Khảo Sát Khả Năng Thay Thế Chất Điều Hòa Sinh Trưởng Của Oligochitosan Trên Hai Môi Trưởng MURASHIGE & SKOOG

52 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng của Oligochitosan có khối lượng phân tử 3,5 KDa được bổ sung vào môi trường MS lên khả năng tạo chồi ở các nồng độ khác nhau trong nuôi c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

************

Giảng viên hướng dẫn:

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THAY THẾ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG CỦA OLIGOCHITOSAN TRÊN HAI MÔI TRƯỞNG MURASHIGE & SKOOG VÀ

KNUDSON C TRONG NUÔI CẤY INVITRO LAN

DENDROBIUM THONGCHAI GOLD

Th.S LÊ THỊ MỸ PHƯỚC

MỤC LỤC

MỤC LỤC

TRANG Trang tựa Lời cảm ơn Mục lục i

Danh sách các chữ viết tắt v

Danh sách các hình vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các biểu đồ viii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH 2

1.3 YÊU CẦU 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 SƠ LƯỢC VỀ CHITIN, CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN 3

2.1.1 Giới thiệu chung về Chitin, Chitosan và Oligochitosan 3

2.1.1.1 Chitin 3

2.1.1.2 Chitosan 6

2.1.1.3 Oligochitosan 9

2.1.2 Nguồn của Chitin, Chitosan, Oligochitosan 9

2.1.3 Phương pháp chế tạo Chitin, Chitosan, Oligochitosan 10

2.1.3.1 Phương pháp chế tạo Chitin 10

2.1.3.2 Phương pháp chế tạo Chitosan 11

2.1.3.3 Phương pháp chế tạo Oligochitosan 12

2.1.4 Ứng dụng của Chitin, Chitosan, Oligochitosan 17

2.1.4.1 Ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và công nghệ sinh học 17

2.1.4.2 Tác nhân cationic trong xử lý nước 19

2.1.4.3 Chitosan dùng trong y học 19

2.2 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ LAN DENDROBIUM THONGCHAI GOLD 21 2.2.1 Giới thiệu họ lan 21

2.2.1.1 Đặc điểm chung 21

2.2.1.2 Đặc điểm về phân loại 23

2.2.2 Giới thiệu về Dendrobium thongchai gold 25

2.2.2.1 Vị trí phân loại 25

2.2.2.2 Nguồn gốc và sự phân bố 25

2.2.2.3 Phân loại 25

2.2.2.4 Đặc điểm về hình thái 26

2.2.2.5 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium sp 28

2.2.2.6 Giá trị kinh tế 31

2.2.2.7 Giới thiệu về lan Dendrobium thongchai gold 31

2.3 SƠ LƯỢC VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO 34

2.3.1 Sơ lược về các phương pháp nhân giống truyền thống 31

2.3.2 Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô thực vật 34

2.3.3 Mục đích và ứng dụng thực tiễn 36

2.3.3.1 Mục đích 36

2.3.3.2 Ứng dụng thực tiễn 37

2.3.4 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô thực vật 38

2.3.4.1 Ý nghĩa sinh học căn bản 38

2.3.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 38

2.3.5 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 39

2.3.5.1 Nước 39

2.3.5.2 Agar 39

2.3.5.3 Nguồn carbon 40

2.3.5.4 Chất khoáng 40

2.3.5.5 Vitamin 41

2.3.5.6 Các chất điều hòa sinh trưởng 41

2.3.5.7 Chất trích từ cây trồng 42

2.3.5.8 Amino acid 42

2.3.5.9 Than hoạt tính 42

2.3.6 Những vấn đề trong nhân giống in vitro 43

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 44

3.1.1 Địa điểm 44

3.1.2 Thời gian 44

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 44

3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 44

3.3.1 Mẫu cấy mô thực vật 44

3.3.2 Mẫu Oligochitosan 46

3.3.3 Dụng cụ thí nghiệm 46

3.3.4 Môi trường nuôi cấy mô thực vật 46

3.4 ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM 47

3.5 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 47 3.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tạo chồi trên môi trường MS bổ sung

OligoChitosan có Mw ~ 3,5 kDa ở các nồng độ khác nhau trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 47 3.5.2 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tạo chồi trên môi trường KC bổ sung OligoChitosan có Mw ~ 3,5 kDa ở các nồng độ khác nhau trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 48

3.5.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng tạo chồi trên môi trường MS bổ sung

OligoChitosan có Mw ~ 7,5 ở các nồng độ khác nhau trong nuôi cấy in vitro lan

Dendrobium 49 3.5.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng tạo chồi trên môi trường KC bổ sung

OligoChitosan có Mw ~ 7,5 kDa ở các nồng độ khác nhau trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 50

3.6 XỬ LÝ THỐNG KÊ 52

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ảnh hưởng của Oligochitosan có khối lượng phân tử 3,5 KDa được bổ sung vào môi trường MS lên khả năng tạo chồi ở các nồng độ khác nhau trong nuôi

cấy in vitro lan Dendrobium 53

4.2 Ảnh hưởng của Oligochitosan có khối lượng phân tử 3,5 KDa được bổ sung vào môi trường KC lên khả năng tạo chồi ở các nồng độ khác nhau trong nuôi

cấy in vitro lan Dendrobium 59

4.3 So sánh hiệu ứng kích của Oligochitosan có cùng khối lượng phân tử Mw

~3,5 KDa lên khả năng tạo chồi trên hai môi trường khác nhau 64

4.4 So sánh hiệu ứng kích thích chiều cao chồi của hai loại môi trường MS và

KC khi bổ sung Oligochitosan (Mw~3,5) vào môi trường nuôi cấy in vitro lan

Dendrobium 65

4.5 Ảnh hưởng của Oligochitosan có khối lượng phân tử 7,5 KDa được bổ sung vào môi trường MS lên khả năng tạo chồi ở các nồng độ khác nhau trong nuôi

cấy in vitro lan Dendrobium 67

4.6 Ảnh hưởng của Oligochitosan có khối lượng phân tử 7,5 KDa được bổ sung vào môi trường KC lên khả năng tạo chồi ở các nồng độ khác nhau trong nuôi

cấy in vitro lan Dendrobium 72

4.7 So sánh hiệu ứng kích của Oligochitosan có cùng khối lượng phân tử Mw

~7,5 KDa lên khả năng tạo chồi trên hai môi trường khác nhau 77

4.8 So sánh hiệu ứng kích thích chiều cao chồi của hai loại môi trường MS và

KC khi bổ sung Oligochitosan (Mw~7,5) vào môi trường nuôi cấy in vitro lan

Dendrobium 78

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1 KẾT LUẬN 79

5.2 KIẾN NGHỊ 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

PHỤ LỤC 84

EDTA : Ethylene diamin-tetra-acetic acid

Chất điều hoà tăng trưởng

BA : 6-benzyl adenin

GA3 : Gibberellin

IAA : Indole-3-acetic acid

NAA : Naptalen Acetic Acid

2,4 D : Acid 2,4 – Dichlorophenoxy Acetic

Môi trường

MS : Murashige và Skoog (1962)

KC : Knudson C

DANH MỤC HÌNH

HÌNH

TRANG Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của chitin 4

Hình 2.2 Chitin và vỏ tôm 5

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử của chitosan 6

Hình 2.4 Một số giống hoa đẹp của họ Orchidaceae 24

Hình 2.5 Lan Dendrobium thongchaigold 24

Hình 2.6 Một số dạng hoa đẹp của Dendrobium 33

Hình 2.7 Tổng quan về lan Dendrobium 33

Hình 3.1 Chồi Lan Dendrobium được sử dụng ở các thí nghiệm 45

Hình 4.1 Một số hình ảnh thu được từ các nghiệm thức đối với Oligochitosan(Mw~3,5 KDa) , môi trường MS 58

Hình 4.2 Một số hình ảnh thu được từ các nghiệm thức đối với Oligochitosan(Mw~3,5 KDa) , môi trường KC 63

Hình 4.3 Một số hình ảnh thu được từ các nghiệm thức đối với Oligochitosan(Mw~7,5 KDa) , môi trường MS 71

Hình 4.4 Một số hình ảnh thu được từ các nghiệm thức đối với Oligochitosan (Mw~7,5 KDa) , môi trường KC 76

Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng của các nồng độ Oligochitosan có khối lượng phân tử

3,5 KDa lên khả năng tạo chồi (a) và chiều cao chồi (b) trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium trên môi trường MS 54

Biểu Đồ 4.2 Ảnh hưởng của các nồng độ Oligochitosan có khối lượng phân tử

3,5 KDa lên khả năng tạo chồi (a) và chiều cao chồi (b) trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium trên môi trường KC 60

Biểu đồ 4.3 Sự gia tăng chồi của hai loại môi trường MS và KC khi bổ sung

Oligochitosan ( Mw~3,5 KDa) vào môi trường vào môi trường nuôi cấy in vitro lan Dendrobium ở những nồng độ khác nhau 64

