Thu nhận enzyme CELLULASE trong Aspergillus niger và ứng dụng trong sản xuất BIOETHANOL
Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương MỤC LỤC MỤC LỤC________________________________________________________1 Chương 1: GIỚI THIỆU_____________________________________________3 Chương 2: TỔNG QUAN____________________________________________4 2.1 Enzyme cellulase____________________________________________4 2.2 Aspergillus Niger ___________________________________________4 2.3 Giới thiệu cơ chất___________________________________________5 2.4 Cơ chế xúc tác______________________________________________6 2.5 Tâm hoạt động______________________________________________8 2.6 Các thông số cần xác định_____________________________________9 Chương 3: QUY TRÌNH LÊN MEN, THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME CELLULASE____________________________________________________10 3.1 Sơ lược quy trình lên men____________________________________10 3.1.1 Môi trường nuôi cấy___________________________________11 3.1.2 Giống______________________________________________12 3.1.3 Lên men____________________________________________12 3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme cellulase____12 3.2 Quy trình thu nhận và tinh sạch________________________________13 3.2.1 Thu nhận enzyme cellulase_____________________________13 3.2.2 Tinh sạch enzyme cellulase_____________________________14 3.3 Phương pháp xác định hoạt tính_______________________________15 Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 1 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Chương 4: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE TRONG SẢN XUẤT NHIÊN LIỆU SINH HỌC ETHANOL________________________________________17 4.1 Giới thiệu về nhiên liệu sinh học ethanol________________________17 4.2 Sơ đồ sản xuất ethanol và thuyết minh quy trình sản xuất___________20 4.2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất________________________________20 4.2.2 Thuyết minh quy trình_________________________________21 4.2.2.1 Tiền xử lý_____________________________________21 4.2.2.2 Thuỷ phân_____________________________________22 4.2.2.3 Lên men______________________________________23 4.2.2.4 Chưng cất- khử nước____________________________24 4.3 Các thông số kỹ thuật của hệ enzyme cellulase___________________24 4.4 Phương pháp xác định đường glucose sinh ra_____________________25 Chương 5: KẾT LUẬN_____________________________________________26 PHỤ LỤC_______________________________________________________27 1. Phương pháp xác định hàm lượng enzyme cellulase bằng phương pháp Bradford________________________________________________________27 2. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS____________________________________________________________28 3. Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng phương pháp sắc kí lọc gel_____________________________________________________________30 TÀI LIỆU THAM KHẢO___________________________________________32 Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 2 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Chương 1: GIỚI THIỆU Enzyme cellulase là một trong những enzyme thương mại hóa lớn nhất hiện nay được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp dệt như làm mềm sợi bông, tẩy hay giữ màu, chống kết tủa…; dùng để tách chiết trong thực phẩm hay công nghiệp giấy và bột giấy. Thị trường cellulase dùng để tiền xử lý nguyên liệu cellulose sản xuất hàng hóa như bioethanol và các sản phẩm sinh học cơ bản khác trên quy mô lớn đã tăng đột ngột. Ví dụ như thị trường cellulase tiềm năng được ước đoán trên 400 triệu USD mỗi năm, chỉ riêng sử dụng thủy phân bắp và rơm khô và trong tương lai sẽ chiếm khoảng 33% tổng giá trị công nghiệp enzyme của Mỹ. Sự tiềm năng của thị trường enzyme cellulase có vai trò quan trọng của nổi bật trong công nghiệp năng lượng sinh học và các sản phẩm cơ bản của sinh học, là một động lực to lớn để phát triển công nghệ cellulase thủy phân vách tế bào thực vật. Để phát triển công nghiệp cellulase đòi hỏi cần phải có những đặc điểm như hiệu suất xúc tác phản ứng cơ chất cellulose cao trong môi trường không hòa tan, tăng sự ổn định của môi trường nhiệt độ cao, khi pH thay đổi, và không bị ức chế nồng độ sản phẩm cao. Ngoài ra hệ enzyme cellulase trong Aspergillus niger cũng được nghiên cứu từ lâu nhằm ứng dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học nhằm phục vụ nhu cầu chế biến thực phẩm, trong nông nghiệp sử dụng dể xử lý đất nhằm tăng độ màu mỡ. Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 3 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 Enzyme cellulase Cellulase là enzyme thuộc nhóm thủy phân cellulose thành glucose. Enzyme cellulase được thu nhận từ các nguồn khác nhau: •Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch đen… • Động vật: chủ yếu là do các vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột của động vật nhai lại hay mối •Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men… Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật. Các chủng vi sinh vật thường sử dụng: •Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus, Trichodesma reesei … •Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli… •Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis… Trong đó nấm mốc và vi khuẩn là 2 nguồn tạo cellulase chủ yếu, ở mức độ ít hơn là mầm malt và hạt cây. Trong kỹ thuật, cellulase được sản xuất chủ yếu từ nấm Trichodesma reesei, Aspergillus niger và vi khuẩn Cellulomonas. 2.2 Aspergillus Niger Aspergillus niger thuộc giới Eukaryota, lớp Eurotiomycetes, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, là một dạng nấm phổ biến nhất trong chi nấm mốc Aspergillus. Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương. Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn. Các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng. Bào tử bụi của Aspergillus niger có màu đen. Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 4 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Asp. niger là nguyên nhân gây bệnh mốc đen ở một số loài thực vật nhưng lại ít có khả năng gây bệnh cho người, nó chỉ có thể gây hại cho người khi hít vào với một lượng lớn, từ đó có thể gây ra các bệnh về phổi và hô hấp, nó cũng có thể gây nhiễm trùng tai. Nó được nuôi cấy trong nhiều ngành công nghiệp như sản xuất acid citric, acid gluconic, hoặc thu các chế phẩm enzyme amylase, cellulase, α-galactosidase. 2.3 Giới thiệu cơ chất Enzyme cellulase có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất. Người ta phân ra làm 2 loại chủ yếu sau: • Cơ chất tự nhiên: gồm các nguồn phụ phẩm của các ngành nông nghiệp như bã mía, bã cà phê, rơm rạ, sợi bông, cọng khoai mì, dây đậu sau thu hoạch…Chẳng hạn như cellulose là homopolymer mạch thẳng, được cấu tạo khoảng vài ngàn gốc glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,4- glucoside. Cellulose có cấu tạo sợi, cấu trúc không đồng nhất gồm vùng kết tinh và vùng vô định hình. Khoảng 40 sợi liên kết lại với nhau tạo thành liên kết microfibrin. Nhiều sợi microfibrin tập hợp lại thành sợi macrofibrin có đường kính mặt cắt khoảng 0,5nm. Cơ chất nhân tạo: gồm các cơ chất dùng để phân tích hoạt tính enzyme cellulase như CMC (carboxulmethyl cellulose), HEC (hydroxyethyl cellulose… CMC (Carboxymethylcellulose) là một dẫn xuất của cellulose. Cấu trúc của CMC dựa trên liên kết β-(1 4)-D- glucopyranose, có thành phần tương tự nhưng chỉ có liên kết của phần vô định và ngắn hơn so với cellulose. Bảng: Các loại cơ chất tan và không tan dùng đêt nuôi cấy và cố định hoạt tính enzyme. Cơ chất tan Cơ chất không tan Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 5 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Radio-labeled cellodextrin Dẫn xuất cellodextrin β-methyllumbelliferul- oligosaccharides p-nitophenol-oligosaccharides Cacboxymethyl cellulose (CMC), hydroxyethyl cellulose (HEC) Cellulose kết tinh như: Cellulose kết tinh Valonia cellulose Cellulose vô định hình-PASC, RAC Cellulose nhuộm Cellulose phát huỳnh quang Dẫn xuất sinh màu Trinotrophenyl- carboxymethylcellulose (TNP-CMC) Fluram-cellulose 2.4 Cơ chế xúc tác Enzyme cellulase là một phức hệ gồm nhiều enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa cellulose. Enzyme endogluconase (endo-1,4- β-D-glucanase (EC 3.2.1.4)) hay Cx: tên khác là CMCase- gọi tên theo cơ chất nhân tạo sử dụng để xác định hoạt tính của enzyme. EG bắt đầu thủy phân cellulose trên các vị trí vô định hình trên bề mặt sợi microfibrin ở các vị trí ngẫu nhiên làm xuất hiện các đuôi khác nhau trên phần chất vô định hình, từ cellulose tạo thành các cellobiose, tiền đề cho xúc tác của cellobiosehydrolase trên các đầu mút của chuỗi tự do. Điều này cho biết ảnh hưởng của enzyme trên phần carboxymethylcellulose và cellulose kết tinh. Enyme endoglucanase của nấm thường là một monomer, có pH hoạt động trong khoảng pH=4-5 và nhiệt độ t= 50 -70 o C. Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 6 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Enzyme exoglucanase (cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)) hay C1 : sẽ cắt và giải phóng các cellobiose từ đầu không khử (đầu mút của chuỗi) tạo thành trong bước đầu tiên. Exocellulase chiếm khoảng 40-70% thành phần hệ enzyme cellulase của nấm, xúc tác bằng cách tạo ra các cầu liên kết giữa cơ chất với enzyme. Với Exocellulase pH hoạt động từ 4-5, nhưng khoảng nhiệt độ rộng hơn so với endocellulase khoảng 37-60 o C. Enzyme β-glucanase (1,4- β - D -glucosidase(EC 3.2.1.21) ): thủy phân liên kết β-1,4-glucoside, cắt và giải phóng glucose tự do. β –glucosidase thủy phân cellobiose, một số trường hợp cellodextrin thành glucose. Enzyme β- glucanase cũng bị ức chế cạnh tranh bởi glucose, enzyme này có pH tối ưu dựa vào nơi hoạt động của nó và có nhiệt độ tối ưu khoảng 45-75 o C. Cơ chế xúc tác của enzyme CMCase cơ chất CMC: Do cơ chất CMC chỉ có vật chất vô định hình trong phân tử nên phức hợp 3 enzyme của cellulose chỉ có enzyme endoglucanase hoạt động. Do đó CMC được dùng chủ yếu để xác định hoạt tính endoglucanase (Cx) nên được gọi là CMCase. Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 7 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương • Hình: Sơ đồ các bước thủy phân cellulose bởi enzyme cellulase 2.5 Tâm hoạt động Trung tâm hoạt động của enzyme là phần của phân tử enzyme trực tiếp kết hợp với cơ chất, tham gia trực tiếp trong việc tạo thành và chuyển hóa phức chất trung gian giữa enzyme và cơ chất để tạo thành sản phẩm phản ứng. Trung tâm hoạt động bao gồm nhiều nhóm chức năng khác nhau của amino acid, phân tử nước liên kết và nhiều khi có cả cofactor hữu cơ (coenzyme) và vô cơ. Ở các enzyme một thành phần, trung tâm hoạt động thường bao gồm một tổ hợp các nhóm chức năng của acid amin không tham gia tạo thành trục chính của sợi polypeptide. Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 8 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Giữa cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ dàng bị cắt đứt trong quá tr.nh phản ứng để giải phóng enzyme và sản phẩm phản ứng. Trung tâm hoạt động của các enzyme có cấu trúc bậc 4 có thể nằm trên một phần dưới đơn vị hoặc bao gồm các nhóm chức năng thuộc các phần dưới đơn vị khác nhau. Đối với cellulase, tâm hoạt động là acid amin và không có cofactor cũng như coenzyme. 2.6 Các thông số cần xác định Trong quy trình lên men, thu nhận và tinh sạch enzyme cellulase từ Asp. niger, ta cần chú ý các thông số đặc tính của enzyme như sau: • Khối lượng phân tử [Asp. niger]: 26000 Da •Chất nền: carboxymethylcellulose + H 2 O •Nhiệt độ cất giữ: -15 o C trong khoảng thời gian dài hoặc 4 o C trong 3 ngày. •Khoảng nhiệt độ hoạt động: nhiệt độ quá cao hay quá thấp thường dễ làm biến tính enzyme do enzyme có bản chất là protein do đó enzyme hoạt động trong khoảng 20 o C – 60 o C. •Nhiệt độ tối ưu: 45 o C •Khoảng pH : pH có vai trò quan trọng trong việc tạo môi trường cho hoạt động enzyme, mỗi enzyme có một vùng hoạt động tốt nhất riêng cho mình nên khi pH thay đổi sẽ ảnh hưởng tới độ phân ly các nhóm chức cấu trúc nên trung tâm hoạt động của enzym như OH, SH hoạt động của hệ enzyme trong nấm mốc Aspergillus niger thường có môi trường axit: 3 – 8. •pH tối ưu: 3.8 – 4. Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 9 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương •Nồng độ cơ chất: cơ chất vừa có vai trò là chất cảm ứng vừa có vai trò là chất ức chế sự sinh tổng hợp enzyme khi môi trường dinh dưỡng cạn kiệt. •Chất ức chế : Ag + Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 10 [...]