THU NHẬN ENZYME CELLULASE

THU NHẬN ENZYME CELLULASE tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả các lĩnh vực ki...

THU NHẬN ENZYME CELLULASE Phần 1 : Giới thiệu về enzyme cellulase 1 . Định nghĩa Cellulase là hệ enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm hòa tan. Phức hệ enzyme cellulase là enzyme khá phức tạp. Một mặt chúng như enzyme cảm ứng (mà ở đây cellulase lại là chất cảm ứng không chặt chẽ), một mặt chúng lại chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu kiểm soát bởi cơ chế dị hóa). 2. Cấu tạo chung của cellulase Trọng lượng của enzyme cellulase thay đổi từ 30-110 Kdal (Beguin, 1900 và cộng sự 1991). Cấu trúc không gian khoảng 280-600aa nhưng chiều dài cellulase thường khoảng 300-400 aa (Gillees và cộng sự 1992) và trung tâm xúc tác khoảng 250 aa. Cellulase là một loại homopolimer của β – D – glucose. Các góc β-D- glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucan. Hệ thống enzyme thủy phân cellulose bao gồm ít nhất 3 enzyme khác nhau: endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase, EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4-β-D glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91) và β-glucosidase (β-D-glucosid glucohydrolase, EC.3.2.1.21). Các enzyme này có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ nhau. Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết 1,4-β-D-glucoside trong phân tử cellulose, sau đó endoglucanase tiếp tục thủy phân cellulose thành các phân tử cellobiose và sau cùng β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose. 3. Phân loại hệ thống các enzyme thuỷ phân cellulose Hệ thống các enzyme thủy phân cellulose gồm có: endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, Exoglucanase ký hiệu EC 3.2.1.91 và β-glucansidase có kí hiệu EC 3.2.1.21. +Endoglucanase EC 3.2.1.4 Tên thường gọi: cellulase Tên hệ thống: 1,4-(1,3:1,4)-β-D-glucan-4-glucannohydrolase. Đôi khi người ta cũng có thể gọi enzyme này bằng tên khác: endo-1,4-β-D- glucanase; β-1,4-glucanase; cellulase A, Enzyme này thường thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và các β-D-glucan của các loại ngũ cốc. +Exoglucanase- EC 3.2.1.91 Tên thường gọi: cellulose 1,4-β-cellobiosidase. Tên hệ thống: 1,4,β-D-glucan cellobiohydrolase Các tên khác: exo-cellobiohydrolase, exoglucanase; cellulase C1; exo-β-1,4- glucan cellobiohydrolase Enzyme này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid, giải phóng cellobiose từ đầu không khử. Exoglucanase là một enzyme chứa hai vùng xúc tác với một vùng gắn cellulose qua một vùng liên kết được glycin hóa cao. Exoglucanase gồm có 2 chuỗi A và B. Cả hai chuỗi đều có 434 aa nhưng giữa chúng có sự khác nhau để phân biệt. +β-glucosidase-EC 3.2.1.21 Tên thường gọi: β-D-glucosidase. Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase. Một số trường hợp cũng thủy phân:β-D-galactosidase, β-D-fucoside;β-D- xyloside; α-L-arabinoside. 4. Tính chất  Tính đặc hiệu Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và các β- D-glucan của ngũ cốc. Người ta cho rằng đầu tiên exogluxanase tác động lên các đầu chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu là cellobiose, β- glucosidase thủy phân các gốc β-D-glucose cuối cùng từ các đầu phân tử cellulose.  