Biểu đồ 4.4 Sự gia tăng chiều cao chồi của hai loại môi trường MS và KC khi

bổ sung Oligochitosan ( Mw~3,5 KDa) vào môi trường vào môi trường nuôi cấy

in vitro lan Dendrobium ở những nồng độ khác nhau 66

Biểu Đồ 4.5 Ảnh hưởng của các nồng độ Oligochitosan có khối lượng phân tử

7,5 KDa lên khả năng tạo chồi (a) và chiều cao chồi (b) trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium trên môi trường MS 68

Biểu Đồ 4.6 Ảnh hưởng của các nồng độ Oligochitosan có khối lượng phân tử

7,5 KDa lên khả năng tạo chồi (a) và chiều cao chồi (b) trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium trên môi trường KC 73

Biểu đồ 4.7 Sự gia tăng chồi của hai loại môi trường MS và KC khi bổ sung

Oligochitosan ( Mw~7,5 KDa) vào môi trường vào môi trường nuôi cấy in vitro lan Dendrobium ở những nồng độ khác nhau 77

Biểu đồ 4.8 Sự gia tăng chiều cao chồi của hai loại môi trường MS và KC khi

bổ sung Oligochitosan (Mw~7,5 KDa) vào môi trường vào môi trường nuôi cấy

in vitro lan Dendrobium ở những nồng độ khác nhau 78

KDa được bổ sung vào môi trường ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo

chồi trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 48

Bảng 3.2 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của Oligochitosan có Mw ~ 3,5

KDa được bổ sung vào môi trường ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo

chồi trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 49

Bảng 3.3 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của Oligochitosan có Mw ~ 7,5

KDa được bổ sung vào môi trường ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo

chồi trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 50

Bảng 3.4 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của Oligochitosan có Mw ~ 7,5

KDa được bổ sung vào môi trường ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo

chồi trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 51

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của Oligochitosan có Mw ~ 3,5 kDa được bổ sung vào

môi trường MS ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo chồi trong nuôi cấy in

vitro lan Dendrobium 53

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của Oligochitosan có Mw ~ 3,5 KDa được bổ sung vào

môi trường KC ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo chồi trong nuôi cấy in

vitro lan Dendrobium 59

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của Oligochitosan có Mw ~ 7,5 KDa được bổ sung vào

môi trường MS ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo chồi trong nuôi cấy in

vitro lan Dendrobium 67

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của Oligochitosan có Mw ~7,5 KDa được bổ sung vào

môi trường KC ở các nồng đồ khác nhau lên khả năng tạo chồi trong nuôi cấy in

vitro lan Dendrobium 72

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

như: Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Mokara, Vanda, Dendrobium… chúng

đều cho hoa rất đẹp và mang nhiều màu sắc khác nhau Nó có thể dùng để trang trí, trưng bày, làm đẹp, dùng trong các buổi lễ… hay người ta có thể bán hoa cắt

cành - kinh doanh Trong số đó có lẽ Dendrobium là giống đặc sắc nhất từ màu sắc, dạng hoa cho đến giống loài Mặt khác, Dendrobium cũng rất dễ trồng, rất

siêng hoa và lâu tàn Do đó nó rất được ưa chuộng và được trồng phổ biến nhất nước ta hiện nay nhằm phục vụ cho nhu cầu cuộc sống

Ngày nay, việc nhân giống cây trồng in vitro đã không còn xa lạ nữa Với

những đóng góp vào nhiều thành tựu to lớn trong lĩnh vực nhân giống cây trồng,

có thể nói đây là phương pháp tốt nhất và hiệu quả nhất hiện nay để nhân giống thực vật Bằng phương pháp này chúng ta có thể tạo ra nhiều cây giống với thời gian rất ngắn, trong đó đa phần các giống lan thương phẩm đều được nhân giống

bằng phương pháp nuôi cấy mô Trước đây, người ta thường dùng môi trường dinh dưỡng có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng để nuôi cấy in vitro tế bào

thực vật Tuy nhiên, hiện nay các chất điều hòa sinh trưởng này vẫn còn rất đắt

tiền Việc nghiên cứu bổ sung các chất mới vào môi trường nhằm làm tăng tính kích thích tăng trưởng, giảm thời gian nuôi cấy và giảm chi phí nuôi cấy mô cũng

là một vấn đề đáng quan tâm

Từ lâu Oligosacharide nói chung và Oligochitosan nói riêng được biết đến bởi rất nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như nông nghiệp, lâm nghiệp, y học… Một trong những ứng dụng được nghiên cứu gần đây là khả năng kích thích sự sinh trưởng và phát triển mô thực vật Nhiều nghiên cứu đã chứng minh Oligochitosan đóng vai trò như là một chất có khả năng kích thích sự hấp thu các chất dinh dưỡng của mô thực vật, đồng thời còn có tác dụng gia tăng hiệu ứng phytoalexin của mô cây giúp cho cây không chỉ tăng trưởng nhanh mà còn kháng lại một số loại bệnh do vi sinh vật gây nên Hơn nữa, nguồn chế biến Oligochitosan hiện nay rất dễ tìm và rẻ tiền vì là sản phẩm phế liệu của ngành thủy sản

Từ những vấn đề đã đặt ra, chúng tôi tiến hành thực hiện thử nghiệm đề tài:

“Khảo sát khả năng thay thế chất điều hòa sinh trưởng của Oligochitosan trên hai

môi trường Murashige & Skoog (MS) và Knudson C (KC) trong nuôi cấy in vitro lan Dendrobium thongchai gold”

1.2 MỤC ĐÍCH

Nuôi cấy mô cây lan Dendrobium thongchai gold để tạo nguồn nguyên liệu

phục vụ cho nghiên cứu và sản xuất

Xác định ảnh hưởng của Oligochitosan trong nuôi cấy in vitro lan

Dendrobium thongchai gold trên hai môi trường khác nhau

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 SƠ LƯỢC VỀ CHITIN, CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN

2.1.1 Giới thiệu chung về Chitin, Chitosan và Oligochitosan

2.1.1.1 Chitin

Giống như cellulose, chitin là một glycan chứa liên kết (1-4), nhưng được cấu tạo bởi các đơn vị 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose, hay còn gọi là các đơn vị N-acetylglucosamine Chitin là một polymer tự nhiên nhiều thứ hai sau cellulose Các phân tử chitin sau khi tổng hợp liên kết với nhau bằng liên kết hydrogen giữa các nhóm –NH- trong phân tử này với các nhóm C=O của mạch lân cận Chitin

có 3 dạng là: α, β, γ – chitin Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch (Sydney, London, 1965)

Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ-chitin được mô tả như sau:

α - Chitin β - Chitin γ – Chitin

α - chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên

β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - chitin) và hai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro Dạng γ - chitin cũng có thể chuyển sang dạng α - chitin nhờ quá trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn

Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay acid HCl đậm đặc thì ngườ ta nhận thấy rằng chitin có cấu trúc là một polymer đươc tạo thành từ các đơn vị N-Acetyl- β-D- Glucosamin liện kết với nhau bỡi liên kết β-(1-4) glucoside

Chitin có mật độ liên kết hydrogen cao khi ở trạng thái rắn vì vậy hoàn toàn không tan trong nước, trong hầu hết các dung môi hữu cơ, các acid loãng và dung dịch kiềm đặc Nhưng lại tan trong acid formic và trong dung dịch đặc của một

số muối

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của chitin

Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hoặc dạng bột, không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, acid loãng

và các dung môi hữu cơ như eter, rượu… nhưng tan trong dung dịch đặc nóng của muối thiocyanate liti (LiSCN) và thiocyanate canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo, tan được trong hệ dimetylacetamid – LiCl 8% (Phạm Lê Dũng và ctv, 1997), tan trong hexafluoro-isopropy alcohol (CF3CHOHCH3) và hexafluoracetonesesquihydrata (CF3COCF3H2O) (Kim.S.S và ctv, 1996) Chitin

có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại có bước sóng 884 – 890 cm-1

Chitin ổn định với các chất oxy hóa mạnh như thuốc tím (KMnO4); oxy già (H2O2); nước javel (NaOCl – NaCl)…, lợi dụng tính chất này mà người ta sử dụng các chất oxy hóa trên để khử màu cho chitin

Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%), ở nhiệt độ cao

thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan

- CH2OH -CH2OH

- NHCOCH3 - NH2

Khi đun nóng trong acid HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt

mạch thu được glucosamin:

- CH2OH -CH2OH

- NHCOCH3 - NH2

Phản ứng este hóa :

- Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat

- Chitin tác dụng với anhydrit sulfuric trong pyrydin, dioxan và N,N -

dimetylanilin cho sản phẩm chitin sulfonat

2.1.1.2 Chitosan

Chitosan là một polymer tự nhiên được hình thành từ N-deacetyl chitin, mang điện tích dương, không có độc tính, có khả năng phân hủy sinh học, và tương hợp sinh học Chitosan có cấu tạo từ các đơn vị glucosamine, hay các 2-amino-2-deoxy-D-glucose liên kết với nhau bởi nối (1-4) glucoside

Thuật ngữ chitosan được dùng khi hàm lượng Nitơ cao hơn 7% khối lượng phân tử hay khi độ deacetyl cao hơn 60% Sự khác biệt cơ bản của chitin và chitosan là khả năng hòa tan của chúng trong dung dịch acid loãng, chitosan hòa tan nhiều trong các dung dịch còn chitin hầu như không tan

