khảo sát khả năng cố định đạm và hòa tan lân của vi khuẩn nội sinh trên giống lúa ml213 trồng trong dung dịch khoáng

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ HÒA TAN LÂN CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN GIỐNG LÚA ML213 TRỒNG TRONG DUNG DỊCH KHOÁNG Cán hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: GS.TS Cao Ngọc Điệp Ung Thị Anh Thư - 3102695 Lớp: Cử nhân Sinh học K36 Cần Thơ, 12/2013 Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Gs.Ts. Cao Ngọc Điệp Ung Thị Anh Thư DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… …………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) i Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập hoàn thành luận văn này, nhận giúp đỡ quý báu thầy cô, anh chị bạn. Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: Gs. Ts. Cao Ngọc Điệp, người thầy kính mến hết lòng dạy bảo, định hướng tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực luận văn tốt nghiệp. Ths. Văn Thị Phương Như người góp ý sửa chữa sai sót giúp hoàn thiện thân. Chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ - Cán phòng thí nghiệm toàn thể anh chị bạn phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ trình học tập nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn thầy, cô công tác khoa Khoa học tự nhiên hết lòng dạy dỗ xây dựng tảng kiến thức vững suốt gần năm học tập trường Đại học Cần Thơ. Tôi xin cảm ơn cố vấn học tập Quách Quang Huy, Phạm Khánh Nguyên Huân tập thể lớp cử nhân Sinh học Khóa 36 - người bạn đường hành trình tìm tri thức - gắn bó, động viên giúp đỡ suốt năm đại học trình thực luận văn tốt nghiệp. Con xin chân thành cảm ơn gia đình nuôi dưỡng, bên cạnh động viên giúp đỡ lúc gặp khó khăn. Xin chân thành cảm ơn thầy cô hội đồng chấm luận văn cho đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn này. ii Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 TÓM LƯỢC Đề tài thực để khảo sát khả cố định đạm, hòa tan lân khó tan 10 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ đất vùng rễ giống lúa ML213 trồng Phú Yên. Hạt lúa giống khử trùng bề mặt, xử lý nảy mầm môi trường agar bán lỏng (0,8% agar) 48 giờ. Hạt nảy mầm (rễ mầm khoảng cm) chủng mười dòng vi khuẩn ML1, ML2, ML3, ML4, ML5, ML6, ML7, ML8, ML9 ML10 (mật số 109 tế bào/ml) (hạt lúa giống nghiệm thức đối chứng dương đối chứng âm không chủng vi khuẩn) trồng dung dịch khoáng Yoshida. Thí nghiệm gồm 12 nghiệm thức đạm, 12 nghiệm thức lân (mỗi nghiệm thức lặp lại lần chai, chai chứa 200 ml dung dịch khoáng lỏng hạt lúa nảy mầm). Lấy tiêu chiều cao thân lúa, chiều dài rễ (ngày 7, ngày 14, ngày 21 ngày 28), trọng lượng khô rễ, trọng lượng khô toàn (ngày 28) nghiệm thức để xác định khả cố định đạm, hòa tan lân khó tan mười dòng vi khuẩn nội sinh. Kết mười dòng vi khuẩn khảo sát có khả cố định đạm, hòa tan lân hữu hiệu so với nghiệm thức đối chứng âm. Hai dòng vi khuẩn ML1, ML8 có khả cố định đạm bật thể qua tiêu chiều cao thân lúa chiều dài rễ, trọng lượng khô rễ trọng lượng khô toàn cao có ý nghĩa so với đối chứng dương, ba dòng ML1, ML2 ML5 ba dòng có khả hòa tan lân thúc đẩy phát triển chiều cao thân lúa, tăng dài rễ, trọng lượng khô rễ toàn khô cao đối chứng dương. Từ khóa: cố định đạm, giống lúa ML213, hòa tan lân, vi khuẩn nội sinh. iii Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT i LỜI CẢM ƠN . ii TÓM LƯỢC . iii MỤC LỤC . iv DANH SÁCH HÌNH . vii TỪ VIẾT TẮT . viii CHƯƠNG GIỚI THIỆU . 