Đề tài: Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase từ aspergillus niger và aspergillus oryza pptx

có hàm lượng chất xơ rất cao, khi vật nuôi ăn tiêu hóa rất chậm và nguồn dinh dưỡng rấtthấp, vật nuôi phát triển chậm, năng suất thấp.Vấn đề đã đặt ra, con người đã tìm hiểu và nghiên cứ

Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase từ aspergillus niger và

aspergillus oryza

Phần I 3

MỞ ĐẦU 3

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 4

1.2 MỤC ĐÍCH- PHẠM VI ỨNG DỤNG 4

1.2.1 Mục đích 4

1.2.2 Phạm vi ứng dụng 5

1.3 Ý nghĩa 5

1.4 Nội dung 5

PHẦN II 6

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

2.1 TỔNG QUAN VỀ NƠI THỰC TẬP 7

2.1.1 Địa điểm 7

2.2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10

2.2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MỐC 10

2.2.5.4 Giới thiệu về enzyme cellulase 25

Phần I

MỞ ĐẦU

có hàm lượng chất xơ rất cao, khi vật nuôi ăn tiêu hóa rất chậm và nguồn dinh dưỡng rấtthấp, vật nuôi phát triển chậm, năng suất thấp.

Vấn đề đã đặt ra, con người đã tìm hiểu và nghiên cứu các loài vi sinh vật có khảnăng sinh các enzyme có khả năng phân giải hàm lượng chất xơ này Dùng các phế phụphẩm làm môi trường lên men, tách chiết enzyme, thu chế phẩm thô và bổ sung vào thức

ăn chăn nuôi giúp vật nuôi tiêu hóa chất sơ tốt hơn để tăng năng suất vật nuôi đồng thờilàm bớt uổng phí các phế phụ phẩm của trồng trọt, tận dụng nó để thu thêm lợi nhuận vềkinh tế trong ngành chăn nuôi

Một trong những loại enzyme có vai trò đóng góp vào cải thiện vật nuôi cho ngành

chăn nuôi Enzyme cellulase được thu nhận từ nguồn nấm mốc Aspergilus Nigier,

Aspergilus Oryzae, là một enzyme được trộn vào thức ăn cho vật nuôi, nhằm kích thích

gia súc, gia cầm hấp thụ thức ăn, tiêu hóa tốt, tăng năng xuất vật nuôi

Chính vì vậy ngày nay có rất nhiều các nghiên cứu tìm ra các enzyme có ích để bổsung vào thức ăn chăn nuôi cho vật nuôi

Nghiên cứu và khảo sát các điều kiện thuận lợi sao cho khả năng sinh enzyme lànhiều nhất Đó là việc rất có giá trị

Khả năng sinh enzyme cellulose của nấm mốc Nigier, Aspergilus Oryzae, ở điều

kiện như thế nào là thích hợp nhất

1.2 MỤC ĐÍCH- PHẠM VI ỨNG DỤNG

1.2.1 Mục đích

Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase và khai thác nguồn enzyme có giá trị cao

từ nguồn nấm mốc tự nhiên, nguồn tài nguyên đa dạng

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng, các điều kiện thích hợp để tạo ra enzyme cellulase

tốt nhất từ 2 loại nấm mốc A.oryzae và A.niger để tìm ra điều kiện tối ưu nhất ứng dụng vào sản xuất cellulase từ 2 loại nấm mốc A.oryzae và A.niger đem bổ sung vào thức ăn

giúp vật nuôi tiêu hóa, hấp thu thức ăn một cách tốt nhất Tạo ra năng xuất cao tăng hiệuquả kinh tế trong chăn nuôi

1.4 Nội dung

Khảo sát khả năng sinh enzyme của 2 loài nấm mốc A.oryzae và A.niger

Khảo sát để tìm ra nồng độ cơ chất (CMC) mà 2 loại nấm mốc trên phát triển và cókhả năng sinh enzyme cellulase tốt nhất

Khảo sát pH ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme cellulase

Lên men thử nghiệm trong phòng thí nghiệm

Thu kết quả và biện luận, tìm ra môi trường thích hợp nhất để lên men với quy môlớn, sản xuất chế phẩm thô để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

1.5 Kết quả dự kiến

Tìm ra những điều kiện cơ chất, pH, môi trường lên men cho 2 loại nấm mốc

Aspergilus Niger, Aspergilus Oryzae sinh enzyme cellulase nhiều nhất.