 Tính chất và cấu tạo hóa họa của chitosan:

Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế

Chitosan là dẫn xuất N - deacetyl hóa của chitin Uridin - diphosphat - N - acetyl - D - glucosamin được polymer hóa thành chitin nhờ enzyme synthetase, chitin N - deacetylase xúc tác cho phản ứng N - deacetyl hóa chitin thành chitosan Chitinase và lysozyme xúc tác phản ứng thủy phân chitosan tạo thành oligosaccharide tương ứng Những enzyme này có nhiều trong mô thực vật, động vật, côn trùng, và các vi sinh vật trong đất, thủy quyển và sinh quyển

Tên hóa học của Chitosan là poly - β - (1  4) - D - glucosamin Hay còn gọi là poly - β - (1 - 4) - 2 - amino - 2 - desoxy - D – glucosamin

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử chitosan

Công thức phân tử: [C6H11O4N]n

Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

Qua cấu trúc của chitin - chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH2, do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách

và phân tích chúng rất phức tạp

Chitin tan trong dung dịch acid HCl 12N hoặc tan trong dung dịch LiCl/dimetylacetamide, chitosan hoàn tan trong dung dịch acid yếu CH3COOH Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C(2)

Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N -acetyl -D - glucosamin và nhóm -OH, nhóm -NH2 trong các mắt xích

D - glucosamin có nghĩa chúng vừa là alcol, vừa là amin, vừa là amid Các nhóm chức này có khả năng phản ứng để tạo ra các dẫn xuất khác nhau của chitosan Chitosan là polymer mà các monomer được nối với nhau bới các liên kết β - (1 - 4) - glucoside, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hóa học như: acid, bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzyme thủy phân

 Tính chất lý hoá của chitosan

Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc vảy,

không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 – 3110C Trọng lượng phân tử chitosan phụ thuộc vào điều kiện sản xuất thường nằm trong khoảng 10.000 – 1.000.000 Daltons

Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hòa tan được trong dung dịch acid hữu cơ loãng như acid acetic, acid fomic, acid lactic… tạo thành dung dịch keo trong suốt Chitosan hòa tan trong dung dịch acetic 1-1,5% Độ nhớt của chitosan trong dung dịch acid loãng liên quan đến kích thước

và khối lượng trung bình của chitosan đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme ( Nguyễn Thị Huệ và Bùi Thị Huyền, 2005) Chitosan kết hợp với aldehyd trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzyme Chitosan phản ứng với acid đậm đặc, tạo muối khó tan Chitosan tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím

 Tính chất sinh học của chitosan

Chitosan không độc, dùng an toàn cho người Chúng có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học

Chitosan có nhiều tác dụng đa sinh học như: tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u.( Mosbay.M.và Deral.T Pat, 1998)

Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, hạ huyết áp, chống rối loạn nội tiết ( Jing S B và ctv, 1997)

Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptid – insulin, kích thích việc tiết

ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan được dùng để điều trị bệnh tiểu đường Nhiều công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển của tế bào u, ung thư, HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa… của chitosan ( Yao Kangde và ctv, 1999)

 Độc tính của chitosan

Vào năm 1968, K Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không độc, chỉ số LD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và người

Nghiên cứu tiêm chitosan theo đường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả đã kết luận: chitosan là vật liệu hoà hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà còn sử dụng an toàn trong ghép mô (Shigehiro Hirano và ctv, 1990)

Dùng chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch, không thấy có tích luỹ ở gan Loại chitosan có DD ≈ 50%, có khả năng phân huỷ sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách Nhiều tác giả đã chỉ rõ những lợi điểm của chitosan: tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học không những đối với

động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm mau liền vết thương ( Inui Hiroshi Appl Biol Sci, 1997)

2.1.1.3 Oligochitosan

Oligochitosan là một phân đoạn có phân tử lượng trung bình nhỏ hơn 20 KDa và độ polymer hóa dp < 100 Trong đó phần Oligomer tan trong môi trường trung tính có phân tử lượng nhỏ hơn 5 KDa

Oligochitosan là đoạn mạch polymer của -D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 glucoside

2.1.2 Nguồn gốc của chitin, chitosan, oligochitosan

Chitin - chitosan là một polysacharide tồn tại trong tự nhiên với sản lượng

rất lớn (đứng thứ hai sau cellulose) Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật

Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một

số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong động vật bậc cao monomer của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô

da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da Trong thực vật chitin

có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo (Đặng Văn Luyến, 1995)

Hàm lượng chitin trong các loài giáp xác vào khoảng từ 2 - 12% trọng lượng

cơ thể Hàm lượng chitin trong vỏ thay đổi phụ thuộc vào quy trình điều chế, mùa thu hoạch, độ tuổi, chế độ môi trường dinh dưỡng của loài giáp xác Thông thường vỏ của các loài giáp xác như tôm, cua, chứa khoảng 13% - 42% chitin

Mai mực cũng là một nguồn cung cấp chitin được chú ý Nguồn chitin thu

được từ mai mực hàng năm vào khoảng 0,7 triệu tấn Vì thông thường vỏ chitin được chế tạo từ vỏ giáp xác thì phải xử lý bằng acid để loại khoáng, calcium nhưng đối với mai mực thì hàm lượng khoáng và calcium ít hơn và trong nhiều trường hợp có thể bỏ qua bước loại khoáng Sự thay đổi này trong quy trình điều chế chitin làm hạ chi phí sản xuất cũng như giảm sự thủy phân acid của chitin trong suốt quá trình điều chế Do đó, chitin được chiết xuất từ mai mực sẽ có chất lượng tốt hơn chitin được chiết từ vỏ các loài giáp xác

Chitin - chitosan là polysacharide có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharide (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucoside và hình thành một mạng các sợi có tổ chức Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác

2.1.3 Phương pháp chế tạo Chitin, Chitosan và Oligochitosan

2.1.3.1 Phương pháp chế tạo Chitin

Hiện nay có rất nhiều quy trình khác nhau được áp dụng để sản xuất chitin

Các phương pháp này phải đạt yêu cầu loại bỏ hiệu quả các thành phần khác, và nếu có thể thì sử dụng luôn các thành phần đó cho những mục đích khác Thông thường việc cô lập chitin bao gồm khử khoáng, loại protein và tẩy trắng (J.Synowiecki, 2003)

Việc khử khoáng có thể đạt được sau 1 giờ đến 3 giờ chiết suất bằng dung dịch acid HCl loãng nồng độ từ 1% đến 8% ở nhiệt độ phòng Sự khử khoáng có thể thực hiện hoàn toàn khi lượng acid sử dụng lớn hơn hàm lượng khoáng Để tránh xảy ra sự cắt mạch của chitin người ta có thể dùng ethylene diamin-tetra-acetic acid (EDTA) để loại khoáng (J.Synowiecki, 2003) Để hàm lượng khoáng còn lại ít có thể kéo dài thời gian phản ứng lên đến 24 giờ song điều đó cũng gây nên sự cắt mạch chitin

Việc loại protein được thực hiện với dung dịch NaOH hoặc KOH Hiệu quả của việc khử protein bằng kiềm phụ thuộc vào nhiệt độ phản ứng, nồng độ kiềm,

và tỉ lệ dung dịch kiềm với lượng vỏ giáp xác Thông thường, khoảng nồng độ của dung dịch kiềm là từ 1% - 10%, nhiệt độ từ 650C đến 1000C Hầu như tất cả protein chứa trong vỏ tôm và cua được loại bỏ hết khi sử dụng nhiệt độ 900C và tỉ

lệ khối lượng vỏ đối với dung dịch là 1/20 (khối lượng/thể tích) Khoảng thời gian phản ứng từ 0.5 giờ đến 6 giờ Kéo dài thời gian sẽ dẫn đến sự cắt mạch và deacetyl hóa polysaccharide Người ta cũng có thể dùng enzyme để loại các protein từ vỏ các loài giáp xác Hiện nay enzyme thương mại alacalase có thể thu được chitin chỉ chứa khoảng 4,5% tạp chất protein (J.Synowiecki, 2003) Tuy

nhiên chitin được dùng để sản xuất chitosan, thì lượng protein còn lại có thể được loại bỏ dễ dàng trong khi xử lý kiềm ở quá trình điều chế tiếp theo

Việc loại các chất còn lại trong chitin có thể được làm bằng cách chiết xuất ở nhiệt độ phòng với acetone, chloroform, ethyl acetate hay cồn và hỗn hợp ether Việc tẩy trắng thường được thực hiện bằng việc xử lý với dung dịch NaOCl hay H2O2

Ngày nay có rất nhiều công ty đang sản xuất chitin và chitosan ở mức độ công nghiệp Đa số chúng tập trung ở Hoa Kỳ và Nhật Bản, từ đây một lượng lớn chitin và chitosan được sản xuất hằng năm từ vỏ các loài tôm và cua

