Khảo Sát Khả Năng Sinh Enzyme Mannanase Của Vi Khuẩn Bacillus Subtilis

Kết quả đạt được : - Khảo sát khả năng sinh enzyme Mannanase từ các môi trường lỏng và rắn có tỷ lệ thành phần khác nhau, ta kết luận được môi trường lỏng L1 và môi trường rắn R1 là 2 mô

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

*****************

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH ENZYME MANNANASE

CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis

Giảng viên hướng dẫn : Th.s NGUYỄN KHÁNH LINH

TÓM TẮT

Tên đề tài : Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis Địa điểm tiến hành luận văn : Phòng Nghiên Cứu Dinh Dưỡng Chăn Nuôi thuộc Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam

Trong 6 tháng đầu năm 2009, giá thức ăn chăn nuôi tăng 5-8% so với cuối năm 2008

và quý I/ 2009, tuỳ từng loại thức ăn và từng vùng Để giảm giá thức ăn hỗn hợp, người nông dân thường trộn các nguyên liệu rẻ tiền như khô cọ, khô dừa, vỏ đậu nành Các nguyên liệu này lại giàu -Mannan và một số chất thuộc nhóm polysaccharide không phải tinh bột gây cản trở sự tiêu hoá thức ăn, ngăn trở chất dinh dưỡng hấp thụ qua niêm mạc ruột Để giải quyết vấn đề này, tôi tiến hành nghiên cứu sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm chế phẩm enzyme Mannanase Chế phẩm enzyme này có tác dụng phân cắt -Mannan, làm giảm độ nhớt dịch ruột, tạo điều kiện cho niêm mạc ruột hấp thu chất dinh dưỡng được dễ dàng.Bên cạnh đó, -Mannan bị phân cắt thành những mannose oligosaccharide, chúng giữ vai trò là các prebiotic, có tác dụng loại bỏ vi khuẩn bệnh bám dính thượng bì ruột, kích thích hệ miễn dịch ruột hoạt động, từ đó giúp tăng cường sức khoẻ ruột, hạn chế rối loạn tiêu hoá

Kết quả đạt được :

- Khảo sát khả năng sinh enzyme Mannanase từ các môi trường lỏng và rắn có tỷ

lệ thành phần khác nhau, ta kết luận được môi trường lỏng L1 và môi trường rắn R1 là 2

môi trường tối ưu cho sự sinh tổng hợp enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis

- Từ môi trường tối ưu lỏng L1, tiến hành khảo sát các mốc thời gian xác định, ta kết luận được thời điểm là 120 giờ là thời điểm tốt nhất để thu nhận chế phẩn enzyme Mannanase

- Từ môi trường tối ưu rắn R1, tiến hành khảo sát môi trường này ở các độ ẩm khác nhau, ta kết luận được môi trường R1 với độ ẩm 65% là tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase

- Từ môi trường tối ưu rắn R1, tiến hành khảo sát các mốc thời gian xác định, ta kết luận được thời điểm là 120 giờ là thời điểm tốt nhất để thu nhận chế phẩn enzyme Mannanase

Nghiên cứu này phục vụ cho người nông dân, giảm chi phí sản xuất, giảm giá thành thức ăn chăn nuôi, tăng tỷ lệ hấp thụ thức ăn cho gia súc, gia cầm và tăng chất lượng vật nuôi Nhờ đó, người nông dân nhanh thu hồi vốn để tái sản suất đầu tư thu lợi nhuận, cải thiện đời sống

MỤC LỤC

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh mục các sơ đồ vii

Danh mục các hình vii

Danh mục các bảng viii

Danh mục các đồ thị ix

GIỚI THIỆU 1

Đặt vấn đề 1

Mục đích và phạm vi đề tài 1

Ý nghĩa của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis 4

1.1.1 Vị trí phân loại 7

1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố 7

1.1.3 Đặc điểm hình thái 7

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tồn tại, phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis 8 1.1.5 Lợi ích của Bacillus subtilis 8

1.1.6 Tác hại của Bacillus subtilis 8

1.2.2 Tính chất của enzyme Mannanase 14

1.2.3 Nguồn thu nhận enzyme Mannanase 14

1.2.4 Các phương pháp thu nhận enzyme Mannanase hiện nay 15

1.2.5 Ứng dụng của enzyme Mannanase 21

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 24

2.2 Nội dung nghiên cứu 24

2.3 Vật liệu thí nghiệm 24

2.3.1 Đối tượng thí nghiệm 24

2.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm 24

2.3.3 Hoá chất và môi trường thí nghiệm 25

2.3.4 Phương pháp 27

2.3.4.1 Nhuộm gram 27

2.3.4.2 Tiến hành hoạt hoá và tăng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis 28

2.3.4.3 Phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis trong môi trường lỏng 28

2.3.4.4 Phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis trong môi trường rắn 29

2.3.4.5 Tiến hành xác định hoạt tính enzyme Mannanase 30

2.3.4.6 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase của Bacillus subtilis 32

2.3.4.7 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men của môi trường lỏng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase của Bacillus subtilis 33

2.3.4.8 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men và độ ẩm môi trường rắn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase của Bacillus subtilis 34

2.3.4.9 Tiến hành lên men thử nghiệm sản xuất chế phẩm enzyme ở quy mô

phòng thí nghiệm 35

2.3.4.10 Kiểm tra an toàn sinh học của chế phẩm 36

2.3.4.11 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quan và nhiệt độ bảo quản đến độ bền của chế phẩm enzyme Mannanase 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40

3.1 Kết quả nhuộm gram 41

3.2 Kết quả hoạt hoá và tăng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis 41

3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase của Bacillus subtilis 43

3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men của môi trường lỏng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase của Bacillus subtilis 46

3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men và độ ẩm môi trường rắn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis 48

3.6 Tiến hành lên men thử nghiệm sản xuất chế phẩm enzyme ở quy mô phòng thí nghiệm 51

3.7 Kết quả kiểm tra an toàn sinh học của chế phẩm 54

3.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản và nhiệt độ bảo quản đến độ bền của chế phẩm enzyme Mannanase 54

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

4.1 Kết luận 59

4.2 Đề nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 62

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1. Các chất thuộc nhóm NSP 9

Sơ đồ 1.2 β-mannase phá vỡ vách tế bào giúp enzyme nội sinh tiếp cận và tiêu hóa chất dinh dưỡng 10