PHẦN II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp Miền Nam (KHKTNNMN) hiện nay tiền thân

là Viện Khảo cứu Nông Nghiệp Đông Dương thành lập năm 1925

Từ năm 1956 đến 1975 Viện có tên gọi mới là Viện Khảo Cứu Nông Lâm Súc vớinhững hoạt động chính vẫn tập chung vào nghiên cứu các nhóm cây công nghiệp có giátrị

Từ năm 1975 Viện có tên là Viện KHKTNNMN

2.1.3 Cơ cấu tổ chức

P Nghiên cứu Cây Lương Thực

P Tổ Chức – Hành Chánh

Trung tâm nghiên cứu

thực nghiệm Nông

Nghiệp Hưng Lộc

P Khoa Học và Hợp Tác Quốc Tế

P Nghiên cứu Bảo

Vệ Thực Vật

P Tài Vụ

P Nghiên cứu Thổ Nhưỡng – Nông HoáTrung tâm nghiên cứu

thực nghiệm Nông

nghiệp Đồng Tháp

Mười

Trung tâm nghiên cứu

và huấn luyện Chăn

Trung tâm nghiên cứu

và huấn luyện Chăn

Nuôi Bình Thắng

Trung tâm chuyển giao

tiến bộ kỹ thuật Nông

Nghiệp

Trung tâm nghiên cứu

Khoai tây, Rau và Hoa

Trung tâm nghiên cứu

và Phát Triển Mía

Đường

P Nghiên cứu Hệ Thống Nông Nghiệp

P Nghiên cứu Đại Gia Súc

P Phân Tích Tổng Hợp và Công Nghệ

Phòng nghiên cứu Thức An và Dinh Dưỡng Cho Gia Súc

2.1.4 Chức năng – Nhiệm vụ

 Chức năng của Viện KHKTNNMN:

Nghiên cứu giải quyết các vấn đề Khoa học – Kỹ thuật Nông Nghiệp về các loại câytrồng, vật nuôi phục vụ yêu cầu phát triển của các tỉnh phía Nam

 Nhiệm vụ của Viện

Nghiên cứu lai tạo, chọn lọc, nhân giống các loại cây trồng, vật nuôi, phòng trừsâu bệnh hại, các biện pháp kỹ thuật canh tác, hệ thống nông lâm nghiệp, bảo

vệ môi trường sinh thái, chế biến bảo quản các sản phẩm nông nghiệp và thức

ăn gia súc phục vụ cho sự phát triển nông nghiệp vùng

Nghiên cứu kinh tế thị trường, hạ tầng cơ sở nông nghiệp nông thôn của vùng.Tham gia tư vấn đầu tư, dịch vụ chuyển giao tiến bộ khoa học kỹ thuật vào sảnxuất và sản xuất kinh doanh thuộc các lĩnh vực nghiên cứu của Viện theo quytrình hiện hành của nhà nước

Đào tạo cán bộ Khoa học Nông Nghiệp có trình độ trên đại học và bồi dưỡngcán bộ kỹ thuật viên ngành nông nghiệp

Thực hiện hợp tác quốc tế về khoa học – công nghệ thuộc lĩnh vực nôngnghiệp, bảo vệ môi trường sinh thái phục vụ cho sự phát triển nông nghiệp bềnvững của vùng

2.1.5 Thành tựu nghiên cứu

Những kết quả nghiên cứu và chuyển giao vào sản xuất các giống cây trồng, vậtnuôi năng suất cao, chất lượng tốt cùng với các quy trình công nghệ tiên tiến, thích hợpvới từng vùng sinh thái đã góp phần giải quyết những khó khăn về lương thực, ổn địnhđời sống xã hội vào những năm đầu sau giải phóng Trong đó, việc nghiên cứu phòng trừ

rầy nâu hại lúa và chọn tạo ra những giống lúa kháng sâu bệnh đã có ý nghĩa hết sức tolớn.

Những nghiên cứu đã được Hội đồng Khoa học Bộ nông Nghiệp công nhận và chophép phổ biến

- Về trồng trọt: giống lúa cạn, giống Bắp lai, giống Đậu xanh, hạt Điều mới,giống rau, cải ngọt, ớt…

- Về chăn nuôi: giống heo Yorkshire thuần chủng, Thuộc Nhiêu, Heo lai tỷ lệcao, giống gà thả vườn…

- Những giống bò sữa ở Tp Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam

- Những công thức phối hợp khẩu phần ăn cho chăn nuôi công nghiệp

Với những cống hiến liên tục trong 30 năm qua của Viện (1975 – 2005), Đảng vàNhà Nước đã trao tặng Viện KHKTNNMN Huân Chương Độc Lập Hạng II

Năm 2005 Viện được trao tặng 2 giải thưởng Khoa Học cấp nhà nước là chọn tạogiống lúa ĐB VND95-20

2.2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MỐC

2.2.1.1 Lịch sử

Nấm mốc (fungus, mushroom) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản (thalophyte), tế bàokhông có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạochủ yếu là chitin, có hay không có celuloz và một số thành phần khác có hàm lượng thấp.Nấm học (Mycology) được khai sinh bỡi nhà thực vật học người Ý tên là Pier AntonioMicheli (1729) qua tài liệu công bố “giống cây lạ” (Nova Plantarum Genera) nhưng theoGiáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại làElias Fries (1794 - 1874) Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm mốc có khoảng 5.100 giống

và 50.000 loài được mô tả, tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiệndiện trên trái đất Nhiều loài nấm mốc có khả năng ký sinh trên nhiều ký chủ như độngvật, thực vật, đặc biệt trên con người, cây trồng, vật nuôi, sản phẩm sau thu hoạch chưa

hoặc đã qua chế biến, bảo quản Một số là tác nhân gây bệnh, làm hư các thiết bị thủy tinhbảo quản không tốt nhưng cũng có nhiều loài có ích như tổng hợp ra acit hữu cơ, thuốckháng sinh, vitamin, kích thích tố tăng trưởng thực vật đã được đưa vào sản xuất côngnghiệp và có một số nấm được dùng làm đối tượng nghiên cứu về di truyền học.