2.1.3.2 Phương pháp chế tạo Chitosan

Chitosan được điều chế bằng cách N-deacetyl chitin thu được từ vỏ tôm

và cua Việc tạo ra nhóm acetamindodeoxy carbohydrate có thể được thực hiện trong các điều kiện acid hoặc kiềm nhưng một số trở ngại về mặt lập thể có thể gây cản trở phản ứng Nhiều nổ lực đã đưa ra nhưng nhóm N-acetyl không thể được loại bỏ bằng acid nếu không kèm theo sự thủy phân mạch polysaccharide (A Tolaimate, 2000)

Có rất nhiều người đề nghị quy trình điều chế chitosan khác nhau, song nhìn chung điều này được thực hiện ở những sự kết hợp khác nhau của nhiệt độ (800C đến 1400C), nồng độ kiềm (30% đến 60%) và thời gian lên đến 10 giờ Những thông số này phải được kiểm soát chặt chẽ bởi những ảnh hưởng của chúng tới độ deacetyl, khối lượng phân tử, sự phân bố khối lượng, cũng như sự phân bố của các đơn vị deacetyl dọc theo mạch polymer Và những tính chất này phản ánh sự hữu ích của chitosan trong nhiều ứng dụng, đặc biệt trong công nghệ dược

Các thí nghiệm được thực hiện trên -chitin thu được từ vỏ tôm cho thấy kết quả là: Sự điều chế chitosan ở nồng độ kiềm không cao, nhiệt độ thấp, và kéo dài thời gian sẽ làm cho các phần được deacetyl hóa trong mạch polymer phân bố một cách ngẫu nhiên, nếu quá trình thực hiện ở nhiệt độ cao làm tăng độ deacetyl hóa nhưng mặc khác cũng làm giảm kích thước của phân tử (A Tolaimate, 2000; J.Synowiecki, 2003)

Vì -chitin có hoạt tính sinh học cao hơn dạng -chitin trong các phản ứng hóa học đặc biệt trong quá trình deacetyl hóa nên quy trình điều chế sẽ khác

đi đôi chút (A Tolaimate, 2000) Điều này được giải thích là do  -chitin có cấu trúc mở (sự sắp xếp song song của các sợi chitin) hơn dạng anpha của nó làm cho liên kết hydrogen yếu hơn vì vậy -chitin có khả năng hòa tan và trương tốt hơn (P Methacanon, 2003)

Theo các nghiên cứu của Kurita và cộng sự để thu được -chitin có độ deacetyl hóa 80% có thể sử dụng dung dịch NaOH 40%, nhiệt độ 800C trong điều kiện khí nitrogen trong 3 giờ Theo Kurita, sự deacetyl hóa dị thể diễn ra ưu tiên trong vùng vô định hình của chitin, sau đó diễn biến từ ngoài vào trong vùng tinh thể Chang và cộng sự cho rằng sự cắt mạch diễn ra đồng thời với sự deacetyl hóa, cản trở sự cạnh tranh với deacetyl (P Methacanon,2003) Chang cũng cho rằng cơ chế của sự deacetyl hóa dị thể chitin có thể được kiểm soát bởi điều kiện phản ứng và khả năng khuyếch tán Tolaimate cho rằng sử dụng quy trình của Kurita ít xảy ra hiện tượng cắt mạch chitosan do đó có thể thu được chitosan có khối lượng phân tử cao và sản phẩm có độ deacetyl hóa rộng

2.1.3.3 Các phương pháp chế tạo Oligochitosan

Các Oligochitosan tự nhiên có thể được thu nhận trực tiếp bằng cách tách

chiết và tinh chế chúng nhưng chủ yếu chế tạo từ các polychitosan Có rất nhiều phương pháp khác nhau để điều chế Oligochitosan từ chitosan đã được các tác giả trong và ngoài nước sử dụng như dùng các tác nhân hóa học (acid HCl,

H3PO4, HNO2 v.v…), các tác nhân oxy hóa (K2S2O8, NaNO3, H2O2 v.v…), dùng enzyme sinh học và phương pháp vật lý (bức xạ UV, gamma Co-60, sóng siêu

âm, nồi hấp áp suất cao v.v…) Tuy nhiên, hiện tại có ba phương pháp chế tạo Oligochitosan được sử dụng phổ biến đó là: Phương pháp sinh học, phương pháp hóa học và phương pháp bức xạ

 Phương pháp sinh học

Đây là quá trình thủy phân các phân tử polysaccharide có mạch dài hơn nhằm tạo nên các Oligochitosan có mạch ngắn hơn nhờ tác dụng của các enzyme Phương pháp dùng enzyme để chế tạo Oligochitosan đã được con người áp dụng

từ rất lâu trong công nghệ lên men, điển hình là quá trình chế tạo mạch nha từ tinh bột nhờ hoạt động của thủy phân của enzyme amylase tách từ các mầm của hạt ngũ cốc

Bảng 2.1 Enzyme thủy phân các polysaccharide tương ứng

Amylase Mầm lúa, vi khuẩn và

Người ta có thể thu nhận enzyme từ các nguồn khác nhau như thực vật, động vật hay vi sinh vật Các enzyme cùng loại có phản ứng đặc hiệu là giống nhau nhưng tốc độ của phản ứng xúc tác là khác nhau và điều kiện tối ưu của môi trường phản ứng như nhiệt độ, pH v.v… cũng khác nhau

Quá trình thủy phân polymer tự nhiên nói chung và polysaccharide nói riêng được tiến hành trong dung dịch với sự có mặt của hệ đệm tương ứng cho từng loại enzyme Các enzyme có bản chất là protein và rất nhạy cảm với nhiệt độ, thường là chúng bị bất hoạt ở nhiệt độ cao và không có khả năng phục hồi, vì vậy khi muốn dùng phản ứng trong công nghệ enzyme người ta nâng nhiệt độ phản ứng lên 1000C trong vòng 3 đến 10 phút Điều đáng chú ý ở đây là trong sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân polysaccharide bằng enzyme luôn luôn

là một hỗn hợp bao gồm các oligosaccharide có khối lượng phân tử khác nhau Các phân đoạn (fraction) này được tách bằng phương pháp sắc ký cột

(fractionation) và khối lượng phân tử trung bình (Mw) của chúng được xác định bằng sắc ký gel (GPC) hoặc là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Bằng phương pháp enzyme, Izume đã thủy phân 2,27g chitosan bằng chitosanase trong 6 giờ đã thu được hỗn hợp Oligo D-glucosamine bao gồm di, tri, tetra, và panda D-glucosamin với hàm lượng tương đương như sau: 238 mg, 719mg và 207mg Tương tự, Rochas và Heyraud (1981) đã thủy phân K-caraghinan bằng K-caraghinase đã thu được hỗn hợp oligoneocarabio từ mono đến penta Mặc khác theo kết quả của Chabrecek (1991) khi tiến hành thủy phân Natri hyaluronate bằng enzyme hyaronidase theo thời gian từ 30 - 2880 phút đã thu được các hỗn hợp các sản phẩm oligohyaluronate có Mw khác nhau Điều đáng chú ý ở đây là

độ phân bố khối lượng phân tử (D = Mw/Mn) tăng dần và đạt giá trị cao nhất sau

180 phút xử lý (D0 = 1,28, D180 = 2,34) và sau đó giảm xuống (D2880 = 1,4) Như vậy thời gian phản ứng càng dài thì giá trị Mw càng giảm và độ phân bố càng đồng nhất hơn

Nói chung phương pháp thủy phân bằng enzyme thủy phân thích hợp cho mục đích chế tạo Oligosaccharide có khối lượng phân tử rất thấp (di hoặc mono) nếu thời gian phản ứng đủ dài

 Phương pháp hóa học

Cũng giống như phương pháp enzyme là thủy phân các polysaccharide mạch dài thành các oligosaccharide có mạch ngắn hơn, nhưng khác nhau ở chỗ là trong quá trình này tác nhân thủy phân không phải là enzyme mà là tác nhân hóa học Phương pháp này đơn giản hơn nhiều so với phương pháp enzyme, giá thành thấp và cũng được con người từ lâu sử dụng để chế tạo một số loại đường maltose

Trong quá trình chế tạo bằng phương pháp hóa học thì các tác nhân thủy phân thường được dùng là các acid vô cơ mạnh như HCl, HNO3 v.v… hoặc các chất kiềm mạnh như NaOH, KOH v.v… ở nhiệt độ cao (thường là 80 - 1000C) Các tác nhân này chủ yếu có tác dụng thủy phân các liên kết glucoside trong mạch của phân tử polysaccharide Nếu như enzyme thủy phân các liên kết này một cách đặc hiệu thì các tác nhân hóa học thủy phân chúng hoàn toàn không đặc hiệu Môi trường phản ứng trong phương pháp này là dung dịch nước, nhưng quá

trình xảy ra không phụ thuộc nghiêm ngặt vào điều kiện môi trường như độ pH, đệm v.v…như trong trường hợp của enzyme Điều đáng chú ý ở đây là tốc độ của phản ứng thủy phân thường phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ cũng như nồng

độ của các tác nhân hóa học Thông thường khi tăng nhiệt độ hoặc tăng nồng độ của các tác nhân thủy phân thì tốc độ phản ứng sẽ xảy ra nhanh hơn và triệt để hơn