Sơ đồ 1.3 Beta-mannanase của Hemicell chia nhỏ polymer Beta-mannan thành những phân đoạn MOS ( Mannose Oligossacharide) 12

Sơ đồ 2.1 : Quy trình sản xuất chế phẩm enzyme ở quy mô phòng thí nghiệm 35

Sơ đồ 2.2 Quy trình định lượng Coliforms, coliform phân và E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 37

Sơ đồ 2.3 Quy trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm 39

DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus Subtilis 7

Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của Mannanase 11

Hình 1.3 Cấu trúc không gian (A) và tâm hoạt động (B) của Mannanase 26A Pseudomonase cellulose 13

Hình 1.4 Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay 16

Hình 1.5 Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường đặc 17

Hình 3.1 Kết quả nhuộm gram của Bacillus subtilis 41

Hình 3.2.1 Khuẩn lạc của Bacillus subtillis trên môi trường NA 41

Hình 3.2.2 Kết quả của quá trình tăng sinh Bacillus subtillis 42

Hình 3.3 Môi trường lên men rắn và lỏng 43

Hình 3.4 Môi trường lỏng sau lên men 48

Hình 3.5 Môi trường tối ưu R1 với 4 độ ẩm khác nhau 48

Hình 3.6.1 Môi trường rắn sau khi sấy 52

Hình 3.6.2 Môi trường lỏng sau lên men 53

Hình 3.6.3 Đóng gói chế phẩm 53

DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số chế phẩm enzyme sản xuất từ Bacillus 5

Bảng 1.2 Một số loại kháng sinh sản xuất từ Bacillus 6

Bảng 3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men rắn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase của chủng Bacillus subtilis 43

Bảng 3.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men lỏng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase của chủng Bacillus subtilis 45

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase trong môi trường L1 của chủng Bacillus subtilis 46

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men và độ ẩm môi trường rắn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis 49

Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra an toàn sinh học của chế phẩm 54

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát nhiệt độ bảo quản và thời gian bảo quản ảnh hưởng đến độ bền enzyme Mannanase 55

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men rắn đến khả năng sinh

enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis 44

Đồ thị 3.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men lỏng đến khả năng

sinh enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis 45

Đồ thị 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh enzyme

Mannanase trong môi trường L1 từ Bacillus subtilis 47

Đồ thị 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men và độ ẩm môi trường rắn

đến khả năng sinh enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis 50

Đồ thị 3.8.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản

của chế phẩm rắn 56

Đồ thị 3.8.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản

của chế phẩm lỏng 56

GIỚI THIỆU

 Đặt vấn đề

Theo dự ước của cơ quan chuyên môn, trong 6 tháng đầu năm 2009, sản lượng thức

ăn chăn nuôi đạt 4.55 triệu tấn so với cùng kỳ năm trước tăng 12% (4.2 triệu tấn) Giá thức ăn chăn nuôi tăng 5-8% so với cuối năm 2008 và quý I/ 2009, tuỳ từng loại thức ăn

và từng vùng

Để giảm giá thức ăn hỗn hợp, người ta thường trộn các nguyên liệu rẻ tiền như khô

cọ, khô dừa, vỏ đậu nành Các nguyên liệu này lại giàu -Mannan và một số chất thuộc nhóm polysaccharide không phải tinh bột gây cản trở sự tiêu hoá thức ăn, ngăn trở chất dinh dưỡng hấp thụ qua niêm mạc ruột Vấn đề đặt ra là làm sao để loại bỏ yếu tố kháng dinh dưỡng này?

Chế phẩm -Mannanase là enzyme phân giải -Mannan Khi đưa vào hỗn hợp thức

ăn chứa nguyên liệu giàu -Mannan, enzyme này có tác dụng phân cắt -Mannan, làm giảm độ nhớt dịch ruột, tạo điều kiện cho niêm mạc ruột hấp thu chất dinh dưỡng được dễ dàng Bên cạnh đó, -Mannan bị phân cắt thành những đoạn ngắn hơn là những mannose oligosaccharide, chúng giữ vai trò là các prebiotic, có tác dụng loại bỏ vi khuẩn bệnh bám dính thượng bì ruột, kích thích hệ miễn dịch ruột hoạt động, từ đó giúp tăng cường sức khoẻ ruột, hạn chế rối loạn tiêu hoá

Từ những nhận định trên, tôi thực hiện đề tài “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH

ENZYME MANNANASE CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis”

Đề tài luận văn này là 1 phần trong đề tài nghiên cứu về chế phẩm đa enzyme của Phòng Nghiên Cứu Dinh Dưỡng Chăn Nuôi thuộc Viện Khoa học Kỹ Thuật Nông Nghiệp

Miền Nam

 Mục tiêu và phạm vi của đề tài

- Xác định được môi trường, độ ẩm, thời gian tối ưu cho sự sinh tổng hợp enzyme

Mannanase của vi khuẩn Bacillus subtilis

- Đưa vào lên men thử nghiệm sản xuất chế phẩm enzyme Mannanase ở quy mô

phòng thí nghiệm

 Ý nghĩa của đề tài

- Xác định được môi trường, độ ẩm, thời gian tối ưu cho sự sinh tổng hợp enzyme

Mannanase của chủng Bacillus subtilis

- Sản xuất chế phẩm enzyme Mannanase ở quy mô phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu phục vụ cho ngành chăn nuôi, chế phẩm enzyme này giúp tăng tỷ lệ hấp thụ thức ăn, giảm giá thành thức ăn chăn nuôi

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chủng Bacillus subtilis [9],[12],[14],[17]

Họ Bacillaceae có những đặc điểm sau

Trực khuẩn (tế bào hình que), không tạo chuỗi, có nội bào tử với tế bào sinh dưỡng

bị khúc xạ ánh sáng mạnh hơn, khó nhuộm màu và bền hơn với nhiệt và các yếu tố phá hủy khác Bào tử có chứa acid dipicolinic (5-10% so với chất khô), được bao bọc bởi cấu tạo glycan peptid và vỏ ngoài

