy mô công nghiệp và được ứng dụng rộng rãi, có nhiều loại chế phẩm đã xuất hiện trên thị trường như: cellulase và novozyme 234 [NO], Econase C15 [AO], Rohament CT[RM] , Avizyme [FR], Sumizyme C [SN], Meicelase MC[MJ] , Cellulase TAP [AM] Cytolase [GR].

2 Ứng dụng

 Tăng chất lượng các sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc

Chúng ta đều biết cellulose là thành phần quan trọng của vỏ tế bào thực vật Các nguyên liệu thực phẩm có nguồn gốc thực vật nếu được gia công bằng chế phẩm cellulade sẽ được mềm ra, tăng hệ số đồng hóa, chất lượngđược tăng lên Do đó sẽ rất bổ ích cho trẻ em,cho người ăn kiêng cũng nhưchế biến thức ăn cho gia súc Việc nghiên cứu và sử dụng trực tiếp enzymecellulase trong quá trình chế biến thực phẩm cũng như trong việc chế biến thức ăn cho gia súc để cải thiện độ tiêu hóa đang được chú ý rất nhiều Ở Việt Nam cũng có những ứng dụng cellulase trong việc thủy phân vỏ dứa,

vỏ chuối… để làm thức ăn gia súc

 Thủy phân gỗ và các phế liệu của gỗ Ví dụ như enzyme cellulase của T,viridae thủy phân 100g gỗ thành 25g đường Trong quá trình ủ cỏ xanh, sự phối hợp của enzyme và các enzyme thủy phân khác như pectinase, hemicellulase… có tác dụng phân giải thành tế bào thực vật,

do đó tăng nguồn dinh dưỡng cho nhóm VSV Lactobacillus lên men acid lactic, ức chế sự sinh trưởng của các VSV có hại khác

 Sử dụng làm chất phá vỡ thành tế bào: cellulase phá vỡ thành tế bào thực vật giúp cho việc trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc được

dễ dàng Điều này còn giúp cho việc nghiên cứu nuôi cấy tế bào trần nhằm tạo ra tế bào lai có những tính trạng như mong muốn Cellulase được sử dụng để sản xuất tinh bột Cellulase của chủng T.viridae và của một số chủng nấm còn được dùng để tách tinh bột ra khỏi khoai lang và đậu tương Sau khi tách rời các tế bào khoai lang và đậu tương

ra nhờ enzyme tách tế bào người ta cho tiếp xúc với cellulase để phá thành tế bào và do đó giải phóng tinh bột một cách dễ dàng hơn Cellulase còn có tác dụng làm mềm vải nên được bổ sung vào thành phần chất giặt tẩy trong công nghiệp bột giặc Ngoài ra cellulase còn cung cấp cho các cơ chất của quá trình lên men, tạo ra hàng loạt các sản phẩm như mong muốn như ethanol, glicerin, protein đơn bào

 Trên nguyên tắc, bất cứ chất vật liệu sinh học nào chứa nhiều Carbon, hoặc dưới dạng đường, tinh bột, cellulose đều có thể chế biến thành ethanol, hoặc chứa nhiều acit béo thì chế biến diesel-sinh-học được Thông thường nhất là từ thực vật có khả năng quang-tổng-hợp – biến CO2 của khí quyển thành chất đường, tinh bột, cellulose, rồi protides,

lipids, v.v Trung bình cứ mỗi phân tử CO2 cây hấp thụ và biến chế qua quang-tổng-hợp thành sinh-khối chứa 114 kilocalories

Phần 3 : Nuôi cấy vsv tổng hợp Cellulase

Sinh tổng hợp enzyme cảm ứngMột quá trình sinh tổng hợp enzyme được gọi là cảm ứng nếu nó chỉ xảy ra với mức độ đáng kể trong khi môi trường có cơ chất đặc hiệu của enzyme này hoặc một số chất có cấu trúc tương tự cơ chất Các chất này được gọi là chất cảm ứng

Cellulose là một loại enzyme thuộc hệ enzyme cảm ứng, cellulase được sinh ra trong môi trường có Cellulose hay dẫn xuất Cellulose

và Lactose, còn trên môi trường chứa Glucose hay Fructose hoặc Glycerol thì Cellulase không sinh ra Một trong số các phân tử kíchthích sợi tổng hợp Cellulase có hiệu quả nhất là Sophorose, chất này có nguồn gốc từ phân tử Celloligosaccharide

Ảnh hưởng của yếu tố dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme Cellulase của vsv

- Nguồn cacbon

Để sinh tổng hợp cellulase trong môi trường nhất thiết phải có cellulose Cellulose trong môi trường có thể là giấy lọc,bong, bột cellulose, lõi ngô, mùn cưa, rơm… ngoài ra chất cảm ứng có thể là Cellobiozootaacetat, cám mì, lactose