2.2.1.2 Hình thái, cấu tạo sợi mốc

Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất nguyên sinh cóthể lưu động Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn nhưng về đường kính thìthường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thông thường là 5-10 µm) Đầu sợi nấm cóhình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone) Lúc sợi nấm sinh trưởngmạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng, vùng này có thể dài đến 30

µm Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa Màngnguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào Trên màng nguyên sinh chất có một sốphần có thể cấu tạo gấp nếp hay xoắn lại

Người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome) Nhiềukhi chúng có tác dụng tiết xuất các chất nào đó

Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus a 1 lớp, b 2 lớp, c phiến, d tia, e tể(theo Samson và ctv., 1995

2.2.1.3 Thành phần tế bào của một số loại nấm mốc

Thành tế bào (cell wall) của nấm có thành phần hóa học khác nhau Đây là một tiêuchí quan trọng khi định loại nấm sau đây là các thành phần chính của thành tế bào ở một

số nấm:

2.2.1.4 Vị trí và vai trò chung của nấm mốc

Nấm mốc có ảnh hưởng xấu đến cuộc sống con người một cách trực tiếp bằng cáchlàm hư hỏng, giảm phẩm chất lương thực, thực phẩm trước và sau thu hoạch, trongchếbiến, bảo quản Nấm mốc còn gây hư hại vật dụng, quần áo hay gây bệnh cho người,động vật khác và cây trồng Tuy nhiên, các qui trình chế biến thực phẩm có liên quan đếnlên men đều cần đến sự có mặt của vi sinh vật trong đó có nấm mốc Nấm mốc cũng giúptổng hợp những loại kháng sinh (penicillin, griseofulvin), acit hữu cơ (acit oxalic, citric,gluconic ), vitamin (nhóm B, riboflavin), kích thích tố (gibberellin, auxin, cytokinin),một số enzyme và các hoạt chất khác dùng trong công nghiệp thực phẩm và y, dược, nôngnghiệp và chăn nuôi đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới Ngoài ra, nấm còn giử vaitrò quan trọng trong việc phân giải chất hữu cơ trả lại độ mầu mỡ cho đất trồng

Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào tửbụi phồng lên ở ngọn Các chuổi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng Bào

tử bụi có thể màu vàng (Aspergillus flavus), màu đen (Aspergillus niger) NấmAspergillus oryzae là loài mốc chính trong quá trình chế tạo tương và tương doAspergillus oryzae lên men ngon hơn các tương khác vì loại mốc này có khả năng biếnđổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm cho tương có vị ngọt Hai loài không độc làmtương là Aspergillus oryzae và Aspergillus sojae có hình thái và màu sắc rất giống với 2loài rất nguy hiểm là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản sinh ra độc tốAflatoxin gây bệnh ung thư

Nấm Aspergillus niger tổng hợp các acit hữu cơ như acit citric, acit gluconic, cácenzyme…

2.2.2 GIỚI THIỆU VỀ NẤM MỐC ASPERGILUS

Ngày nay, bên cạnh vi khuẩn và virus là các tác nhân gây bệnh đã từng được đề cậprất nhiều, người ta còn thấy nhóm vi nấm cũng bắt đầu gây tác hại lên cơ thể con người

Do việc sử dụng kháng sinh không đúng cách hoặc dùng nhiều thuốc ức chế miễn dịch,

do sự xuất hiện ngày càng nhiều các bệnh gây suy giảm sức đề kháng và do điều kiệnsống thấp, dinh dưỡng kém, thiếu vệ sinh nên vi nấm ngày càng có cơ hội phát triển và

gây bệnh Aspergillus fumigatus là một loại nấm thuộc giống Aspergillus và là một trong những loài nấm Aspergillus thường gặp nhất và gây bệnh ở những đối tượng suy giảm miễn dịch A fumigatus có bộ gen đơn bội ổn định, không có biết rõ chu kỳ hữu tính của

loài nấm này và sinh sản bằng cách hình thành bào tử dính (conidiospores) và giải phóngvào trong môi trường Chúng có khả năng phát triển ở nhiệt độ 37°C (cùng thân nhiệt củangười), bào tử là các chất ô nhiễm do hít phải gặp nhiều nhất ở người; tuy nhiên, chúngcũng bị loại trừ nhanh chóng nhờ hệ miễn dịch ở trên những người khỏe mạnh