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu đề tài CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU . 2.1. Tổng quan lúa 2.1.1. Vị trí phân loại . 2.1.2. Nguồn gốc phân bố 2.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý . 2.1.4. Đặc điểm sinh trưởng . 2.1.5. Sơ lược giống lúa ML213 2.2. Tầm quan trọng nguyên tố N, P 2.2.1. Đạm (N) . 2.2.2. Lân (P) . 2.2.3. Thực trạng sử dụng phân hóa học nước ta . 10 2.3. Vi khuẩn nội sinh 11 2.3.1. Nguồn gốc . 11 2.3.2. Sự xâm nhập nội sinh mô thực vật 11 2.3.3. Khái quát cố định nitơ sinh học vi sinh vật 12 2.3.4. Khái quát hòa tan lân khó tan vi sinh vật . 14 2.3.5. Các nhóm vi khuẩn nội sinh lúa . 16 2.3.6. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh . 20 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP . 23 3.1. Thời gian địa điểm nghiên cứu . 23 3.1.1. Thời gian 23 iv Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 3.1.2. Địa điểm 23 3.2. Phương tiện nghiên cứu 23 3.2.1. Vật liệu 23 3.2.2. Thiết bị 24 3.2.3. Dụng cụ . 26 3.2.4. Hóa chất . 27 3.3. Phương pháp nghiên cứu . 29 3.3.1. Chuẩn bị mẫu . 29 3.3.2. Đánh giá hiệu cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan 10 dòng vi khuẩn nội sinh với giống lúa ML213 . 30 3.3.3. Chỉ tiêu theo dõi . 31 3.3.4. Phương pháp thống kê, xử lý phân tích số liệu . 32 Chương KẾT QUẢ - THẢO LUẬN . 33 4.1. Ảnh hưởng 10 dòng vi khuẩn lên chiều cao lúa ML213 trồng dung dịch khoáng . 33 4.2. Ảnh hưởng 10 dòng vi khuẩn lên chiều dài rễ lúa ML213 trồng dung dịch khoáng . 36 4.3. Ảnh hưởng 10 dòng vi khuẩn lên trọng lượng khô rễ, trọng lượng khô toàn 39 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 42 5.1. Kết luận 42 5.2. Kiến nghị 42 v Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Nhu cầu phân bón hóa học sản xuất cho nông nghiệp Việt Nam từ năm 2000-2010 10 Bảng 2. Tên khoa học 10 dòng vi khuẩn 23 Bảng 3. Công thức môi trường Nfb (Nguồn: Kirchhof ctv, 1997) 27 Bảng 4. Môi trường dinh dưỡngYoshida (IRRI, 1976) . 28 Bảng 5. Các nghiệm thức đạm . 30 Bảng 6. Các nghiệm thức lân . 31 Bảng 7. Chiều cao lúa trồng dung dịch khoáng giai đoạn ngày, 14 ngày, 21 ngày 28 ngày (cm) 33 Bảng 8. Chiều dài rễ lúa trồng dung dịch khoáng giai đoạn ngày, 14 ngày, 21 ngày 28 ngày (cm) 36 Bảng 9. Trọng lượng khô rễ, trọng lượng khô toàn lúa trồng dung dịch khoáng giai đoạn 28 ngày (g) . 39 vi Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Oryza sativa L . . Hình 2. Hình thái cấu tạo hoa lúa Hình 3. Cấu tạo hạt lúa . Hình 4. Cấu trúc bậc enzyme nitrogenase 13 Hình 5. Quá trình tạo NH3 từ N2 thông qua H2N=NH2 14 Hình 6. Vi khuẩn Enterobacter . . 18 Hình 7.Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 19 Hình 8. Tủ cấy vi sinh vật vi sinh vật 24 Hình 9. Nồi khử trùng nhiệt ướt . 24 Hình 10. Cân điện tử . 25 Hình 11. Máy lắc mẫu 25 Hình 12. pH kế . . 25 Hình 13. Micropipette . 26 Hình 14. Hạt lúa giống có không chủng vi khuẩn 29 Hình 15. Hiệu hòa tan lân khó tan vi khuẩn lên chiều cao thân lúa giai đoạn 14 ngày . 