Những loài vsv khác nhau thì có chất cảm ứng khác nhau vì từ chấtcảm ứng đó vsv sẽ tạo nên lượng enzyme có hoạt tính mạnh nhất.Các nguồn cacbon khác như Glucose, Cellobiose, Acetat,

Citrat,Oxalat, Succinat và những sản phẩm trung gian của chu trìnhKrep, nếu trong môi trường có nồng độ rất thấp thì có tác dụng kích thích vsv phát triển và tạo enzyme,nhưng nếu nồng độ cao sẽ

ức chế sinh tổng hợp Cellulase Glycerin chỉ có tác dụng kích thíchvsv sinh trưởng và phát triển không cảm ứng tổng hợp Cellulase

- Nguồn Nitơ

Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất rõ rệt đến việc tạo thành Cellulase ở nấm Theo Sin và Sinden (1951) khi sử dụng hết 1g nitơ nhiều vsv phân giải Cellulase sẽ phân giải được khoảng 24-25g Cellulose

Nitrat là nguồn vô cơ tốt nhất đối với vsv Các muối amon làm acid hóa môi trường nên ít có tác dụng nâng cao hoạt lực Cellulase

mà thậm chí ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme và có khả năng làm mất hoạt tính của enzyme tạo thành

Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa,tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase

- Các nguyên tố khoáng

Fe, Mn, B, Mo, Cu có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tổng hợp cellulase cuả vsv, trong đó Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo enzyme này ở nhiều chủng Nồng độ tối ưu của Znlà 1,11- 2,2 mg/l, Mn 3,4-27,2 mg/l

- Nhiệt độ nuôi cấy

Vsv sử dụng oxy để hô hấp và làm tác nhân oxy hoá trong quá trình biến đổi hoá sinh, đồng thời CO2 thải ra xung quanh và toả nhiệt Khi nhiệt độ tăng tốc độ các phản ứng cũng tăng theo nhưng nhiệt độ tăng quá tốc độ phản ứng sẽ giảm

Các loài khác nhau có các nhiệt độ hoạt động khác nhau như Aspergilluse Niger, Trichodecma Konigi phát triển thích hợp ở 25-

30oc, đôí với loài xạ khuẩn ưa nhiệt như Thermonospora Curvata phát triển ở 50- 60oc và tích luỹ nhiều enzyme phân giải cellulose trên môi trường nuôi cấy chứa Cellulose vi tinh thể và cao nấm men

- Ph ban đầu trong môi trường:không giống nhau ở mỗi loài vsv

Phần 4: Phương pháp lên men bán rắn thu nhận enzyme cellulose từ nấm mốc Trichoderma

Harzianum

Trong phương pháp lên men bán rắn, vsv mọc trên mặt môi trường rắn( môi trường rắn trước khi nuôi cấy vsv phải được làm ẩm trước) Các phụ phế phẩm nông nghiệp được xem là tốt nhất cho quá trình lên men bán rắn, do đó phương pháp lên men bán rắn được

sử dụng rộng rãi Một số cơ chất được sử dụng từ: bã mía, bã mì, cám gạo, bột bắp , rơm, trấu, mạt cưa, cùi bắp… tuy nhiên, cám mì là cơ chất được sử dụng rộng rãi nhất Vsv khiphát triển sẽ lấy chất dinh dưỡng từ môi trường và sử dụng oxy của không khí để hô hấp

Để đảm bảo cho vsv mọc đều trên bề mặt môi trường và sử dụng được nhiều chất dinh dưỡng lớp môi trường rắn cần phải mỏng, chiều dày chỉ khoảng 2-5cm

Phương pháp lên men bán rắn có nhiều ưu điểm hơn lên men chìm: môi trường lên men tương đối rẻ tiền, nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với nuôi cấy chìm, canh trường lên men dễ dàng sấy khô và ít bị tổn hao hoạt tính enzyme, không cần thiết

bị phức tạp, chủ yếu nuôi cấy trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ ẩm thích hợp, quá trình sản xuất ít tiêu hao năng lượng

Một số ứng dụng của enzyme cellulose là thủy phân cellulose để cung cấp cơ chất cho các quá trình lên men, tạo ra hàng loạt các sản phẩm như mong muốn như ethanol, glycerin, protein đơn bào… Việc sử dụng cellulose của Trichoderma harzianum để chuyển hoá phế liệu chứa cellulose từ ethanol cũng đang được nghiên cứu, áp dụng(vì người ta thấy trộn xăng với ethanol là biện pháp hữu hiệu để giảm bớt chi phí về xăng cho các loại xe hơi, xe máy và bớt bụi khói

1 Sơ đồ quy trình thu nhận:

Hấp khử trùng 115độ C trong 20’

Nghiền

Nước Trích ly

Chế phẩm enzim thô

Tủa

Tinh sạch Enzim

bán tinh khiết

Nhân giống

Lọc

Li tâmTrích ly

Thu tủa