J.Zhishen và S.Dongfeng đã nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian phản ứng lên việc chế tạo chitosan trọng lượng phân tử thấp bởi tác nhân acid phosphoric Chitosan khối lượng phân tử thấp được phân hủy bởi acid phosphoric 85% với thời gian và nhiệt độ phản ứng khác nhau Ở nhiệt độ phòng, khối lượng phân tử trung bình của các chitosan có khối lượng phân tử thấp từ 71 KDa đến 214 KDa sau 35 ngày xử lý Tốc độ giảm cấp giảm khi gia tăng thời gian thủy phân, sản lượng chitosan cũng giảm từ 68,4% đến 40,2% sau 35 ngày Tại nhiệt độ 400C, 600C, 800C, khối lượng phân tử giảm dần theo thứ tự là từ 37 KDa, 35 KDa, 20 KDa trong 8 giờ thủy phân, sản lượng chitosan còn lại ở mức

độ cao so với nhiệt độ phòng là 86,5%, 71,4% và 61,3 % khi xử lý theo thứ tự ở

400C, 600C, và 800C Thời gian phản ứng khác nhau đã tạo ra những sản phẩm chitosan có khối lượng phân tử khác nhau Ở 600C khối lượng phân tử của sản phẩm giảm từ 214 KDa xuống còn 74 KDa trong thời gian là 4 giờ, sau đó giảm một cách chậm dần và đạt 19 KDa trong 15 giờ Một điều được nhận thấy là tính tan trong nước của chitosan cũng được gia tăng khi khối lượng phân tử giảm xuống Từ kết quả cho thấy năng suất của phản ứng và khối lượng phân tử của chitosan phụ thuộc khá lớn vào nhiệt độ và thời gian phản ứng Như vậy nhiệt độ

và thời gian thủy phân của chitosan trong dung dịch acid phosphoric 85% được xác định rõ là: nhiệt độ 600C và thời gian là 15 giờ có thể thu được chitosan có khối lượng phân tử từ 19 KDa đến 20 KDa Độ hòa tan trong nước của chitosan cũng gia tăng khi khối lượng phân tử giảm Những chitosan có khối lượng phân

tử thấp này có thể rất hữu dụng như là một hợp chất có hoạt tính sinh học (J.Zinshen and S Dongfeng, 2002)

Năm 1931, Bermann và Siberkweit đã thủy phân chitin bằng acid HCl đã chế tạo được oligo N-acetylglucosamine Đến năm 1957, Horoweit và cộng sự đã

nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng HCl ở nhiệt độ cao và đã thành công cho mục đích chế tạo D-glucosamine oligosaccharide Sản phẩm hoàn thành được tách phân đoạn bằng sắc ký cột, kết quả cho thấy hỗn hợp oligo-D-glucosamine gồm

ít nhất sáu phân đoạn có khối lượng phân tử khác nhau Bằng phương pháp HPLC tác giả đã tách được hỗn hợp sản phẩm có oligomer từ dimmer đến hexamer Tuy nhiên khi so sánh với phương pháp cắt mạch chitosan bằng enzyme, Isome cho rằng phương pháp cắt mạch chitosan bằng tác nhân hóa học cho hiệu suất thấp và sản phẩm có Mw cao hơn

 Phương pháp bức xạ

Theo nghiên cứu của Lê Hải (2002) và cộng sự lên sự cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn bởi bức xạ gamma sau đó sử dụng hệ dung môi gồm methanol - nước và acetone để tách các Oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp ra khỏi hỗn hợp chitosan chiếu xạ Chitosan 8B (có độ deacetyl hóa là 90%) và chitosan 10B (có độ deacetyl hóa là 99%) dạng bột chứa trong bao polyethylene và chiếu

xạ bằng bức xạ gamma Co - 60 (suất liều chiếu là 1,4KGy/giờ) ở điều kiện nhiệt

độ phòng với liều chiếu từ 10 đến 500KGy đã thu được kết quả như trong hình sau:

Biểu Đồ 2.1 : Ảnh hưởng của liều xạ trên khối lượng phân tử của chitosan chiếu xạ trong tình trạng rắn

Từ kết quả khảo sát ta có thể nhận thấy rằng phân tử chitosan đã bị cắt mạch làm cho phân tử của chitosan nhỏ lại Dựa vào liều chiếu xạ có thể thu được

những polymer khác nhau có Mw nhỏ hơn, độ dài của chuổi polymer ngắn hơn Ulanski và Rosiak cũng đã nghiên cứu về các thay đổi của chitosan dưới dạng ảnh hưởng của bức xạ và kết luận rằng chitosan bị chiếu xạ trong môi trường rắn chỉ bị giảm cấp và sự khâu mạch (crosslinking) là không đáng kể Nghiên cứu tiếp theo của Wenwei và cộng sự lên quá trình biến đổi cấu trúc hóa học của chtosan chiếu xạ cho thấy bức xạ gamma (Co-60) hầu như chỉ có tác dụng cắt đứt các liên kết C-O-C trong cấu trúc vòng glucopyranose (Lê Hải, 2002)

Như vậy, kết quả trên cho ta thấy rằng so với phương pháp hóa học thì phương pháp bức xạ có thể kiểm soát được khối lượng phân tử của chitosan sau khi được chiếu xạ một cách tương đối chính xác và dễ dàng Ngoài ra, phương pháp này không thải ra các hóa chất đã sử dụng hay phải tinh chế chúng như phương pháp hóa học Còn phương pháp enzyme là phương pháp tạo ra sản phẩm phân cắt đặc hiệu tuy nhiên đòi hỏi nhiều bước, tính kỹ lưỡng từng bước và

sự chuẩn bị và tinh sạch các enzyme Đây chính là vấn đề trở ngại khi tiến hành sản xuất qui mô lớn (Lê Hải, 2002)

Như vậy qua các phương pháp trên ta thấy phương pháp chế tạo Oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ, đặc biệt là bức xạ gamma có thể có những

ưu điểm như có thể điều chỉnh trọng lượng Oligomer như mong muốn, sản phẩm

có độ phân bố trọng lượng phân tử đồng nhất hơn, thời gian nhanh hơn v.v… Đây là một phương pháp tốt cho sự sản xuất Oligochitosan với số lượng lớn ở quy mô công nghiệp

2.1.4 Ứng dụng của Chitin, Chitosan và Oligochitosan

Chitosan mang nhiều đặc tính như tương hợp sinh học, khả năng tự phân

hủy sinh học, khả năng phân hủy với các nhóm amino đã deacetyl hóa, khả năng tạo màng, tính thẩm thấu chọn lọc của màng chitosan, khả năng tạo phức chelate, khả năng hấp thụ v.v… Do đó polysaccharide này được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực khác nhau

2.1.4.1 Ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và công nghệ sinh học

Trong lĩnh vực nông nghiệp, chitin và chitosan làm tăng hàm lượng chitinolytic có trong các vi sinh vật và giúp chúng sinh sôi trong đất, từ đó làm hạn chế các mầm bệnh trong đất và trong hệ thống mạch dẫn của cây trồng thông

qua sự thủy phân thành tế bào nấm bằng enzyme chitinolytic tiết ra từ các vi sinh đối kháng Do đó, chitosan được sử dụng để bọc nang các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh hóa, sinh lí của mạ lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy các enzyme như: amylase, catalase và peroxidase cũng tăng lên Ngoài ra chitosan còn dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích tăng trưởng

Chitosan còn được dùng làm chất mang (carrier) để cố định enzyme và cố định tế bào Hiện nay trên thế giới đã thành công trong việc sử dụng chitosan làm chất mang để cố định enzyme tế bào Enzyme cố định cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi enzyme trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích

Hiện nay Oligochitosan với độ polymer hóa từ > 6 được ghi nhận là có hiệu ứng chống lại sự xâm nhiễm của nhiều loại nấm gây bệnh thực vật thông qua cơ chế kích thích việc tạo kháng sinh thực vật (phytoalexin) Lê Hải và cộng sự (J Synowiecki, 2003) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các phân đoạn Oligochitosan

lên sự phát triển của giống nấm Aspergilus nidudants Wint đã thu được kết quả là

các Oligochitosan có Mw~20 KDa có thể ngăn cản sự phát triển của nấm ở nồng

độ 100 ppm

Ngoài ra ở Việt Nam và trên thế giới còn sử dụng Oligochitosan như là một chất kích thích tăng trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật Theo V.T.T.Hà và nhóm nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan cắt mạch bức xạ lên sự

phát triển của cây cúc (Chrysanthemum morifolium) invitro đã đưa ra kết quả

sau: Dung dịch chitosan có độ deacetyl hóa 80% và nồng độ 10% được chiếu xạ

ở liều xạ 100 KGy đã biểu hiện hiệu ứng tăng trưởng cao nhất lên cây cúc trong nuôi cấy mô Nồng độ thích hợp cho hiệu ứng nhân chồi là 50 - 100mg/l và tạo cây non là 100mg/l Chitosan chiếu xạ không những làm gia tăng hiệu quả nhân chồi lên 30,5% mà còn kích thích sự phát triển chiều cao của cây (19,4%), chiều dài rễ (40,6%) và sinh khối tươi (61,8%) của cây non Ngoài ra sự bổ sung

chitosan chiếu xạ cũng làm tăng tỷ lệ sống của cây hoa cúc sau khi thuần hóa trong ống nghiệm lên 18% so với đối chứng (Võ Thị Thu Hà và ctv, 2006) Chitosan với trọng lượng phân tử thấp có rất nhiều ứng dụng và một trong những ứng dụng được nghiên cứu gần đây là khả năng kích thích sinh trưởng và phát triển thực vật Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Oligochitosan đóng vai trò như một chất có khả năng kích thích sự hấp thụ các chất dinh dưỡng của

mô thực vật đồng thời còn có tác dụng gia tăng hiệu ứng phytoalexin của mô cây giúp cho cây không chỉ tăng trưởng nhanh mà còn kháng lại một số bệnh do vi sinh vật gây nên đồng thời giúp cho cây trồng chống chịu tốt với các stress của môi trường