Aspergillosis là một nhóm bệnh từ hệ quả nhiễm Aspergillus spp gồm dạng bệnh

Asperrgillus thể xâm nhập (invasive aspergillosis), ABPA và u nấm (aspergilloma) Một

số bệnh nhân hen phế quản có thể trở nặng do nhiễm nấm này Thường nấm tồn tại trongkhông khí, không gây thành bệnh, nhưng khi cơ thể suy giảm miễn dịch như mắc cácbệnh ung thư bạch cầu, bệnh nhân đang dùng corticosteroides, bệnh nhân có ghép tạng,

xơ hóa nang, HIV/AIDS, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, lao, bệnh u hạt mạn tính, hennặng và cơ địa mẫn cảm với nấm

Phân loại học nấm thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, bộ Eurotiales, họ

Trichocomaceae, giống Aspergillus Canh thang nuôi cấy nấm A fumigatus được lựa

chọn

Một số indolicalkaloids với đặc tính chống nguyên phân (anti-mitotic) đã được nhậnbiết Những hợp chất thích hợp được phân loại là tryprostatins, với spirotryprostatin B

Aspergillus là loại nấm có hình giống sợi, có mặt khắp nơi trong tự nhiên Chúng thường

phân lập thấy trong đất, mảnh vụn cây cỏ, môi trường trong và ngoài nhà Giống

Aspergillus gồm hơn 185 loài, khoảng 20 loài đã được báo cáo như là tác nhân gây ra các

nhiễm trùng cơ hội ở người Trong số này, Aspergillus fumigatus là loài được phân lập phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus flavus và Aspergillus niger Nhóm Aspergillus

clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus và Aspergillus versicolor là những loài khác mà khi phân lập ít

gặp hơn và ít nhận ra là đóng vai trò trong các bệnh nhiễm trùng cơ hội

2.2.2.1 Đặc điểm đại thể (Marcoscopic featues)

Đặc điểm đại thể chính trong các loài nấm này là các chỉ điểm như tỷ lệ phát triển

của nấm, màu sắc, khuẩn lạc và sự dung nạp với nhiệt độ Ngoại trừ Aspergillus nidulans

và Aspergillus glaucus, tỷ lệ phát triển là từ nhanh đến trung bình Trong khi Aspergillus

nidulans và Aspergillus glaucus phát triển chậm và đạt đến kích cỡ khuẩn lạc 0.5-1cm sau

khi ủ ở nhiệt độ 25°C trong 7 ngày trên môi trường thạch Czapek-Dox, các loài còn lại thìđạt kích thước đường kính 1-9cm trong môi trường đặc biệt Sự khác biệt về tỷ lệ pháttriển như vậy đã giúp các nhà khoa học định loài rõ ràng hơn Các khuẩn lạc của

Aspergillus thì lấm chấm đến bột trên sợi Màu sắc bề mặt có thể khác nhau tùy theo loài

và đảo ngược màu sắc về vàng nhạt trong hầu hết các phân lập Tuy nhiên, đảo màu sắc

có thể từ màu tí đến màu oliu trên một vài dòng của nấm Aspergillus nidulans và từ màu cam sang màu tía trên dòng Aspergillus versicolor.

Aspergillus fumigatus là một loại nấm dung nạp tốt với nhiệt độ và phát triển tốt ở

nhiệt độ trên 400C Đặc tính này là duy nhất chỉ có ở riêng Aspergillus fumigatus trong số các loàiAspergillus Aspergillus fumigatus có thể phát triển ở khoảng nhiệt độ từ 20-50°C.

2.2.2.2 Đặc điểm vi thể (Microscopic features).

Về vi thể, các loài nấm này tương đối giống nhau Tuy nhiên, một số cấu trúc vi thểkhác đặc trưng cho một vài loài và có các chỉ điểm riêng biệt cho xác định loài, dựa trênmàu sắc bề mặt và khuẩn lạc nấm

Đặc điểm chung cho tất cả loài nấm

Trụ nấm tách biệt và có hyalin Các bào tử có nguồn gốc xuất phát từ các tế bào chânđáy trên trụ đỡ và kết thúc bằng một túi nấm ở đầu Túi này là một sự hình thành đặc

trưng cho giống nấm Aspergillus Hình thể và màu sắc của các bào tử nấm khác nhau giữa

các loài Bao phủ toàn bộ bề mặt túi nấm hoặc từng phần chỉ trên đầu túi (dạng radiatehead hoặc columnar head) tính với túi trực tiếp hoặc dính thông qua một tế bào nâng đỡ,gọi là metula

Đặc điểm riêng chỉ có trên một vài loài nấm

Cấu trúc vi thể khác gồm có tế bào Hulle, tế bào xơ,thể quả dạng cầu Các cấu trúc

này là dấu quan trọng và chính yếu giúp định loại các loài nấm Aspergillus Dạng cầu là

một bộ phận tròn, dính liền với nang nấm, mang các bào tử nấm Các nang nấm lan rộng

ra xung quanh khi dạng cầu vỡ ra Dạng cầu được sinh ra trong giai đoạn sinh sản hữu

tính của một vài loài Aspergillus Bào tử đính bên là một loại bào tử đính hay hạt đính