Phần lớn vi khuẩn họ này là gram (+), chuyển động nhờ tiêm mao vị trí bên cạnh hay xung quanh Hiếu khí hay yếm khí tùy nghi Thường tạo các trực khuẩn thẳng hoặc hầu như thẳng, 0.3 - 2.2 x 1.2 x 7 µm, phần lớn di động tạo nội bào tử bền nhiệt trong mỗi

tế bào Dị dưỡng cần carbon hữu cơ, trao đổi chất thuộc loại hô hấp tuyệt đối, lên men tuyệt đối, vừa hô hấp vừa lên men sử dụng các chất hữu cơ lên men khác nhau Nhân tố cuối cùng tách điện tử trao đổi chất hô hấp là oxy phân tử ở một số chủng được thay nitrat Lượng G+X trong ADN của các dòng được nghiên cứu từ 32-62 mol %

Lợi ích của Bacillus :

- Tạo ra các loại chuyển hóa chất azốt và chất không chứa azốt giúp cải tạo đất

- Phân giải protid động vật, thực vật trong đất và nước rất mạnh (Bacillus mycoides, Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis)

- Sản xuất protein vi sinh vật từ dầu mỏ và khí đốt : có nhiều vi sinh vật sống ở các

mỏ dầu, khí đốt, ở đáy các bể chứa dầu, trên mặt đất, và trên mặt đường nhựa,

trong đó có Bacillus Các loại vi sinh vật này có khả năng oxy hóa hydrocarbon rất

cao Trong dầu mỏ, parafin chiếm 20%, đây là nguyên liệu vạn năng để nuôi cấy vi sinh vật, và nguồn nguyên liệu này rất phong phú và lại rẻ tiền

- Sản xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật

Bảng 1.1 Một số chế phẩm enzyme sản xuất từ Bacillus

Amylase chịu nhiệt

- Sinh tổng hợp acid amin từ vi sinh vật

- Bacillus có thể tổng hợp các loại acid amin sau : Alanin, acid glutamic, acid aspartic, Valin, xitrulin, metionin, phenylalanin, tirozin, treonin, izolenin, tryptophan, lizin

- Sinh ra kháng sinh

Bảng 1.2 Một số loại kháng sinh sản xuất từ Bacillus

Bacillus licheniformis Bacilizin, protixin

- Làm chế phẩm diệt côn trùng Ví dụ : Bacillus thuringiensis ở nhiều dạng thương phẩm khác nhau ở các nước Ngoài ra, còn sử dụng một số loài khác : Bacillus morila (Nhật); Bacillus cereus var gallerriaen (Tiệp, Trung Quốc); Cereus var Juroi (Nhật); Etimorbus ( Mỹ); Entomocidus (Tiệp); Popilliae (Mỹ)

Tác hại của Bacillus :

- Bacillus anthracis : gây bệnh than ở người (bệnh nhiệt thán)

- Bacillus cereus : gây tiêu chảy và nôn mửa

- Làm hư hỏng nhẹ các loại thực phẩm

- Bacillus stearothermopkilis : làm chua các loại rau đóng hộp : ngô, đậu ve, đậu Hà

Lan

- Bacillus coagulans : làm chua cà chua đóng hộp

- Bacillus : làm nhũn, đen, nhớt đối với rau ngâm giấm

- Bacillus licheniformis : làm có ga mứt chuối nghiền

- Bacillus subtillis, Bacillus mesentericus, Bacillus megatherium : gây thối rữa thịt

cá, lên men chua

Chủng đại diện là Bacillus subtilis (Ihrenberg) có một số đặc điểm sau

1.1.1 Vị trí phân loại

Giới : Bacteria Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli

Bộ : Bacillales

Họ : Bacillaceae Giống : Bacillus

Loài : Bacillus subtillis Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus Subtilis

1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố

Bacillus subtilis có mặt hầu hết trong tự nhiên, có nhiều trong rơm rạ nên được gọi

là “trực khuẩn rơm cỏ”, chúng còn phân bố bề mặt các loại hạt, hoa quả, thực phẩm, truyền thống như : mắm, tương, chao, mẻ

1.1.3 Đặc điểm hình thái

- Là loài trực khuẩn gram (+), hiếu khí, hình que ngắn, các tế bào tồn tại riêng

lẻ hay dính lại với nhau thành chuỗi ngắn

- Khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao, khi về già tiêm mao rụng nên vi khuẩn mất khả năng di động trong môi trường

- Khi gặp điều kiện không thuận lợi của môi trường sống, tế bào sẽ hình thành bào tử Kích thước của bào tử không lớn hơn kích thước của tế bào

- Khuẩn lạc : mờ, có thể hiện nhiều nếp nhăn, màu kem hoặc nâu, khi phát triển trong môi trường lỏng thì gắn liền nhau như một lớp màng mỏng và thường ở dạng

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tồn tại , phát triển của chủng Bacillus subtilis

Hầu hết là vi khuẩn hoại sinh Mỗi loại vi khuẩn chỉ tạo ra một bào tử nhằm chống

lại nhiệt độ nóng, lạnh, tia phóng xạ, môi trường khô và chất tẩy uế Bacillus còn có khả

năng sinh lý cho phép chúng sống trong những điều kiện pH, nhiệt độ và nồng độ muối

mà một vài tổ chức sống khác không thể tồn tại

1.1.5 Lợi ích của Bacillus subtilis

1.1.5.1 Tạo kháng sinh

Từ Bacillus subtilis có thể thu được kháng sinh có ích đối với nhiều loại vi trùng

gây bệnh như : subtilin ( Humfeld và Feustel, 1943), eumycin (Johsnon và Burdon, 1946), bacillin ( Foster và Woodruff, 1946), bacillomin ( shtikell và Poplavsski, 1995)

Ngoài subtilin từ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis có thể thu được nhiều kháng sinh

khác nữa

1.1.5.2 Sinh tổng hợp enzyme

Từ Bacillus subtilis có thể sinh tổng hợp được nhiều enzyme: amylase, protease,

Mannanase

1.1.6 Tác hại của Bacillus subtilis

Do có bào tử chịu nhiệt cao nên Bacillus subtilis có thể gây hư hỏng thực phẩm hộp

Khi đó, đồ hộp có vị chua, thối, không tạo gas hoặc có thể tạo gas trong môi trường có dạng đường

Bacillus subtilis là thủ phạm gây hỏng các sản phẩm sữa, bánh ngọt, socola, kẹo có nhân, nhất là sản phẩm nói trên khi bảo quản ở nhiệt độ nóng Bacillus subtilis gây bệnh

chảy nhớt khoai tây và chảy nhớt bánh mì do Laurent phát hiện đầu năm 1885 nên cũng

từ đó nó có tên gọi là “ trực khuẩn khoai tây”