2.1.4.2 Tác nhân cationic trong xử lý nước thải

Chitosan cationic tạo thành những phức hợp đa điện ly với những polymer polyanionic và tạo chelate với ion kim loại để tạo kết tủa các phản ứng này sử dụng để làm trong nước thải ô nhiễm Chitosan acetate lần đầu tiên được một công ty Nhật giới thiệu như một tác nhân cationic tự nhiên để đông tụ và loại các chất thải trong nước cống Hiện này hệ thống này vẫn còn đang được sử dụng để

xử lý nước thải sinh hoạt, tái sử dụng nước thải (vd nước hồ bơi), thu hồi protein

và khoáng từ nước thải công nghiệp, phân lập các chất có hoạt tính sinh học trong nước tiểu, tách các chất độc nội bào từ dung dịch loãng Chitosan cũng có thể sử dụng như một chất hấp phụ để tách các đồng vị phóng xa từ nước ô nhiễm

và thu hồi uranium từ nước biển và nước ngọt (Nguyễn Văn Uyển và tác giả, 2003)

2.1.4.3 Chitosan dùng trong y học

 Tác nhân hạ cholesterol:

Chitosan có tính chất như chất xơ thực phẩm không bị phân hủy ở đường dạ dày ruột trong cơ thể, vì nó thiếu enzyme chitonase đặc hiệu Về sinh lý học, chức năng chính của chitosan là làm giảm sự hấp thu lipid ở ruột, do vậy nó có đặc tính làm giảm cholesterol và giúp cho việc giảm trọng lượng cơ thể một cách đáng kể do sự hấp thụ lipid

Chitosan có tác dụng làm giảm lượng cholesterol theo cơ chế như hầu hết các chất xơ thực phẩm khác (không tiêu hóa được phần trên ống tiêu hóa, độ nhớt

cao, khả năng ngậm nước cao ở phần dưới ống tiêu hóa…) Tuy nhiên, thêm vào

đó chúng có khả năng tạo liên kết ion ở pH thấp mà vì vậy chúng có khả năng liên kết với các ion âm như acid mật và acid béo tự do

Chitosan cho thấy có chức năng hạ cholesterol trong ruột động vật Thỏ được cho ăn thức ăn giàu cholesterol 0.9% trong 39 ngày, lượng cholesterol huyết thanh tăng từ 79 lên 650 mg/dL Trong trường hợp với khẩn phần ăn như trên nhưng có bổ sung 2% chitosan, lượng cholesterol huyết thanh giảm tới 300 mg/dL, trong khi đó lượng HDL - cholesterol có ích giảm không đáng kể Nhưng hiện tượng giảm cholesterol khi tiêm chitosan - oligosaccharide vào thỏ thì không thấy, điều đó cho thấy sự giảm cholesterol chỉ xảy ra ở ruột động vật

(Ascher M and Hestrin S, 1946)

 Các vật liệu y sinh học và dược phẩm:

Chitin và chitosan có thể kết hợp sinh học với mô, cơ quan, tế bào,… và có thể sử dụng trong việc cấy vào mô Chitin và các dẫn xuất của nó có thể tiêu đi trong mô động vật, dẫn đến gia tăng sự cảm ứng các protein bảo vệ sinh học gồm lysozyme, chitinase Tốc độ thủy phân enzyme với chitin cũng được điều khiển bới cấu trúc của một nhóm N - acetyl và dẫn xuất của nó Do những tính chất đặc trưng này, chitin và các dẫn xuất được sử dụng như những vật liệu y sinh học hay vật liệu dùng để bao các loại thuốc tan chậm

Hoạt độ lipoprotein lipase trong máu tăng lên khi tiêm N,O - sulfate chitosan và hoạt động miễn dịch được tăng cường khi cấy chitin N - deacetyl một phần vào mô động vật

Film chitosan bao thuốc (thấm qua được) cũng công dụng như các dạng con nhộng thương phẩm và chitosan được sử dụng như một vật liệu dùng để cấy giải phóng chậm các loại thuốc uống chống ung thư Chitosan cũng dựa vào công thức các loại thuốc uống, chúng làm gia tăng sự hấp phụ thuốc vào máu

 Vật liệu và vết thương:

Các vết thương ở mô động vật, thực vật có thể được bao bằng một tấm màng hay một miếng xốp chitin và chitosan, hay dạng bong hoặc bột mịn Các vết thương cũng có thể trị liệu bằng các dung dịch hay kem chitin và chitosan Kết quả là sự phát triển của các tế bào ở vùng mô bị thương được kích thích,

chitinase hay lysozyme được tăng cường, dẫn đến mau lành vết thương và ngăn

sự nhiễm trùng

 Những chất chống nghẽn mạch và đông máu:

Dẫn xuất N - octanoyl và N - hexanoyl của chitosan có chức năng chống nghẽn mạch, chitosan có chức năng cầm máu Dẫn xuất sulfate hóa của chitin và chitosan có hoạt tính chống tụ máu Khi được phân tích bằng thời gian thromboplastin hoạt hóa một phần, N,O - sulfated chitosan có hoạt tính chống đông tụ thấp hơn heparin, nhưng O - oligosulfated chitin thì cao hơn, mặc dù nó không có nhóm N - sulfated trong phân tử Nhóm N - sulfated trong heparin quan trọng cho hoạt tính O - sulfated chitin có mức độ độc thấp LD50 1.25 - 3.25 g/kg, trong khi đó heparin có LD50 1.59 - 2.0 g/kg Các dẫn xuất sulfated này của chitin

và chitosan có thể được sử dụng như một heparin mới lạ (Ascher M and Hestrin

S, 1946)

 Thành phần mỹ phẩm:

Các muối hữu cơ của chitosan phân tử thấp hòa tan trong etanol loãng và được sử dụng như một thành phần của keo xịt tóc CM - chitin anionic và HP - chitosan cationic hòa tan trong nước và bền trong một khoảng pH rộng, chúng được sử dụng như một thành phần của mỹ phẩm chăm sóc da Chitosan, CM - chitin và HP - chitosan có chức năng tạo độ ẩm cho da, ngăn cản sự hủy hoại cơ học của tóc Đặc tính giữ độ ẩm tương ứng với dung dịch propylenglycol 20% và dung dịch hyaluronic loãng Những dẫn xuất chitosan này ngăn chặn sự nhiễm

khuẩn trên da và hoạt hóa tế bào da dẫn đến ngăn chặn sự lão hóa da

2.2 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ DENDROBIUM THONGCHAI GOLD

2.2.1 Giới thiệu họ lan

2.2.1.1 Đặc điểm chung

Các họ lan được đánh giá là một trong những loài hoa cao cấp trong vương

quốc thảo mộc, bao gồm hơn 25000 loài khác nhau, cùng với những loài mới khám phá và mô tả theo từng năm Do chúng phân bố vùng rộng lớn, trải dài từ đường xích đạo cho đến Bắc cực, từ đồng bằng cho đến các vùng núi băng tuyết, các loài lan rất khác biệt nhau: Lan đất (phát triển mọc trong đất kháng nước);

thực vật biểu sinh hoặc thực vật phụ sinh (phát triển phía trên mặt đất hoặc sống bám trên các loại thảo mộc khác, thu hút chất dinh dưỡng và nước từ môi trường xung quanh); thực vật phát triển trên mặt đá hoặc ngay cả dưới mặt đất (phát triển dưới bề mặt của môi trường cấy trồng)

Những nhà sáng lập ngành Lan học đáng kể là triết gia người Hy Lạp Theophrastus (372-287 trước Công nguyên) và sau này là nhà thực vật học người Thụy Điển Linnaeus (1707-1778) Chính Theophrastus là người đầu tiên sử dụng

từ Hy Lạp “Orchis” để chỉ nhóm Lan

Trong số những cây cho hoa có hơn 16.000 loài và 700-800 giống thuộc họ

Orchidaceae đã được xác định (Begum, 2000), và có rất nhiều loài được lai

giống nhân tạo Họ lan (Orchidaceae) chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc (Asteraceae) và là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm Riêng ở Việt Nam lan rừng