(conidium) được sinh ra bởi sự ly giải tế bào nâng đỡ nó Chân nấm thường cắt cụt vàmang cái mảnh còn lại của các tế bào ly giải Các tế bào Hulle là các tế bào lớn vô trùngmang ruột nhỏ Tương tự như dạng cầu, nó gắn với giai đoạn hữu tính của một vài loài

1.a Thể bình hai tầng

2.a Khuẩn lạc (bông) trên môi trường thạch czapeck nhìn mắt thường có màu đennhư than

3.a Conidi trưởng thành có đường kính 6-10m

A carbonarius (Bainier) Thom3.b Conidi trưởng thành có đường kính 5,0 m trở xuống

4.a Cuống conidi không quá 4mm chiều dài

5.a Khuẩn lạc lan rộng nhanh chóng trên thạch czapeck

A ficuum (Reich) Hennings5.b Khuẩn lạc mọc chậm trên thạch czapeck

6.a Conidi trưởng thành dẹt ra theo chiều dài hoặc vạch kẻ sọc

A phoenicis (Cda) Thom6.b Conidi trưởng thành hình cầu, phần lớn 4,0-5,0 m xù xì không đều, với những

gờ rõ và gai không xếp thành vạch kẻ sọc theo chiều dài

A niger V Tiegh4.b Cuống conidi trưởng thành dài quá 5mm tới 1cm, nhưng thường cũng có nhữngthân ngắn hơn mang những bông tiêu giảm

A pulverulentus (Mc Alp) Thom2.b Khuẩn lạc (bông) màu nâu ôliu hơi xám hoặc nâu – ôliu đậm khi còn non thườngtrở thành màu nâu hơi đỏ cho đến đen hơi nâu, nhưng với màu ôliu hoặc hơi màu xámthường giữ mãi

3.a Bông mau chóng có màu đen nâu đậm hoặc nâu hơi đỏ

4.a Conidi có đường kính dưới 5m, dẹt theo chiều ngang và có kẻ sọc khi trưởngthành

5.a Bông mau chóng có màu đen nâu đậm khuẩn lạc mặt trái không màu, cuốngconidi phần lớn dài 2-3 mm, có thể dài tới 5,0 m, conidi phần lớn đường kính 3,0 m-3,5 m

A.awamori Nakazawa

4.b Conidi đường kính 6,0 đến 8,0 m, hình cầu đến hình gần cầu, nối cục khô

A flavo- fureatis

Batista và Maia(xem nhóm A.flavus)3.b.Bông giữ mãi màu nâu đậm hơi xám hoặc nâu ôliu

4.a Conidi hình elip, có gai rõ 5,0-5,3x3,3-3,8m

A ellipticus sp Nov4.b Conidi chín hình cầu gần như hình cầu, đôi khi hình elip non

5.a Conidi chín có gai rõ

A heteromorplus

Batista và Mais5.b Conidi chín xù xì nhẹ không đều

6.a Bông nói chung nhỏ, khi già trên thạch mạch nha tách ra thành khá nhiều cột dàyđặc phân kì

A foetidus (Naka)

Thom và Raper

6.b Bông to, cột ít không rõ rệt trên thạch mạch nha

7.a Nền hệ sợi trên thạch mạch nha không có màu hoặc chỉ hơi vàng

A foetidus (Naka)

T và R.var.acidus N,S, và W1b Thể hai tầng

2.a Conidi hình cầu đến gần cầu, có gai rõ, bọng thường 20-35m nhưng có thể từ15-45m

2.b Conidi gần cầu elip rõ,bọng thường đến 60-80m, có thể từ 35-100m

cafe

Bông hình cầu có màuđen Bọng hình cầu Thểbình 1 hoặc 2 tầng, ở đa

số loài thể bình 2 tầng,Metulae dài gấp đôi tầngPhialides Vách cuốngconidi trơn Hạt đính hìnhcầu đến gần cầu, có gai

rõ

Trụ nấm tách biệt và có hyalin Các bào tử có nguồn gốc xuất phát từ các tế bào chânđáy trên trụ đỡ và kết thúc bằng một túi nấm ở đầu Túi này là một sự hình thành đặc

trưng cho giống nấm Aspergillus Hình thể và màu sắc của các bào tử nấm khác nhau giữa

các loài Aspergillus có bào tử màu đen

Cơ thể dạng sợi, gọi là khuẩn ty hay sợi nấm (hypha), nhiều sợi (lypha), hợp lạithành hệ sợi nấm (mycelium)

Khuẩn ty của nấm mốc A.niger tăng trưởng ở ngọn, vừa dài ra vừa ngăn vách tạo

thành nhánh Khuẩn ty có 2 loại:

Khuẩn ty cơ chất (hay khuẩn ty dinh dưỡng) có kích thước nhỏ, màu trắng, bám chặtvào cơ chất môi trường và hấp thu các chất dinh dưỡng Các khuẩn ty nay bện thành khối.Khi già hệ sợi nấm mốc ngả sang màu vàng.