1.2 Giới thiệu về enzyme Mannanase [1], [2], [3], [7]

Nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho lợn và gia cầm chủ yếu là ngũ cốc

và phụ phẩm của ngũ cốc Ngoài protein, lipid, chất dinh dưỡng cung cấp năng lượng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate

Tổng carbohydrate thực vật bao gồm: polysaccharide không phải tinh bột (non starch polysacharide: NSP), lignin và tinh bột

Nhóm NSP bao gồm cellulose, non-cellulosic polymer và pectic polysaccharide Cellulose là một polymer cấu tạo bởi các đơn vị đường glucose, nối với nhau bởi dây nối β-1,4 glucoside Non-cellulosic polymer bao gồm các chất: arabinoxylans, β- glucan, mannan, galactan, xyloglucan Pectic polysaccharide bao gồm các chất như polygalacturonic acid, arabinan, galactan, arabinogalactan

Nguồn: Ian Partridge,2004

Sơ đồ 1.1 Các chất thuộc nhóm NSP

Nguồn: Hemicell, Bayer Việtnam

Sơ đồ 1.2 β-mannase phá vỡ vách tế bào giúp enzyme nội sinh tiếp cận và

tiêu hóa chất dinh dưỡng

Mannanase ( EC 3.2.1.78) hay còn gọi là endo--1,4-Mannanase; mannanohydrolase) xúc tác thuỷ phân liên kết -1,4-mannozit của -1,4-mannan glucomannan và galactomannan, chuyển các polyme dị thể khá phổ biến trong tự nhiên này thành các mannooligosaccharides ( MOS) và một lượng nhỏ mannose

1.4--D-mannan-Phân huỷ sinh học mannan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzyme trong đó Mannanase thực hiện nhiệm vụ phân cắt mạch chính mannan thành các mannobiose, mannotriose, và hỗn hợp các oligosaccharides Các sản phẩm này sau đó lại được phân cắt bởi -D-mannosidase, -D-glucosidase và acetylesterase

 -D-mannosidase ( -D-mannosid mannohydrolase, EC 3.2.1.25) thuỷ phân

mannan, mannan dị thể và mannooligosaccharides giải phóng -D- mannose bắt đầu từ đầu không khử

 glucosidase ( D-glucosid glucohydrolase, EC 3.2.1.21) phân cắt liên kết

-D-glucosid của cellobiose và cellooligosaccharides bắt đầu từ đầu không khử giải phóng

-D-glucose Trong nhiều trường hợp, oligosaccharide chứa mannose và glucose ( sản phẩm thuỷ phân bằng -Mannanase) là cơ chất tốt nhất cho -D-glucosidase

 -galactosidase ( -D- galactosid galactohydrolase, EC 3.2.1.22), xúc tác thuỷ

phân liên kết galactosid có trong các oligosaccharide chứa galactose cũng như các polysaccharide phức tạp khác như galactomannan hay galactoglucomannan Khả năng thuỷ phân giải phóng galactose từ oligosaccharides khác nhau phụ thuộc nguồn gốc -galactosidase

 Acetylesterase ( acetylgalactoglucomannanesterase) thuỷ phân liên kết ester giải

phóng acid acetic từ acetyl galactoglucomannan

 Mannanase (endo--1,4-Mannanase; 1.4--D-mannan-mannanohydrolase, EC

3.2.1.78) phân cắt liên kết -1,4-mannozit trong mạch mannan thành mannobiose, mannotriose Cơ chế tác dụng của Mannanase được minh hoạ trên hình 1.1

Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của Mannanase

Nguồn: Hemicell, Behn Meyer

Sơ đồ 1.3 Beta-manannase của Hemicell chia nhỏ polymer beta-mannan thành

những phân đoạn MOS ( Mannose Oligossacharide) 1.2.1 Cấu tạo của enzyme Mannanase

Mannanase của vi khuẩn ưu nhiệt Thermotoga neapolitana 5068 là enzyme một cấu

tử Mannanase của vi khuẩn Pseudomonas cellulose bao gồm 385 acid amin Cấu tạo

không gian của Mannanase được chia thành 3 vùng : vùng A từ prolin 44 đến isoleucin

323, vùng B từ leucin 32 đến trytophan 360 và vùng C từ Threonin 392 đến Threonin 419 Các chuỗi Arg 39 – Lys 43, Arg 324 – Gly 331, Arg 361 – Thr 361 và Leu 420 – Lys 423

có chức năng nối các vùng trên với nhau Toàn bộ phân tử Mannanase cấu tạo bởi 8 chuỗi xoắn  và 8 chuỗi xoắn 

Hình 1.3 Cấu trúc không gian (A) và tâm hoạt động (B) của Mannanase 26A

Pseudomonase cellulose

Mannanase của Tricoderma reesei bao gồm 344 acid amin tạo thành 16 chuỗi  và

14 chuỗi  ngắn với 4 cầu disulfit : Cys26 và Cys29 nằm trên chuỗi xoắn 1, Cys 172 và Cys 175 nằm dọc theo cuộn xoắn 10-7, Cys 265 và Cys 272 nối 11 và cuộn xoắn

11- 13, Cys 284 và Cys 334 nối 11 và cuộn xoắn 11- 13, Cys 284 và Cys 334 nối

12 và 13 Tâm hoạt động của Mannanase từ Tricoderma reesei nằm trong một hốc của

phân tử enzyme và enzyme có ít nhất năm miền tiếp xúc với cơ chất, mỗi miền sẽ gắn với một đơn vị monomer của chuỗi polysaccharides trong quá trình xúc tác phản ứng Glu169

và Glu276 nằm trên rãnh dọc theo bề mặt enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình xúc tác

Tâm hoạt động của Mannanase 26A Pseudomonas cellulose được hình thành từ sự

kết hợp của các nhóm chức của các acid amin nằm ở các chuỗi  là 4, 5, 7 và 8 Đó

là Glu212 và Glu320 lần lượt ở cuối chuỗi 4 và cuối chuỗi 7, His211 và Arg208 trên chuỗi 4, Asp283, Tyr285 trên chuỗi 5 và Trp360 trên chuỗi 8 Các acid amin này liên kết với nhau theo liên kết hydro Glutamic 212 liên kết với Aspartic 283 qua các nhóm cacboxyl Nhóm cacboxyl của Glutamic 320 liên kết với nhóm hydroxyl của Tyrosine