35 vii Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 TỪ VIẾT TẮT IRRI: International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa gạo quốc tế) FAO: Food and Agriculture Organization (Tổ chức lương thực nông nghiệp) pH: Power of hydrogen/ Potential of hydrogen (Chỉ số đo độ hoạt động ion hydro (H+) dung dịch) IAA: Indole Acetic acid ĐC: Đối chứng NT: Nghiệm thức viii Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Cây lúa (Oryza sativa L.) lương thực quan trọng giới với nửa dân số giới sử dụng lúa gạo làm nguồn lương thực chính, đặc biệt nước phát triển Việt Nam. Tuy nhiên, diện tích canh tác lúa ngày bị thu hẹp. Năm 2008, sản lượng lúa gạo giới đạt 685 triệu so với 822 triệu ngô 695 triệu sắn (khoai mì) tỷ người giới giới bị đói (FAO, 2010). Theo tính toán Peng (năm 1999), đến năm 2030 sản lượng lúa giới phải đạt 800 triệu đáp ứng nhu cầu lương thực người. Để đạt suất cao, bên cạnh việc cải tiến tạo giống lúa có phẩm chất tốt, khả chống chịu cao, phân bón xem nhân tố quan trọng để định suất chất lượng nông sản. Tuy nhiên, việc lạm dụng phân bón hóa học gây nhiều tác động xấu đến môi trường, đặc biệt gây ngộ độc cho người động vật khác. Vì vậy, ứng dụng phân bón vi sinh vào sản xuất nông nghiệp giải pháp tối ưu nhằm giảm chi phí đầu tư, tăng suất, khắc phục hạn chế phân bón hóa học, đồng thời góp phần phát triển nông nghiệp sinh thái theo hướng bền vững. Hiện nay, việc nghiên cứu khả cố định đạm hòa tan lân vi khuẩn nội sinh hạn chế. Vì vậy, đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN LÂN CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN GIỐNG LÚA ML213 TRỒNG TRONG DUNG DỊCH KHOÁNG” thực hiện. 1.2. Mục tiêu đề tài Khảo sát khả cố định đạm, hòa tan lân khó tan vi khuẩn nội sinh lên giống lúa ML213 trồng dung dịch Yoshida (IRRI, 1976). Polymerase Chain Reaction Pmi phosphomannose isomerase PVP Polyvinyl pyrrolidone RAPD Random Amplified Polymorphic DNA SDS Sodium dodecyl sulphate SSR Simple Sequence Repeat Taq Thermus aquaticus TBE Tris Borate EDTA TE Tris EDTA Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học [...]... nhau, vi khuẩn nội sinh Gluconacetobacter diazotrophicus được xác định là có khả năng cố định đạm nhờ vào gen nif (Muthukumarasamy et al., 2005) Ở Vi t Nam, vi c nghiên cứu các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp kích thích tố IAA ở các cây nông nghiệp đã được tiến hành khá nhiều những năm gần đây Đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong các loài cây ở Vi t Nam... Nhật, xác định được các vi khuẩn nội sinh Herbaspirillum có khả năng cố định đạm ở các loài lúa hoang (Elbelatagy et al., 2001) Tiến hành thí nghiệm chủng vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và giống Burkholderia vào cây lúa, kết quả các vi khuẩn có thể cố định đạm khoảng 19% tổng số đạm cần thiết cho cây (Verma et al., 2001) Ở Mỹ, nghiên cứu ở 4 loại cây trồng (bắp, lúa miến, đậu tương và lúa mì) và 27... agglomerans là vi khuẩn nội sinh quan trọng trong cây lúa mì và cũng được phân lập từ thân của khoai tây, hạt lúa, lá của các cây thuộc họ cam quýt Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của Pantoea sp có khả năng tạo nên sự kích kháng và chống các vi sinh vật gây bệnh cho cây Thêm vào đó, vi khuẩn Pantoea sp có thể kích thích sự sinh trưởng bằng cách cố định đạm, hòa tan lân và tạo ra các kích thích... 