... chi phí trong giai đoạn sản xuất cồn Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicelluloses được thủy phân tạo ra các đường đơn sử dụng enzyme cellulase và hemicellulase Nhiều loài nấm như Tricoderma, Aspergillus, Penicilium… có thể sản xuất ra một lượng lớn cellulase ngoại bào và hemicellulase Những enzyme chịu nhiệt độ cao và pH thấp được ưu tiên sử dụng do quá trình tiền xử lý thường dùng axit và nhiệt... ép), và mỗi tấn bả mía sản xuất 285 lít ethanol Kỹ thu t hiện nay chưa hoàn hảo, hiệu năng còn kém, con men chưa hữu hiệu và giá đắt, chỉ một phần cellulose và lignin biến thành ethanol, nên giá thành sản xuất còn cao • Công nghệ xăng-sinh-học thế hệ 3: từ tảo (algae), kỹ thu t đang phát triển Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 19 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG. .. CBP Sản xuất năng lượng Bioethanol thô Năng lượng điện Chưng cất và cho bay hơi Bioethanol Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 20 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts Nguyễn Hoài Hương SSF: quá trình thủy phân thành các đường đơn giản và lên men được tiến hành trong một thiết bị SHF: quá trình thủy phân thành các đường đơn giản và lên... Pennisetum purpureum, sản xuất 13,700 lít ethanol/ha/năm), lác (Cyperus), cỏ tranh (Imperata cylindrica),… Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 17 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts Nguyễn Hoài Hương • Phó sản thực vật từ sản xuất cây nông phẩm và cây kỹ nghệ: rơm rạ, bả mía, thân, gổ, mạt cưa, trấu, hạt cao su (sản xuất 217 kg dầu/ha/năm),...Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts Nguyễn Hoài Hương Chương 3: QUY TRÌNH LÊN MEN, THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME CELLULASE 3.1 Sơ lược quy trình lên men Quy trình lên men giống nấm mốc Asp niger thu ̣c dạng lên men bề mặt và được thực hiện theo sơ đồ sau: Môi trường nuôi cấy Khử trùng Khoáng và chất... kết hợp với sử dụng hơi nước) và tiền xử lý bằng phương pháp sinh học sử dụng vi sinh vật Trong tiền xử lý bằng phương pháp Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 21 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts Nguyễn Hoài Hương hóa học sử dụng axit, hemicellulose sẽ là đối tượng tương tác chính, ngược lại quá trình tiền xử lý sử dụng kiềm chủ... cân bằng và tử vong Ở giai đoạn thích nghi và phát triển, nấm mốc sẽ tìm cách thích nghi và tiết ra loại enzyme nào và số lượng bao nhiêu để có thể tồn tại và phát triển Theo thời gian thì lượng enzyme tiết ra sẽ tăng dần và đến một mức độ ổn định, sau đó sẽ giảm đi khi môi trường Minh dưỡng cạn kiệt dần 3.2 Quy trình thu nhận và tinh sạch 3.2.1 Thu nhận enzyme cellulase Mẫu: enzyme cellulase. .. Asp Niger Cân 5g chế phẩm ezyme thô pha với nước tỷ lệ 1:5 (5g enzyme với 25 ml nước), dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều trong 20 phút rồi lọc qua bông Đem dịch lọc ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong vòng 10 phút Thu dịch chiết nằm ở phía trên, bỏ phần cặn phía dưới Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 13 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG. .. MT-CNSH 14 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts Nguyễn Hoài Hương Nguyên tắc: Sắc ký lọc gel là kỹ thu t dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel Những phân tử kich thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những... dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5.0 và 40oC Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS), màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 16 Đề tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG . tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Chương 4: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE TRONG SẢN XUẤT. tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Chương 3: QUY TRÌNH LÊN MEN, THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME CELLULASE . tài: THU NHẬN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương Chương 4: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE TRONG SẢN XUẤT