285, và nhóm amin của Arginine 208 Trytophan 360 cùng liên kết với Glutamic 320

1.2.2 Tính chất của enzyme Mannanase

Mannanase có nguồn gốc khác nhau có đặc tính khác nhau Nhìn chung, Mannanse

có pH tối ưu tại vùng acid yếu hoặc trung tính Nhiệt độ tối ưu khá cao, độ bền nhiệt tốt Mannanase có kích thước lớn so với xylanase ( trọng lượng phân tử 30-90kDa) và có điểm đẳng điện trong môi trường acid Sản phẩm thuỷ phân chủ yếu từ galactomannan và glucomannan là mannobiose, mannotriose và nhiều loại oligosaccharides hỗn tạp Hiệu suất thuỷ phân phụ thuộc vào mức độ thế và sự phân bố của nhóm thế Tỷ lệ các đơn vị mắt xích glucose/mannose cũng ảnh hưởng tới quá trình thuỷ phân glucomannan Một số Mannanase vừa xúc tác thuỷ phân liên kết 1,4--glycosit giữa các mắt xích đơn vị mannose vừa làm đứt liên kết giữa mắt xích glucose và mannose

1.2.3 Nguồn thu nhận enzyme Mannanase

Nguồn thu Mannanase rất phong phú như :

- Ở động vật : vẹm xanh (Mytilus edulis), sò biển (Littorina brevicula), ốc sên (Helix lucorum)

- Ở thực vật : bã cơm dừa, cà chua, cà độc dược, chà là, thuốc lá

- Hiện nay, nguồn thu Mannanase dồi dào và đang được quan tâm nghiên cứu là từ các vi sinh vật Nhiều công trình nghiên cứu cho kết luận rằng cả vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đều có khả năng sinh tổng hợp Mannanase

- Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp Mannanase là : Aeromonas, Bacillus,

EndoMannanase của vi khuẩn thường được tiết ra ngoài tế bào Song ở một số loài vi

khuẩn như Sporocytophaga myxococoides, Aerobacter mannanolyticus và Xanthomonas campestris cũng tồn tại endo Mannanase nội bào hoặc gắn kết với màng tế bào

- Các chủng nấm mốc gồm : Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Fomes cennosus, Penicillin, Sclerotium, Trichoderma

1.2.4 Các phương pháp thu nhận enzyme Mannanase hiện nay [6], [8],[11]

Về nguyên tắc, có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzyme : phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy bề sâu hay phương pháp nổi và phương pháp chìm

1.2.4.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt người ta sử dụng môi trường lỏng hoặc môi trường đặc

(a) Môi trường lỏng

Ở môi trường lỏng, vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí) Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hoà lại vào dung dịch môi trường Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối vi sinh vật

Hình 1.4 Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay

Phương pháp này thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15

cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tuỳ theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác

Ở đây, người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, vi sinh vật sẽ không có khả năng đồng hoá hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy Nếu chiều cao môi trường lỏng quá thấp thì sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme không cao

(b) Môi trường đặc

Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc Người ta cho vi sinh vật phát triển và bao phủ trên bề mặt các hạt chất dinh dưỡng rắn, đã được làm ẩm, dùng làm môi trường (cám gạo, cám mì, ) Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt của hạt gạo, hạt đậu, đã được hấp chín Nói chung trong tất cả mọi trường hợp, vi sinh vật lấy thức ăn từ những chất chứa trong môi trường và sử dụng oxy phân tử để hô hấp Môi trường để nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn bằng phương pháp bề mặt thường dùng là cám mì, cám gạo, vì trong này có chứa nhiều chất dinh dưỡng nhưng chủ yếu là tạo cho môi trường có được cấu trúc cần thiết ở trong trạng thái ẩm Để tăng hoạt độ của enzyme, người ta còn thêm vào cám những vật liệu có chứa những chất cảm ứng cần thiết Muốn cho cấu trúc của môi trường được tốt hơn, người ta có thể cho thêm trấu, mùn cưa, nhất là khi dùng cám mịn làm môi trường Thông thường những phụ liệu này sẽ làm nghèo môi trường đi, do đó nếu thêm vào nhiều hơn 15-20% thì sẽ làm giảm

Không khí

Sinh khối vi sinh vật

Không khí

Enzyme ngoại bào Dung dịch môi trường

dinh dưỡng trong môi trường bị giảm đi do thêm các phụ liệu thì có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ, phospho cũng như các vật liệu giàu chất hữu cơ quý như malt, nước chiết ngô, dịch khoai tây,

Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% là hợp lý

Hình 1.5 Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường đặc

Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là dễ thực hiện và khi bị nhiễm vi sinh vật lạ ta rất dễ dàng xử lý

(c) Các yếu tố ảnh hưởng đến việc tạo ra enzyme khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt

Tính chất lý hoá của cám, cấu trúc của môi trường cũng có một ý nghĩa nhất định Hàm lượng tinh bột trong cám bị giảm đi thì hoạt độ của enzyme cũng bị giảm

Hàm ẩm của môi trường cũng có một ý nghĩa rất quan trọng Hàm ẩm tối ưu cho môi trường cám là 58-60%

Việc tăng nhiệt độ lên do hô hấp trong thời kỳ phát triển mạnh mẽ cũng có ảnh hưởng đến vi sinh vật

1.2.4.2 Phương pháp nuôi cấy bề sâu

Khác với phương pháp nuôi cấy bề mặt, trong phương pháp nuôi cấy bề sâu người

Hạt môi trường

vi sinh vật

phát triển

bề mặt hạt môi trường

Thành phần dinh dưỡng của môi trường lỏng thích hợp cho mỗi chủng vi sinh vật khác nhau Trong nhiều trường hợp, môi trường để nuôi cấy bề sâu thường chứa tinh bột , các dạng bột và một số vật liệu khác làm nguồn carbon Chỉ một số ít chủng dùng nguồn carbon là các đường dễ đồng hoá như glucose

Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là nước chiết ngô, nước chiết malt, dịch tự phân của nấm men Cần chú ý là khi thêm những vật liệu này phải kiểm tra một cách cẩn thận

vì hỗn hợp acid amin mang vào sẽ tăng sinh tổng hợp các enzyme đường hoá, nhưng có thể không có ảnh hưởng gì tốt đến việc tạo thành các enzyme khác

Thành phần khoáng của môi trường cũng có ý nghĩa lớn đối với việc tân tạo ra các enzyme