Đặc tính vật lý và hóa học Theo nghiên cứu, các cellulase có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần acid amin giống nhau. Độ bền và tính đặc hiêu cơ chất có thể khác nhau. _ nhiệt độ tối ưu: 40-50 0 C. _pH tối ưu: thường ở giữa 4-5.  Chất ức chế: Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm của nó như glucose, cellobiose. Thủy ngân ức chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác như Mn 2+ , Ag + , Zn 2+ chỉ ức chế nhẹ. Cơ chế tác động Quá trình thủy phân cellulase tự nhiên được thực hiện dưới sự tác động của 1 phức hệ cellulase, bao gồm chủ yếu các enzyme C 1 , C x và β- glucosidase. Enzyme C 1 là một enzyme không đặc hiệu. Dưới tác dụng của enzyme này các cellulose tự nhiên (bông, giấy lọc…)bị trương lên và chuẩn bị cho tác dụng của enzyme tiếp theo. Hiện nay có nhiều tác giả cho rằng enzyme C 1 không phải là một enzyme mà chỉ là một yếu tố của enzyme C 1 . Có tác dụng làm biến đổi cellulose, nhưng khi tách riêng thì tác dụng này không có tác dụng nữa. Để xác định hoạt tính của enzyme C 1 người ta thường sử dụng các loai cellulose tự nhiên nhất là sợi bông thấm nước. Enzyme C x còn gọi là enzyme β-1,4-glucanase. Enzyme này thủy phân cellulose thành cellobiose. Chữ X cho ta biết enzyme này có nhiều thành phần khác nhau. Người ta thường chia C x thành 2 loại:  Exo-β-1,4- glucanase: xúc tác tách ra một cách liên tiếp các đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose  Endo-β-1,4-glucanase: có khả năng phân cắt liên kết β-1,4- glucoside ở bất cứ nơi nào bên trong chuỗi cellulose phân tử. Để xác định hoạt tính của enzyme C x người ta thường sử dụng CMC (cacboxymethyl cellulose) hay HEC (hydroxyethyl cellulose) làm cơ chất.  Cellobiose thì tác dụng lên các disacaritxellobiose để tạo ra glucose. Phức hệ cellulase nhiều cấu tử đã được tách ra từ nấm Myrothecium verrucaia. Bằng phương pháp điện di, người ta thấy phức hệ enzyme này gồm 6 cấu tử. Nhưng chỉ có 3 cấu tử có khả năng thủy phân được cellulose nguyên thủy và cellulose hòa tan. Ở nấm Polyporus versicolor thì phức hệ cellulase có 4 cấu tử trong đó có β-glucosidase. Các enzyme này khác nhau bởi cấu trúc phân tử, tính đặc trưng và vận tốc tác dụng trên cellulose [...]... Giống Ủ Thu canh trường Nhân giống Nghiền Nước Trích ly Lọc 1 Sơ đồ quy trình thu nhận: Hấp khử trùng 115độ C trong 20’ Trích ly Chế phẩm enzim thô Tủa Li tâm Khuấy trong 30’ Thu tủa Tinh sạch Enzim bán tinh khiết B ã Đồng hoá Cồn :dịch:4:1 5000v/ph Aceton 70% MuốI 70% Hoà vào đệm Na acetat Sắc kí lọc gel 2 Quy trình thu nhận 2.1.Nguyên vật liệu: Nguyên liệu: Chế phẩm enzyme cellulose thô thu được... nghiệp để thu nhận enzyme So sánh độ tinh sạch của chế phẩm enzyme với 3 tác nhân tủa khác nhau trong 1g chế phẩm khi tiến hành chạy sắc kí Hoạt tính Hàm lượng Hoạt tính Hiệu suất Độ tinh cmcase (UI/g) protein (mg/g) riêng(UI/mg) thu nhận( %) sạch Dịch 63,67 17.33 3.67 100 1 enzyme thô Cồn 143.36 8.83 16.92 60.13 4.61 Acetone 176.67 8.15 19.31 56.88 5.26 Muối 187.56 9.5 19.74 63.62 5.37 nhận xét:... nghệ enzim của Nguyễn Đức Lượng -Luận văn tốt nghiệp :nghiên cứu các chủng vsv sinh enzim cellulase, ứng dụng thủy phân bã mía của Nguyễn Xuân Quang -Luận văn tốt nghiệp : nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng enzim cellulase ,thu nhận cellulase từ nấm mốc Trichoderma harzianum -Web :Sinhhocvietnam.com; -Thu nhận cellulase từ Trichoderma Reesie của viện sinh học nhiệt đớI:vnulib.edu.vn ... có thể ảnh hưởng đến lực