được biết gồm hơn 750 loài khác nhau Khác với các cây trồng cạn, trồng trong

môi trường nước (thủy sinh), các loài phong lan (họ lan Orchidaceae) lại có đời

sống kí sinh, bì sinh (không cần đất) nhờ bộ rễ “ăn nổi” bám vào vỏ cây rừng nhiệt đới hoặc hút chất dinh dưỡng từ mùn hữu cơ đang hoai mục (Trần Hợp,

1998) Nhìn chung, họ Orchidaceae bao gồm các loài cây thân thảo, sống lâu

năm (đôi khi hoá gổ một phần ở gốc) Chúng sống ở đất, nơi hốc, vách đá, hoặc sống phụ, sống hoại (Trần Hợp, 1998) Căn cứ vào cấu trúc, Pfitzer sắp xếp đa

số lan tập trung vào hai nhóm: nhóm đơn thân (monopodial) như các giống

Vanda, .và nhóm đa thân (sympodial) như các giống Cattleya, Dendrobium, Cymbium (Nguyễn Công Nghiệp, 1998) Ngoài ra cây lan còn mang một số đặc

tính đặc biệt như: hạt vô cùng nhỏ, số lượng nhiều và hầu hết không có chất nuôi dưỡng; việc nảy mầm và phát triển phải nhờ vào một loài nấm mang tính kí sinh hơn là cộng sinh trong tự nhiên; mỗi hoa lan có 3 lá đài, 3 cánh hoa, trong 3 cánh hoa có một cánh ở giữa, phía dưới mang dáng đặc biệt như một cái lưỡi gọi là môi Môi hoa lan mịn như nhung, có khi kéo dài ra hay uốn cong lên, cùng với đài và cánh hoa tạo thành nhiều hình thái đặc biệt (Trần Văn Bảo, 1999)

2.2.1.2 Đặc điểm về phân loại

 Orchidaceae là một họ rất lớn thuộc lớp Đơn tử diệp, phân bố khắp nơi

trên thế giới

- Ở vùng ôn đới, ta gặp nhiều loài sống ở đất như địa lan; một số loài hoại sinh không diệp lục và sống nhờ vào chất mục nát trong đất; có loài ở Úc Châu

có thể sống ngầm dưới đất như nấm

- Ở vùng nhiệt đới, ta sẽ gặp nhiều loài phụ sinh sống trên cây khác như

Cattleya, Oncidium, Laelia tập trung nhiều ở vùng Trung Mỹ; ở Đông Nam Á

đặc sắc nhất là Dendrobium và còn có Cypripedium, Phalaenopsis, Cymbidium

có nguồn gốc ở Indonesia

- Một số loài lan sống trên đá như thạch lan

Cây lan có thể chia làm hai nhóm :

- Nhóm đơn thân: đây là nhóm chỉ tăng trưởng về chiều cao làm cây dài ra mãi Nhóm đơn thân chia làm hai nhóm phụ:

Nhóm phụ lá mọc đối (Sarcanthinae): nhóm này lá được xếp thành 2 hàng

mọc đối nhau, lá trên một hàng xen kẻ với lá của hàng kia Gồm các giống như:

Vanda, Aerides, Phalaenopsis…

Nhóm phụ lá dẹp thẳng hay tròn (Campylocentrinae): Papilionanthe,

Luisia…

- Nhóm đa thân: đây là nhóm gồm những cây tăng trưởng liên tục Căn cứ vào cách ra hoa nhóm này chia thành 2 nhóm phụ:

Nhóm ra hoa phía trên như: Cymbidium, Dendrobium, Oncidium…

Nhóm ra hoa ở đỉnh: Cattleya, Laelia, Epidendrum…

- Ngoài ra còn có một số giống mang tính chất trung gian như:

Centropetatum, Phachyphllum, Dichaea…

Hình 2.4: Một số giống hoa đẹp của họ Orchidaceae

Hình 2.5 Lan Dendrobium thongchaigold

2.2.2 Giới thiệu về Dendrobium thongchai gold

2.2.2.1 Vị trí phân loại

Ngành: Magnoliophyta (hiển hoa bí tử)

Lớp: Monocotyledones (đơn tử diệp)

Giống lan này được đặt tên vào năm 1799 Chữ Dendrobium có nguồn gốc

của chữ Hy Lạp Dendro có nghĩa là cây gỗ, cây lớn; bio là sống, vì tất cả các

loài của Dendrobium đều là phụ sinh sống bám trên cây gỗ

Dendrobium rất phong phú về chủng loại, nay lớn thứ nhì của họ Lan với

khoảng 1.600 loài phân bố trên các vùng thuộc châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á và Úc châu

Điều kiện sinh thái của Dendrobium cũng rất đa dạng có nhiều loài chỉ mọc

và ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài ở trung gian, và cũng có loài

thích nghi với bất cứ điều kiện khí hậu nào

2.2.2.3 Phân loại

Dendrobium được chia ra làm 2 nhóm theo dạng thân của chúng:

- Dạng thòng hay Nobile là dạng thân mềm thường ở vùng hơi lạnh như Đà

Lạt

- Dạng đứng hay Phalaenopsis là dạng thân cứng thường sống ở vùng có

khí hậu nóng hơn

Cả Dendrobium nobile và Dendrobium phalaenopsis đều có chung đặc

điểm trong việc tạo lập các giả hành mới và trong sự biệt hóa chồi sơ khởi ở nách

lá dọc theo giả hành; nhưng chúng lại rất khác biệt trong việc trong việc tạo lập chồi hoa

- Ở Dendrobium nobile ra hoa từ chồi sơ khởi của giả hành đã trưởng

thành Như Long tu, Giả hạc chúng chỉ ra hoa với giả hành đã rụng hết lá

- Ở Dendrobium phalaenopsis thì hoa mọc ở giả hành cũ lẫn giả hành mới

Ơ giả hành mới, chồi non nhất ở gần ngọn là chồi đầu tiên phát triển thành vòi hoa

Hình dạng của Dendrobium cũng rất biến thiên:

- Nhóm có giả hành rất dài và mang lá dọc theo chiều dài của giả hành ấy,

thường rụng hết lá khi ra hoa như Long tu (Dendrobium primulinum), Ý thảo

(Dendrobium gratio sissimum)…

- Nhóm giả hành to ngắn, tận cùng thường có 2 - 3 lá dai, bền, không rụng Phát hoa tập trung ở phần này tạo thành chùm đứng hay thòng như: Thủy tiên

trắng (Dendrobium farmeri), Thủy tiên vàng (Dendrobium thyrisflorum), Vảy cá (Dendrobium lindleyi)…

- Nhóm cá giả hành rất mảnh mai, dài hay ngắn, có lá dọc theo chiều dài của chúng, dai bền không rụng Hoa thường cô độc ở nách như Hương duyên

(Dendrobium revolutum)…

Ngoài ra còn có một số loài Dendrobium khác cũng thường được trồng:

- Kim điệp (Dendrobium chysotosum var delacuorii): Hoa vàng tươi, môi

vàng dưới trung tâm đậm

- Nhất điểm hồng (Dendrobium dracoins): Hoa trắng bóng như sáp với

môi sọc đỏ ở đáy

- Thạch hộc (Dendrobium crumenatum): Hoa trắng, môi có bớt vàng, thơm

nhưng mau tàn, ít hoa nhưng nở rộ cùng lúc

- Giả hạc (Dendrobium anosmum, Dendrobium superbum): Hoa màu

hường, có hai bớt đậm màu trắng hay tuyền Rất thơm

2.2.2.4 Đặc điểm về hình thái

 Rễ:

Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Dendrobium phù hợp với

nhiều điều kiện sống như:

- Khi sống ở đất thì rễ mập, thân rễ bò dài hay ngắn (Trần hợp, 2000)

- Ở một số loài có lối sống bám lơ lửng trên võ thân cây gỗ khác, nên thân

rễ dài hay ngắn, mập hay mảnh mai giúp đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày Hệ rễ vừa làm nhiệm vụ lấy nước, muối khoáng trên vỏ cây gỗ, hấp

thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bởi một lớp mô hút ẩm dày, bao gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu xám bạc Ngoài

ra, nó còn có nhiệm vụ bám chặt vào giá thể để giữ cây khỏi bị gió cuốn đi Hệ rễ phát triển nhiều hay ít phụ thuộc vào hình dạng chung của cả cơ thể (Trần hợp, 2000; Nguyễn Công Nghiệp, 2000)

- Ở loài sống hoại thì rễ có dạng búi nhỏ dày đặc các vòi hút ngắn hút chất dinh dưỡng từ đám xác thực vật (sau khi được nấm phân hủy) Nhiều loài lại có

hệ rễ đan thẳng thành một búi chằng chịt, nó là nơi thu gom mùn của vỏ cây để làm nguồn dự trữ chất dinh dưỡng (Trần hợp, 2000; Nguyễn Công Nghiệp, 2000)

 Thân :

Dendrobium thuộc nhóm đa thân (sympodial) Đây là nhóm gồm những

cây tăng trưởng liên tục mà có những chu kỳ nghỉ sau những mùa tăng trưởng

Dendrobium vừa có thân thật vừa có giả hành Giả hành tuy là thân nhưng lại

chứa diệp lục, dự trữ nước và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển giả hành mới Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nước

do mặt trời hun nóng Đa số củ giả hành có màu xanh bóng, nên cùng với lá, nó

cũng làm nhiệm vụ quang hợp Thường các loài thuộc giống Dendrobium dùng

cho mục đích kinh doanh là lan đa thân với nhiều giả hành (Trần Hợp, 2000)