Tất cả các cấu tử cần thiết của môi trường được cho vào một thùng đặc biệt sau đó cho nước và hơi vào Môi trường được thanh trùng bằng hơi trực tiếp ở trong các thùng hai vỏ Môi trường được đun nóng đến nhiệt độ nhất định 118-125oC và giữ ở nhiệt độ đó trong thời gian 45-60 phút Môi trường sau khi được làm nguội đến nhiệt độ cần thiết thì người ta cấy giống vào

Vấn đề quan trọng khi nuôi cấy bằng phương pháp bề sâu là sự tiết enzyme vào môi trường trong suốt quá trình phát triển Đa số các enzyme thuỷ phân của nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn là những enzyme ngoại bào và được tiết ra môi trường bên ngoài Do

đó các chế phẩm enzyme có thể thu được từ nước lọc sau khi tách bỏ sinh khối

+ Tác dụng của hệ thống khuấy trộn

Làm xáo trộn môi trường, tế bào vi sinh vật sẽ phân phối đều khắp môi trường, tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào vi sinh vật

Tăng khả năng hoà tan oxy

Tăng nhanh quá trình sinh sản vô tính do tác động cơ học

1.2.4.3 Phương pháp thu nhận các chế phẩm enzyme sạch từ canh trường

bề mặt

Trích ly enzyme bằng phương pháp khuếch tán hiện nay được áp dụng trong nhiều nhà máy để sản xuất các chế phẩm enzyme sạch từ canh trường bề mặt Bằng phương pháp này trích ly được trên 90-95% enzyme Dịch chiết thu được không chứa các tạp chất không hoà tan vì bản thân canh trường bề mặt cũng là vật liệu lọc giữ được các hạt không hoà tan lại

Người ta thường tiến hành khuếch tán enzyme bằng nước ở nhiệt độ 25-28 oC Để tránh nhiễm trùng, người ta thêm vào nước một ít formalin hoặc chất sát trùng khác Dịch chiết rút được thường chứa 10-15% chất khô và tất cả là enzyme của vi sinh vật Dịch chiết thu lại trong bình và được làm lạnh tức khắc xuống nhiệt độ 10-12oC

Điều quan trọng để thu được dung dịch cô đặc là phải gia công ở nhiệt độ tối ưu để cho enzyme bị tổn thương ít nhất, vì đa số enzyme rất nhạy cảm đối với nhiệt Ngoài ra cũng phải tiêu chuẩn hoá dịch cô đặc và phải bảo vệ hoạt độ enzyme lâu dài

Muốn thu được chế phẩm enzyme tinh khiết ở dạng bột khô thì phương pháp phổ biến là kết tủa enzyme từ dùng dịch nước bằng các dung môi hữu cơ : etanol, aceton, isopropanol Để tránh vô hoạt enzyme cần phải kết tủa ở nhiệt độ 3 – 5oC Ngoài ra, khi thêm rượu vào dung dịch enzyme cần phải khuấy đều để san bằng nồng độ rượu một cách nhanh chóng Khi kết tủa xong đem lọc hoặc ly tâm Rửa kết tủa bằng rượu 2-3 lần để tách bớt lượng nước trong kết tủa đi làm cho việc sấy khô dễ dàng Kết tủa sau đó phải

Để tăng hoạt độ của enzyme trong chế phẩm thu được có thể dùng những biện pháp sau :

- Thẩm tích sơ bộ dịch chiết để tách các tạp chất phân tử thấp chứa trong đó

- Tách sơ bộ một phần các tạp chất không hoạt động bằng nồng độ rượu thấp

(40-45oC) khi các enzyme chủ yếu vẫn ở lại trong dung dịch

- Hoà tan kết tủa enzyme với một lượng nước tối thiểu, lọc các tạp chất không hoà tan rồt kết tủa lặp lại bằng rượu có nồng độ như thế

Người ta nhận thấy, nếu thêm vào dịch chiết CaCl2 0.2% sẽ làm cho kết tủa enzyme tốt hơn và cấu trúc của kết tủa cũng tốt hơn

Tóm lại, bằng những biện pháp ở trên, ta sẽ thu được các chế phẩm hoạt động hơn, song chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao, vì trong đó còn chứa nhiều tạp chất, còn protein chỉ mới chiếm 20-30%

1.2.4.4 Phương pháp thu các chế phẩm từ canh trường bề sâu của

vi sinh vật

Nước lọc của canh trường bề sâu thường chứa một lượng chất khô đáng kể, do đó phải cô đặc sơ bộ để giảm chi phí rượu hoặc muối khi muốn sản xuất chế phẩm enzyme dạng khô Nước lọc canh trường, thường được cô đặc bằng cách cho bốc hơi trong nồi chân không ở nhiệt độ thấp ( 25-30oC) để tránh vô hoạt enzyme do nhiệt độ Có thể cô đặc xuống khoảng 4 -10 lần mà hoạt độ enzyme tổn thất không đáng kể Tuy nhiên phương pháp cô đặc hiệu quả hơn cả là cho hấp phụ trên nhựa trao đổi ion hoặc các chất hoạt động bề mặt Với phương pháp này cho phép cô đặc nhiều lần, vì lẽ việc chiết rút enzyme trở lại thường bằng một thể tích bé hơn thể tích ban đầu rất nhiều các phương pháp, người ta có thể tách enzyme ra cũng bằng phương pháp như đối với dịch chiết canh trường bề mặt, nghĩa là có thể kết tủa bằng dung môi hữu cơ, muối trung tính sau đó đem

đi sấy thăng hoa hay sấy phun

Hiệu suất của chế phẩm enzyme canh trường bề sâu sẽ phụ thuộc vào hoạt động của chủng, thành phần của môi trường và điều kiện nuôi cấy

Trong quá trình tách các enzyme ra khỏi canh trường bề sâu, người ta có thể kèm theo những biện pháp khác nữa (tách protein không hoạt động và các tạp chất cao phân tử), để cho các chế phẩm thu được có độ tinh khiết cao hơn

1.2.5 Ứng dụng của enzyme Mannanase [2]

 Trong công nghiệp dược

Trong những năm gần đây, oligosaccharide là mối quan tâm rất lớn Oligosaccharide dị thể như monooligosaccharide (MOS) đóng vai trò quan trọng trong glycoprotein và glycolipid Chúng là thành phần của màng tế bào, tại đó chúng đóng vai trò là các thụ thể nhận biết các vật lạ như virus, vi khuẩn, xâm nhập vào cơ thể