2010) Các vi khuẩn này hòa tan lân theo hai cơ chế:  Hòa tan lân vô cơ: Theo Yahya và Azawi (1989) nhận thấy những vi khuẩn hòa tan được lân là nhờ các enzyme và các acid hữu cơ (acid gluconic, acid oxalic, acid citric, acid monolic và acid 2-ketogluconic) có khả năng hòa tan 14 Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 các hợp chất khó tan Tuy nhiên, các vi khuẩn này... nhờ vào sự đa dạng vi sinh vật cao nên vùng rễ là nguồn quan trọng của vi khuẩn nội sinh (Hillel and Elsevier, 2005) 2.3.2 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật a) Sự di chuyển (Movement) Vi khuẩn nội sinh di chuyển từ môi trường bên ngoài đến cây chủ bằng cơ chế hóa hướng động (chemotaxix) hay ngẫu nhiên hoặc cả hai cơ chế Rễ cây tiết ra bên ngoài một số dưỡng chất để vi khuẩn nội sinh tìm đến và. .. ra, dòng Burkholderia phymatum có khả năng tổng hợp IAA (Vandamme et al., 2002) d) Vi khuẩn Enterobacter Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm γ– Proteobacteria, hầu hết là vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc Một số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng cố định đạm, là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật Hwangbo et al... nội sinh 2.3.1 Nguồn gốc Vi khuẩn nội sinh (Endophytic bacteria) là những vi khuẩn cộng sinh bên trong mô thực vật và không gây ra triệu chứng bệnh cho cây Qua những kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh từ thân, lá, hạt, rễ của thực vật, Mano và Morisaki (2008) cho rằng nguồn gốc của vi khuẩn nội sinh phải là đất vùng rễ (soil rhizosphere) Các vi khuẩn thường hiện diện trong vùng rễ thuộc nhiều chi khác... cộng sinh ở rễ bắp trồng ở Châu Âu, rễ lúa và đậu trồng ở Úc (Balandereau et al., 2001) giúp cây phát triển nhanh tăng năng suất (Chiarini et al., 1998) tăng khả năng kháng bệnh, giảm lượng thuốc trừ sâu sử dụng (Daubaras et al., 1996) Người ta tiến hành thí nghiệm chủng vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và giống Burkholderia vào cây lúa, kết quả các vi khuẩn có thể cố định đạm khoảng 19% tổng số đạm. .. cà phê, lúa (Scarpella, 2003) Người ta tìm thấy được khoảng 30 loài Burkholderia (Coenye và Vadnamme, 2003) bao gồm vi khuẩn cố định đạm trong đất, đẩy mạnh các giai đoạn phát triển của cây, gây bệnh ở người và cây trồng (Tipper và Meegan, 1998) Vi khuẩn Burkholderia còn được tìm thấy ở khóm, chuối (Weber và ctv., 1999) Loài Burkholderia vietnamiensis tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Vi t Nam... phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất – Vi n nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ 3.2 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu Giống lúa ML213 tại tỉnh Phú Yên Mười dòng vi khuẩn do ThS Văn Thị Phương Như, Vi n nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Đại Học Cần Thơ phân lập, lưu trữ và cung cấp Bảng 2 Tên khoa học của 10 dòng vi khuẩn Ký hiệu Tên khoa học của vi khuẩn (tương . 3.2.2. Thiết bị 24 3.2.3. Dụng cụ 26 3.2.4. Hóa chất 27 3.3. Phương pháp nghiên cứu 29 3.3.1. Chuẩn bị mẫu 29 3.3.2. Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan của 10 dòng. Hình 12. pH kế 25 Hình 13. Micropipette 26 Hình 14. Hạt lúa giống có và không chủng vi khuẩn 29 Hình 15. Hiệu quả hòa tan lân khó tan của vi khuẩn lên chiều cao thân lúa giai đoạn 14 ngày