Khuẩn ty khí sinh (hay khuẩn ty sinh sản) có kích thước lớn hơn khuẩn ty cơ chấtnhiều lần, trong suốt trên bề mặt cơ chất và từ khuẩn ty khí sinh sẽ có 1 sợi phát triểnthành cơ quan sinh sản đặc biệt, mang bào tử

Thành của khuẩn ty nấm có cấu tạo sợi, thành phần hóa học chính là chitin vàglucan

Ở A.niger cơ quan sinh sản có dạng như hoa cúc nên được gọi là “nấm cúc” Cuốngbào tử trơn nhẵn, trong suốt hoặc nâu nhạt, cuống bào tử có phần phình to rõ rệt ở đầu, tạothành bọng lớn dạng hình cầu thường được gọi là bọng đỉnh giá hình cầu(vesicle), trên cómọc lên những thể bình là cơ quan tạo bào tử đính (conidi) và từ ngọn thể bình sinh ra cácchuỗi bào tử đính (conidia)

2.2.3.4 Đặc điểm sinh lý

Loại Aspergillus niger phân bố nhiều trong tự nhiên, trong đất, ở xác bã thực vật,

hoa quả và đặc biệt có nhiều ở vùng khí hậu ấm áp

Chúng là những cơ thể hiếu khí sống hoại sinh hoặc kí sinh, không có khả năngquang hợp tạo chất hưu cơ mà sống nhờ khả năng hấp thụ các loại chất hữu cơ có sẵn qua

bề mặt khuẩn ty

2.2.3.5 Đặc điểm sinh hóa

Khả năng đồng hóa các loại đường khác nhau

A.niger đồng hóa tốt các loại đường như glucose, fructose, saccharose, mannose Đối

với đường sorbose, galactose, A.niger đồng hóa ở mức khá tốt, còn đường lactose thìđồng hóa ở mức trung bình

Nguồn dinh dưỡng nitơ

A.niger có khả năng sử dụng ure làm nguồn N và chất điều chỉnh pH, duới tác dụngcủa enzyme urease, ure phân hủy thành CO2 và NH3 A.niger đồng hóa các muối amon.Việc sử dụng nguồn N hữu cơ, urease và các muói amon đều gắn liền với việc tách NH3 rarồi hâp thu vào cơ thể Như vậy NH3 là trung tâm của con đường dinh dưỡng nitơ của visinh vật.

Nguồn dinh dưỡng khoáng phospho

Sự có mặt của các hợp chất phospho và nồng độ của chúng trong môi trường có ảnhhưởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật Thay đổi nồng độ cáchợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến thay đổi các quá trình tổng hợp hàng loạtcác chất hợp phần của tế bào có chứa phospho, tế bào và chất nhân Ngoài ra, phospho cótrong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzyme đồng hóa các loại thức

ăn cacbon

Khả năng sinh tổng hợp enzyme

A.niger có khả năng sinh các enzyme như amylase, protease, peptinase, và đặc biệt

là hệ enzyme cellulase

2.2.3.6 Đặc điểm sinh sản.

A.niger có thể sinh sản theo hai hình thức chính:

Sinh sản sinh dưỡng: từ một đoạn khuẩn ty riêng lẻ có thể phát triển thành một hệsợi nấm Khuẩn ty của nấm mốc có thể lẫn vào bụi, không khí bay đi khắp nơi, gặp điềukiện thuận lợi sẽ nhanh chóng phát triễn thành khuẩn lạc mới

Sinh sản vô tính: Reaper và thơm (1968) cho rằng A.niger sinh sản vô tính bằng bào

tử trần (conidium) Hầu như các bào tử trần là các bào tử ngoại sinh, nghĩa là được hìnhthành ở bên ngoài tế bào sinh bào tử trần (conidiogenóu cell) Các bào tử này sinh ra trựctiếp trên khuẩn ty hoặc đặc biệt là cuống bào tử trần (conidiophone)

2.2.3.7 Ứng dụng

Hiện nay, A.niger được sử dụng rộng rãi và phổ biến trong 1 ngành kinh tế khác đểthu nhận các chế phẩm sinh học như acid hữu cơ, enzyme, protein

Trong chăn nuôi, ứng dung lên men thu enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi giúpvật nuôi tăng khả năng tiêu hóa, tăng sức đề kháng, cải thiện năng suất vật nuôi giúp vậtnuôi phát triển tốt hơn, tăng trọng nhanh hơn tăng lợi nhuận kinh tế,…

2.2.4 GIỚI THIỆU VỀ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE

Asp oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes (nang

khuẩn ) Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiềungang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào(nấm đa bào ) Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là

cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính Cuống đính bào tử của Asp.oryzae

thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường Phía đầu cuống đính bào tửphồng lên gọi là bọng Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi lànhững tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào

nhau, nên gọi là đính bào tử Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng

Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào

(amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong cácthùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ởlỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen,vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơivào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới

Aspergilus Oryzae là một loại nấm vi thể, cơ chế sinh trưởng của nó là 1 hệ sợi bao

gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5 – 7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang,chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào) Từ những sợi nằm ngang này hình thànhnhững sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính Cuống

đính bào tử Asp.oryzae thường dài 1 – 2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường phía

đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng từ bọng này phân chia thành những tế bàonhỏ thuôn dài gọi là những tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thànhnhững bào tử đính vào nhau nên gọi là đính bào tử đính bào tử có màu vàng lục hay màuvàng hoa cau

Thường gọi là mốc màu vàng hoa cau Khi mới phát triển, hệ sợi có màu trắng sau

đó chuyển sang màu vàng, khi già chuyển sang màu lục

Có khả năng sinh enzyme rất mạnh chủ yếu là Amylase, invertase, maltose,protease, lipase, cellulase, các enzyme oxy hóa khử…

Ta thường hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột,gạo…đã hết hay chưa được rữa sạch ở cặn bã bia , rượu, ở lõi ngô, bã sắn…chúng mọc

và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng Màu do các bào tử già có màusắc các bào tử này dễ bị gió cuốn bay đi xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽmọc thành mốc

Aspergilus Oryzae, Có khả năng biến đổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm cho

tương có vị ngọt

2.2.5 ĐẠI CƯƠNG VỀ ENZYME

2.2.5.1 Định nghĩa về enzyme

Trong cơ thể sống ( các tế bào ) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất Sự trao đổichất ngừng thì sự sống không còn tồn tại Quá trình tro đổi chất của một chất là tập hợpcác quy luật của rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau Các phản ứng hóa học phứctạp này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau Enzyme là các hợp chấtprotein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu cácphản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướngnhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống.

Chúng có trong hầu hết các loại tế bào củ cơ thể sống Chính do những tác nhân xúctác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học(biocatalysators ) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa học

Enzyme học là khoa học nghiên cứu những chất xúc tác sinh học có bản chất protein.Hay nói cách khác enzyme học là khoa học nghiên cứu tính chất chung, điều kiện và tínhđặc hiệu của các enzyme

2.2.5.2 Lịch sử hình thành và phát triển enzyme

Enzyme đã được sử dụng rất lâu Khoảng 5.000 năm trước công nguyên ở jerico,người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì Trong thành cổ Babylon, rượu vang là thứnước uống được mọi người ưa thích trong quá khứ…Nướng bánh mì, nấu rượu vang, sảnxuất dấm, tương, chao,…ở các mức độ khác nhau, là những quá trình sinh học xưa nhấttrong lịch sử phát triển văn minh nhân loại

Quan sát đầu tiên về quá trình phân rã xúc tác bởi enzyme được thực hiện bởiSpallaazani (1729-1799) Năm 1815 Kirchhoff phát hiện thấy ở mầm đại mạch có chứaprotein làm tan tinh bột Năm 1833 Payen và Persoz đã đặt tên cho dịch này là diastase(tiếng hy lạp có nghĩa là tách rời ) Vào 1857 Pasteur chứng minh rằng quá trình lên men

do nấm men thực hiện

Kuhne vào năm 1878 đặt tên là enzyme ( theo tiếng hy lạp có nghĩa là bột chua –sourdough) Năm 1879 Buchner đã chứng minh là dịch chiết tế bào nấm men cũng có khảnăng lên men tạo cồn từ đường Quyển sách đầu tiên tập hợp những hiểu biết về enzymeđược Green viết vào năm 1901

Việc sử dụng enzyme cho mục đích công nghiệp được người mỹ gốc nhật tên làOkishi Takamine khởi xướng dựa trên nguồn enzyme từ nấm mốc.

Năm 1894 ông được nhận bằng sang chế cho sản phẩm là Takadiastase chừa diastase

từ nấm sợi ( fungi) Năm 1895 Ausguste Boidin phát minh ra phương pháp sản xuất cồn

Năm 1960 hãng Novo Noridisk ( NO ) bắt đầu sản xuất protease kiềm từ bacillus

licheniformis, để bổ sung vào chất tây rửa hiện nay protease chiếm tới 60% thị phần toàn

bộ enzyme đang được sử dụng trong công nghiệp

2.2.5.3 Ứng dụng của công nghệ enzyme ngày nay

Công nghệ enzyme hiện đại tập trung vào công nghệ bảo quản sau thu hoạch thựcphẩm, sử dụng có hiệu quả nguyên liệu và gia tăng chất lượng cũng như mùi vị thực phẩmtrong chế biến thực phẩm nhằm mục đích giảm giá thành, giảm năng lượng tiêu hao trongsản xuất

Thời gian sau này enzyme bắt đầu được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất hóachất, dược phẩm và xử lý môi trường

Các phương pháp của công nghệ enzyme đang có xu thế thay thế phương pháp hóahọc truyền thống

Ngày nay công nghệ enzyme phát triển theo hướng:

Sử dụng enzyme trong môi trường khan nước tạo chất có cấu trúc lập thể đặchiệu, tạo polymer đặc hiệu dễ phân hủy