 Trong công nghiệp thực phẩm

Mannanase được sử dụng trong sản xuất cà phê tan và nước quả các loại Trong quá trình sản xuất cà phê tan, dịch cà phê được chiết từ hạt cà phê bao gồm arabinogalactan, mannan và cellulose chiếm đến ½ khối lượng chất khô của hạt cà phê trong đó mannan chiếm đến 20-30% Phần lớn mannan này có mặt trong dịch chiết cà phê Do khối lượng phân tử lớn, mannan làm dịch chiết cà phê rất nhớt, gây khó khăn và tốn năng lượng cho quá trình lọc và sấy phun Việc sử dụng Mannanase trong sản xuất cà phê tan làm giảm độ nhớt của dịch chiết cà phê từ đó làm giảm năng lượng tiêu tốn và hạ giá thành sản phẩm Mặt khác, sản phẩn thuỷ phân mannan là các loại đường và oligosaccharide làm tăng vị tự nhiên của sản phẩm cà phê tan

Trong công nghiệp chế biến các loại rau quả, mannan là thành phần chủ yếu của thành tế bào do vậy làm giảm năng suất lọc và làm tăng hàm lượng cặn trong sản phẩm nước quả trong Việc xử lý dịch quả bằng Mannanase trong quá trình sản xuất làm tăng năng suất lọc, đảm bảo độ trong của dịch quả và tăng hiệu suất thu hồi quả

Mannanase cũng được sử dụng trong dầu dừa tinh khiết làm tăng hiệu suất và chất lượng dầu dừa

 Trong khai thác dầu mỏ và khí đốt

Một loại dịch có độ nhớt cao thường được cấp vào đầu mũi khoan Dịch này chứa các hạt nhỏ có nhiệm vụ lấp đầy các kẽ nứt xuất hiện do áp suất thủy tĩnh, giữ cho mũi khoan không bị gãy dưới tác dụng của áp suất lớn Các chất có độ nhớt cao thường được

sử dụng là galactomannan Để dầu và khí đốt có thể ra khỏi giếng, độ nhớt này phải được loại bỏ hoặc làm giảm bằng cách oxy hóa hoặc thủy phân bằng enzyme Dịch có độ nhớt thấp này sau đó được bơm ra trước khi quá trình dẫn dầu và khí đốt bắt đầu Mannanase được sử dụng để giảm độ nhớt của dịch này

 Trong xử lý môi trường và sản xuất thức ăn gia súc

Các phế phụ phẩm cuả công nghiệp sản xuất cà phê, quả còn chứa rất nhiều mannan

là nguồn gốc rất tốt cho sản xuất Mannanase thương mại

Mannanase đã được sản xuất thành các chế phẩm thương mại nhằm bổ sung vào phế thải công nghiệp như vỏ đậu tương, bã cơm dừa, thịt quả cọ, thịt quả vừng làm thức ăn giá sức Ví dụ chế phẩm Hemicell của ChemGen Corporation (Mỹ) được thêm vào thức ăn gia súc làm hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng lượng sữa đối với bò, giảm lượng mỡ trong lợn, tăng số lượng và chất lượng trứng gà

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm

- Tại phòng Nghiên Cứu Dinh Dưỡng Chăn Nuôi

Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam

Toạ lạc ở : số 121 Nguyễn Bỉnh Khiêm Quận 1 Tp Hồ Chí Minh

- Thời gian : Từ 21/09/2009 đến 15/01/2010

2.2 Nội dung nghiên cứu :

- Khảo sát các yếu tố tối ưu : thời gian, môi trường, độ ẩm

- Xác định hoạt tính enzyme Mannanase

- Thu nhận enzyme Mannanase dạng thô

2.3 Vật liệu thí nghiệm

2.3.1 Đối tượng thí nghiệm

Chủng Bacillus subtilis do Viện Công Nghệ Sinh Học cung cấp

2.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm

Nước cất 1000mL Môi trường được hấp khử trùng ở 121OC áp suất 1 atm, trong 15 phút

b) Môi trường tăng sinh : môi trường Nutrient Broth (NB)

Pepton 5g Cao thịt 3g

c) Môi trường lên men : gồm có 6 môi trường trong đó có 3 môi trường lỏng và

3 môi trường rắn

- Môi trường lỏng được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút

- Môi trường rắn được hấp khử trùng ở 121OC trong 90 phút Chia làm 2 lần hấp Lần đầu hấp 60 phút, sau đó ở nhiệt độ phòng qua đêm rồi đem đi hấp tiếp trong 30 phút + Môi trường lỏng thứ nhất (L1) : môi trường bột cá 4%

+ Môi trường rắn thứ hai (R2) :

- Dàn đều dịch vi khuẩn và hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn tạo vết bôi

- Nhuộm tiêu bản bằng tím tinh thể trong 1 phút

- Nhuộm lugol trong 1 phút

- Rửa nước cất

- Tẩy bằng cồn 96o cho sạch

- Rửa nước

- Làm khô và quan sát dưới vật kính nhúng dầu

2.3.4.2 Tiến hành hoạt hoá và tăng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis

+ Hoạt hoá vi khuẩn Bacillus subtilis

- Môi trường thạch NA được hấp ở 121oC trong 15 phút

- Giống Bacillus subtilis được cung cấp bởi Viện Công Nghệ Sinh Học

- Lấy 1 ít sinh khối từ ống giống cấy ria lên thạch đĩa NA Sau đó ủ ở 37oC trong

24 giờ

+ Tăng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis

- Môi trường lỏng NB chứa bình erlen được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút

- Dùng que cấy vòng chạm lấy 1 ít sinh khối của Bacillus subtilis sau đó cấy vào

môi trường lỏng NB

- Tiến hành nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ

- Xác định mật độ vi khuẩn trong dịch tăng sinh bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường NA theo phương pháp cấy gạt

2.3.4.3 Phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis trong môi trường lỏng

- Chuẩn bị môi trường : Môi trường lên men lỏng được chứa trong các erlen

250ml được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút

- Chuẩn bị nguồn giống : Giống Bacillus subtilis được hoạt hoá trên môi trường

NA sau đó tăng sinh trên môi trường NB Ta dùng micropipet lấy 1 lượng dịch tăng sinh

là 5% (với mật độ vi khuẩn đạt 108 – 109 CFU/ml) so với thể tích môi trường lên men cấy vào môi trường lên men lỏng đã chuẩn bị Tiếp theo, ta cho 1% methanol vào