hút tĩnh điện làm giảm khả năng kết tủa, còn nồng độ quá thấp sẽ không tủa hết được enzyme Tủa bằng Acetone ở nồng độ 70% ta thu được hàm lượng protein và hoạt tính cao nhất 2.6.Tinh sạch enzyme cellulose bằng sắc kí lọc gel( sắc kí rây phân tử) Enzim được tinh sạch thu nhận những giá trị sau: -Giảm được khối lượng vận chuyển, trị số này có ý nghĩa trong việc đóng bao bì ,vận... ngược lên Thu và xác định mẫu tách được Dịch ra khỏi cột được đo ở bước song 280nm bằng detector trong hệ sắc kó và được thể hiện độ hấp thụ dưới dạng sắc kí đồ Dịch thu tự động bằng máy thu mẫu Dựa vào sắc kí đồ , tiến hành thu các phân đoạn cuối cùng của một peak, các peak sẽ được phân tích hàm lượng protein Hoạt tính sau khi đã làm sạch bằng sắc kí và xác định trọng lượng phân tử bằng kĩ thu t điện... từ 20-80% Thu cặn tủa và hoà lại bằng dung dịch đệm Na acetate 50mm,pH 5 Tiếp tục pha loãng với dung dịch đệm Na- acetate 50mm,pH 5 đến độ pha loãng thích hợp chú ý : pH tối ưu là 5 Enzyme rất nhạy cảm với pH môi trường, pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền enzyme Tủa bằng muối(NH4)2SO4 bão hoà ở nồng độ muối 70% được hàm lượng và hoạt tính enzyme cao... polyacrylamide Phần 5 :Một số kết qủa sau thu nhận và bảo quản enzim Nếu tiến hành tủa 50ml dịch thô từ 1000ml dịch chiết thô ta thu được kết quả như sau: Hoạt tính cmcase (UI/g CP) Hàm lượng Protein(mg/g CP) Hoạt tính Riêng(UI/mg ) 8.3 Tủa bằng cồn(tỉ lệ cồn:dịch e 89.8 10,82 là 4:1 Tủa bằng aceton 70% bão hoà 100.5 10.95 9,18 Tủa bằng muối 70% bão hoà 119.33 12.22 9.77 Nhận xét - Về hoạt tính cmcase: tủa... ẩm 100% 2.3 .Thu chế phẩm enzim thô Sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng , môi trường nuôi cấy sẽ mọc đầy tơ trắng Ta thu cả cơ chất và tơ trắng rồi tiến hành tách enzim với cơ chất Có nhiều pp tách như dùng nước ,đệm acetat và muối sinh lí nhưng tách bằng nước sẽ giữ được hoạt tính cao nhất Sau khi cho nước vào thì khuấy đều bằng máy khuấy trong 30’ sau đó lọc để tách cơ chất Phần bã thu được ta... khung gel hoặc chui qua lỗ của các rây phân tử Nghĩa là dựa trên sự phân bố các chất tan giữa dung môi tự do và dung môi nằm trong các gốc pha tĩnh Mức độ thâm nhập của các phân tử chất tan chủ yếu phụ thu c vào kích thước lỗ và cấu trúc của chúng Các đại phân tử có kích thước lớn hơn lỗ không thể chui qua lỗ, chúng chỉ có thể khuếch tán vào khe hở giữa các hạt rắn xốp và do đó bị rửa ra khỏi cột sớm... dùng cột 30 x1,5 và Gel Saphadex G- 25 : loại bỏ phân tử có MW thấp ra khỏi hỗn hợp chứa các đại phân tử (vd quá trình loại muối ra khỏi dung dịch chứa protein và acid nucleic) + Sắc kí dùng để tinh sạch enzyme dùng cột 50x1,5 và Biogel P-100(cần 12h ở 200C để hydrat hoá hoặc 4h nếu bắt đầu ở 1000C Sau khi huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định trong suốt quá . THU NHẬN ENZYME CELLULASE Phần 1 : Giới thiệu về enzyme cellulase 1 . Định nghĩa Cellulase là hệ enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm hòa tan. Phức hệ enzyme. của 1 phức hệ cellulase, bao gồm chủ yếu các enzyme C 1 , C x và β- glucosidase. Enzyme C 1 là một enzyme không đặc hiệu. Dưới tác dụng của enzyme này các cellulose tự nhiên (bông, giấy. trương lên và chuẩn bị cho tác dụng của enzyme tiếp theo. Hiện nay có nhiều tác giả cho rằng enzyme C 1 không phải là một enzyme mà chỉ là một yếu tố của enzyme C 1 . Có tác dụng làm biến đổi