Trong xử lý tái sử dụng phế thải thực phẩm và nước thải

Sử dụng cellulae và lipase trong sản xuất chất tẩy rửa

Trong sản xuất cyclodetrin từ tinh bột

Sản xuất enzyme động vật bằng lên men vi sinh vật chuyển gen

Sản xuất công nghiệp enzyme bằng kỹ thuật gen

2.2.5.4 Giới thiệu về enzyme cellulase

Enzyme cellulase là một trong những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quátrình chuyển hóa vật chất hữu cơ trong thiên nhiên có ý nghĩa rất quan trọng trong côngnghiệp thực phẩm, bảo vệ môi trường và đặc biệt là trong chế biến thức ăn chăn nuôi.Trong tự nhiên, lượng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase là rất lớn và rấtphong phú Chúng thuộc nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong cả một số loại nấm men

Trong đó, có những vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp nhiều enzyme: A.niger, A.oryzae,

aspergiluss spp,…

2.2.5.4.1 Phân loại enzyme.

Enzyme tham gia phân hủy cellulase phân ra làm 3 nhóm chủ yếu:

+ 1,4β-D-glucan cellobiohydrolase Enzyme cắt đầu không khử của chuỗi

cellulose để tạo thành cellobiose

+ 1,4β-D-glucan 4 glucanohydrolase: Enzyme này tham gia phân giải liên kết

β-1,4glucosid trong cellulase trong lichenin và β-D-glucan Tham gia tácđộng mạnh đến cellulose vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh

+ Β-D-glucoside glucohydrolase: Tham gia phân giải cellobiose, tạo thành

glucose Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy

2.2.5.4.2 Tính chất của enzyme cellulase

Dựa vào đặc tính phân giải cơ chất, các enzyme tham gia phân giải cellulose đượcphân ra làm 3 nhóm chủ yếu: endocellulase; exocellulase và β-1,4-glucosidase.

- Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết β-1,4-glucoside trong cellulose, lignin

và β-D-glucan một cách ngẫu nhiên

Sản phẩm của quá trình phân giải các cellulose phân tử nhỏ,cellobiose, glucose.Nhiệt độ, pH hoạt động của endocellulase từ vi sinh vật khác nhau cũng có sự khácnhau, nhưng nói chung hầu hết các enzyme này đều có nhiệt độ hoạt động khá cao Cácendocellulose của các vi sinh vật thường có tính chất khác biệt nhau nhiều

- Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạothành các cellulose dạng kết tinh mà có tác dụng làm thay đổi tính chất lý hóa của chúng,giúp cho endocellulose phân giải chúng

- Cellobiose: tham gia phân giải cellobiose và cellotetrose thành glucose Chúngkhông có khả năng phân giải cellulose dạng nguyên thủy enzyme này còn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase, β-1,4-glucosidase

2.2.5.4.3.Cơ chất của cellulase

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật, ngoài ra chúng còn được tìm thấy ở một

số tế bào vi sinh vật Cellulose không có trong tế bào động vật Cellulose là một loạihomopolyme của β-1,4-glucose, các gốc β-D-glucose nối với nhau qua liên kết β-1,4-glucoside Mức độ polymer hóa của phân tử cellulose thay đổi rất nhiều Từ vài trăm đến15.000, trung bình khoảng 3000 phân tử β-D-glucose Vì vậy khối lượng phân tửcellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Vander war và liên kết hydro tạo thành hệ sợi.Trong tự nhiên, các hệ sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng: vùngkết tinh và vùng vô định hình

Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng 50.000-2.500.000 Dalton

2.2.5.4.4 Cơ chế tác dụng của cellulase

Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự phân giải cellulose thành sản phẩmcuối cùng là glucose Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của phức hệ cellulase xảy ratheo ba giai đoạn chủ yếu:

Trong giai đoạn thứ nhất: dưới tác dụng của cellulose và các tác nhân của môitrường làm thay đổi tính chất lý hóa của cellulase, làm cho phân tử cellulose từ dạng tinhthể thành dạng hoạt động Thực tế, cho đến nay người ta cũng chưa rõ enzyme nào, tácnân nào tham gia vào quá trình này, người ta gọi các yếu tố này là C1 Khi phân tửcellulose ở dạng hoạt động, các endocellulose dễ dàng tác động và phân giải chúng thànhcellulose hòa tan (polysaccharide), cellotetrose, cellobiose, glucose, mà chủ yếu của giaiđoạn này là tạo thành các cellulose hòa tan

Giai đoạn thứ hai, các cellulose đã biến đổi sau giai đoạn một bị phân giải cáccellobiose (disaccharide) và cellotetrose dưới tác dụng của exocellulase

Giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của cellobiose (β-1,4-glucosidase), các đoạncellobiose bị thủy phân thành glucose, β-1,4-glucosidase là những enzyme rất đặc hiệuthủy phân cellobiose thành D-glucose

Quá trình phân giải cellulose chỉ có thể tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sửdụng đồng bộ ba loại enzyme trong hệ enzyme cellulase