- Nuôi cấy : Môi trường lên men sau khi cho giống vào được đưa ngay lập tức

vào máy lắc, thực hiện chế độ lắc liên tục ở nhiệt độ phòng với tốc độ lắc là 220 vòng/ phút Tính từ thời điểm cho giống vào, sau mỗi 24 giờ lên men, ta tiếp 1% methanol vào

- Tách chiết dịch enzyme : Sau khi thu dịch lên men, ta tiến hành ly tâm loại bỏ

kết tủa, thu dịch chiết Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc để loại bỏ hết cặn Chế phẩm enzyme lúc này được đem đi xác định hoạt tính enzyme Mannanase

2.3.4.4 Phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis trong môi trường rắn

- Chuẩn bị môi trường : Môi trường lên men rắn được chứa trong các bịch

nylon (PE) sau đó được hấp khử trùng ở 121OC trong 90 phút Ta chia quá trình hấp khử trùng làm 2 lần hấp Lần đầu ta hấp khử trùng ở 121OC trong 60 phút, sau đó bịch môi trường lên men được lấy ra khỏi nồi hấp và đưa vào phòng cấy để ở nhiệt độ phòng qua đêm Tiếp theo, bịch môi trường lên men rắn được đem đi hấp khử trùng lần hai ở 121OC trong 30 phút để đảm bảo tối ưu điều kiện vô trùng

- Chuẩn bị nguồn giống : Giống Bacillus subtilis được hoạt hoá trên môi trường

NA sau đó tăng sinh trên môi trường NB Ta dùng micropipet lấy 1 lượng dịch tăng sinh

là 5% (với mật độ vi khuẩn đạt 108 – 109 CFU/ml) so với khối lượng môi trường lên men cấy vào môi trường lên men rắn đã chuẩn bị Tiếp theo, ta cho 1% methanol vào

- Nuôi cấy : Bịch môi trường lên men rắn sau khi đã cho giống vào được lắc trộn

đều để tạo điều kiện cho giống tiếp xúc đều với môi trường lên men rắn Sau đó bịch môi trường lên men rắn được ủ ở nhiệt độ phòng Tính từ thời điểm cho giống vào, sau mỗi 24 giờ lên men, ta tiếp 1% methanol vào môi trường lên men rắn, và lắc bịch để trộn đều môi trường, giống và methanol Tới một thời điểm nhất định, ta tiến hành thu chế phẩm enzyme

- Thu chế phẩm enzyme bằng cách : Các thao tác được tiến hành ở điều kiện vô

trùng, môi trường lên men có chứa enzyme được đổ ra khay, sấy ở 40oC cho khô Sau đó đem đi xác định hoạt tính enzyme Mannanase Sau khi sấy, chế phẩm enzyme Mannanase được nghiền mịn và đóng gói

2.3.4.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme Mannanase

 Dựng đường chuẩn Mannose

Dựa vào phương pháp xác định hàm lượng đường khử (phương pháp Miller)

a) Nguyên tắc :

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa lượng đường khử với thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử Dựa theo đồ thị đường chuẩn của mannose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử mannose của mẫu nghiên cứu

nước Vẽ đường chuẩn mannose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ Mannose chuẩn

 Tiến hành xác định hoạt tính enzyme Mannanase

a) Nguyên tắc

Để xác định hoạt tính enzyme Mannanase, chúng tôi sử dụng guargum làm cơ chất

Hệ enzyme Mannnanase sẽ tác dụng lên guargum, phóng thích các phân tử mannose và các oligosaccharide mạch ngắn, dựa vào hàm lượng mannose, xác định hoạt tính hệ enzyme Mannanase

c) Cách tiến hành

Hỗn hợp phản ứng gồm : 1 ml dịch chiết enzyme, 1 ml dung dịch cơ chất, 3 ml dung dịch đệm Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau thời gian ủ, lấy 0.5ml dịch hỗn hợp đem xác định lượng Mannose tạo thành

d) Kết quả

Đơn vị hoạt tính của enzyme Mannanase được xác định như sau : một đơn vị hoạt

Đvht/g = (x*L*5*1000)/(m*t*180) = x*L*50/9 (UI)

Với :

x : hàm lượng (mg) mannose suy ra từ đường chuẩn

L : độ pha loãng mẫu enzyme

5 : thể tích (ml) hổn hợp thuỷ phân

t : thời gian (phút)

m : khối lượng mẫu (g)

2.3.4.6 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng sinh

tổng hợp enzyme Mannanase của Bacillus subtilis

- Chuẩn bị môi trường : Ta chuẩn bị ba môi trường lỏng (L1; L2; L3) vô trùng

tương tự như đã trình bày trong phần chuẩn bị môi trường lên men lỏng ở mục 2.3.4.3 và

ba môi trường rắn (R1, R2, R3) có độ ẩm 65% vô trùng tương tự như đã trình bày trong

phần chuẩn bị môi trường lên men rắn ở mục 2.3.4.4

- Chuẩn bị nguồn giống : Giống Bacillus subtilis được hoạt hoá trên môi trường

NA sau đó tăng sinh trên môi trường NB Ta dùng micropipet lấy 1 lượng dịch tăng sinh

là 5% (với mật độ vi khuẩn đạt 108 – 109 CFU/ml) so với thể tích môi trường lên men (đối với môi trường lên men lỏng) và 5% so với khối lượng môi trường lên men (đối với môi trường lên men rắn), tiến hành cấy vào các môi trường lên men đã chuẩn bị Tiếp theo, ta cho 1% methanol vào

- Nuôi cấy :

o Đối với môi trường lên men lỏng : Môi trường lên men lỏng sau khi cho

giống vào được đưa ngay lập tức vào máy lắc, thực hiện chế độ lắc liên tục ở nhiệt độ phòng với tốc độ lắc là 220 vòng/ phút Tính từ thời điểm cho giống vào, sau mỗi 24 giờ

lên men, ta tiếp 1% methanol vào môi trường lên men lỏng

o Đối với môi trường lên men rắn : Bịch môi trường lên men rắn sau khi đã

cho giống vào được lắc trộn đều để tạo điều kiện cho giống tiếp xúc đều với môi trường