 Lá:

Phong lan đều là cây tự dưỡng, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống

lá, có rất nhiều kiểu lá khác nhau, có mỏng mềm, có dai cứng và cũng có cả mọng nước , có lá dẹt, lá dài và lá hình trụ Về màu sắc, phiến lá thường có màu xanh bóng, nhưng đôi khi hai mặt lá có màu sắc khác nhau (thường mặt dưới lá

có màu xanh đậm hay tía), mặt trên lại khảm thêm nhiều màu sặc sỡ (Trần Hợp, 2000)

 Hoa:

Hoa có thể mọc từ thân thành từng chùm hay từng hoa cô độc Các chồi hoa không những mọc trên các giả hành mới mà có thể mọc trên các giả hành củ Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm chính giữa hoa, mang phần đực ở phía trên và

phần cái (đầu nhụy) ở mặt trước Cột này thường dài, thẳng hay cong về phía trước Nhị đực gồm hai phần, bao phấn và hốc phấn Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy Còn hốc phấn thì lõm lại, mang khối phấn và thường song song với bao phấn Khối phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau, rất cứng do có tinh bột,

sáp hay chất sừng Vì thế giống Dendrobium khi ra hoa nó cho một số lượng

cành hoa nhiều hơn bất kỳ một loài lan nào khác Chính vì thế ngày nay nó chiếm

ưu thế trên thị trường hoa cắt cành Hầu như dòng họ của giống Dendrobium là

những loài hoa rất lâu tàn, trung bình từ 1÷2 tháng (Trần Hợp, 2000; Nguyễn Công Nghiệp, 1998)

 Quả:

Quả phong lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc Khi chín quả mở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc Ở một

số loài quả chỉ mở theo 1 - 2 khía dọc, thậm chí không nứt ra, và hạt chỉ ra khỏi

vỏ quả khi vỏ này mục nát

 Hạt:

Hạt chỉ cấu tạo bởi một phôi chưa phân hoá, trên một máng lưới nhỏ, xốp chứa đầy không khí Hạt rất nhiều và nhỏ bé, trọng lượng toàn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng 1 phần mười đến một phần ngàn milligam (Trần Hợp, 2000)

2.2.2.5 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium sp.:

 Nhiệt độ

Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độ quang hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10% thì tốc độ quang hợp tăng lên gấp đôi Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số loài lan như lan

Bạch câu Dendrobium crumenatum đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5-6oC trong vài giây thì 9 ngày sau chúng sẽ nở hoa đồng loạt Ở 18,5o Dendrobium nobile chỉ

tăng trưởng mà

không ra hoa nhưng chúng sẽ ra hoa khi nhiệt độ hạ xuống 13oC hay thấp hơn

Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ, có thể tạm chia Dendrobium thành hai nhóm

chính:

- Nhóm ưa lạnh sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý tưởng là 15oC, gồm các giống được lấy từ các vùng cao nguyên ở độ cao trên 1.000m các loài này nếu được trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 25oC, thì cây vẫn sống, thì cây vẫn sống nhưng hiếm khi ra hoa

- Nhóm ưa nóng, nhiệt độ thích hợp cho các loài của nhóm này là 25oC,

gồm đa số các giống Dendrobium ở vùng nhiệt đới, và các loài của giống

Dendrobium lai hiện đang trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía

Nam…

- Ngoài ra, còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng

lạnh và vùng nóng, nhưng ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa nhiều hơn như

Dendrobium primulinum, Dendrobium farmeri nhiệt độ lý tưởng của các loài này

là 20oC

 Ẩm độ

Các cây lan, nhất là phong lan, sống bám trên các cây cao, chúng lấy nước

từ các trận mưa, từ hơi nước trong không khí Chính ẩm độ quyết định sự hiện diện của các loài phong lan

Thông thường ẩm độ tương đối tối thiểu 70% thích hợp cho sự tăng trưởng của nhiều loài Tuy nhiên ẩm độ lý tưởng vẫn là ẩm độ của vùng bản xứ mà loài lan đó được tìm thấy

Dendrobium cũng như đa số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong

không khí ẩm và thoáng Ẩm độ tương đối cần thiết là 40 - 70% Cấu tạo giá thể quá ẩm và úng thì bộ rễ sẽ bị thối và biểu hiện là cây con keiki mọc ra từ phần ngọn của thân

Ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là 70% Nếu thừa ánh sáng, cây

sẽ bị vàng lá, giả hành bị teo lại, cây xấu đi nhưng cây sẽ thích nghi dần, vẫn ra

hoa nhiều và đẹp Nếu thiếu ánh sáng, cây sẽ bị thoái hóa rõ rệt, cây èo uột và số lượng hoa sẽ ít đi

 Nhu cầu phân bón

Dendrobium thân đứng đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần rất nhiều phân bón và có thể dùng nhiều dạng phân bón khác nhau Còn các loại Dendrobium

thân thòng hấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng

Các loại phân hữu cơ như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phân trâu

bò khô… có thể dùng rất tốt bằng cách pha loãng với nước rồi tưới, hoặc vò chặt từng viên đặt trên bề mặt giá thể, rễ lan sẽ hấp thụ dần dần các dưỡng chất được phóng thích qua quá trình tưới nước

Các loại phân vô cơ được dùng thường có công thức 30-10-10 dùng 3 lần/tuần với nồng độ 1 muỗng cà phê/4lít Trong suốt mùa tăng trưởng, ta bón phân 10-20-30 làm 2 lần/tuần để tạo một sức chịu đựng cho cây trước khi bước vào mùa nghỉ Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, ta thay phân 30-10-10 bằng phân 10-20-20 với chu kỳ bón như trên cho đến khi hoa tàn

Trong mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn giảm và không bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kì tăng trưởng

hằng năm của nó

Không nên dùng các loại phân riêng rẽ, thường phân bón được dùng ở dạng hỗn hợp và bổ sung thêm các chất phụ gia là các sinh tố và các nguyên tố vi lượng

 Sâu bệnh và các vấn đề khác

Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và

môi trường sơ dừa sẽ mục nát sau một thời gian ngắn được trồng Đây là 2 nguyên nhân gây ra nhiều sâu bệnh hại

Một loại rệp dính màu vàng, kích thước rất bé thường xuất hiện trên bề mặt

lá Loại này gây tác hại trên cây qua việc hút nhựa

Đối với các loài côn trùng cắn phá Dendrobium thì loại trừ chúng tương

đối dễ dàng bằng Serpa, Bassa, nồng độ 1/500

Mặc dù Dendrobium là cây kháng bệnh rất mạnh, tuy nhiên cây vẫn bị nấm

và virus tấn công nếu điều kiện vệ sinh quá kém Nguy hiểm nhất là bệnh khô

thân gần gốc giả hành do một loài virus thâm nhập làm cho các giả hành bị khô

và chết Có thể ngừa bệnh bằng cách nửa tháng xịt Topsil, Zineb, Benomyl với nồng độ 1/400 (tài liệu internet:http://agriviet.com/dd/86-nhan-giong-lan-bang-

 Từ lâu, cây lan đã được sử dụng trong y học và thực phẩm:

- Được liệt kê trong dược cổ điển Hy Lạp, Trung Quốc và vùng Tiểu Á, chúng được phơi khô, xắt nhỏ làm thuốc giảm đau và thuốc kích thích

- Zao C và các cộng sự (2002) đã tách chiết được copacamphane, picrotoxane, alloarmadendrane sesquiterpene, glycoside, phenolic glycoside từ

thân của Dendrobium moniliforme Bên cạnh đó, còn ly trích được một nhóm hóa

chất mới là dendromoliside được đánh dấu từ A – D Bước đầu thử nghiệm cho

thấy các chất này làm tăng số lượng tế bào B và ức chế tăng sinh tế bào I invitro

- Gao J và cộng sự (2003) đã quan sát mô tuyến ức được nuôi trên môi

trường có chứa dịch chiết từ protocom của Dendrobium thấy rằng trọng lượng

mô tăng, làm tăng khả năng của phagocyte và tốc độ biến đổi của lymphocyte

- Một bộ tộc ở Indonesia dùng lá Dendrobium sallacense nấu với cơm

như người Việt Nam ở Đồng bằng song Cửu Long nấu cơm với lá dứa Ngoài ra,

lá và giả hành được dùng làm trà hoặc lấy sợi trong thân phơi khô để làm kiềng đeo tay (Dương Công Kiên, 2006)

2.2.2.7 Giới thiệu về lan Dendrobium thongchai gold

Rễ Dendrobium phù hợp với nhiều điều kiện sống: rễ mập, thân rễ bò dài

hay ngắn khi sống ở đất Rễ của chúng không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị chết

Thân có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ Thân nhẵn hay có nhiều vảy là do thái hóa và một phần thẳng đứng mang lá Các lá này bao nhau hợp thành thân giả hay còn gọi là giả hành